본 연구는 혁신 분야에서 과학 연구 보조금에 의해 지원되었다 &quot;중시 Neurocircuitry&quot;(제 22115002) 교육, 문화, 스포츠, 과학 기술부의 &quot;포괄적 인 뇌 과학 네트워크&quot;(제 221S0003) 기술에 일본과 그랜트 - 원조 일본 학술 진흥회의 젊은 과학자 (B) (제 21700344) (JSPS)로 HK

1. 애벌레 준비 <ol><li> 표준 비행 음식을 포함하는 플라스틱 병에 UAS-ChR2 또는 OK6-GAL4, UAS - NpHR2, OK6-GAL4 라인 비행을 유지합니다. </li><li> 확산 효모 적절한 농도 (ChR2 1 밀리미터, 사과 주스 한천 플레이트에 NpHR2 (줄여서 &quot;NpHR&quot;)에 대한 10 MM에서 (ATR) 모든 트랜스 망막을 포함한 붙여 넣습니다. </li><li> 유리 병에서 2 차 또는 3 차 instar의 유충을 선택하고 ATR 함유 접시에 넣어. </li><li> 25 키우는 적절한 시간 동안 어둠 속에서 ° C (NpHR에 대한 ChR2 2 일 1 하루입니다.) </li></ol> 2. 현미경 설정 <ol><li> C-마운트 부착 (배율 0.35x)와 기존의 공 초점 현미경 (우리의 경우, FV1000 올림푸스)에 CCD 카메라 (XCD-V60, 소니)를 연결합니다. </li><li> 대물 렌즈의 레이저 스캔 중에 닫 CCD 카메라에 빛의 경로를 따라 셔터가 있으면 조심스럽게 제거합니다. 이 단계는 마이크로에 달려필요한 경우 설치에 대응, 기술 지원 현미경 제조업체에 문의하십시오. </li></ol> 3. 해부 <ol><li> 몸에서 남아있는 음식을 제거하기 위해 물 ATR 자란 유충을 씻어. </li><li> 실 가드 코팅 접시, 등쪽까지 (지느러미 쪽, 등쪽 정중선의 양쪽을 세로 방향으로 실행하는 두 기관 튜브가)에 유충을 넣어. 실 가드의 두께는 5mm 정도이다. </li><li> 집게 (5 이녹스, 뒤몽 FST, 스위스)와 기관 튜브 사이의 꼬리에 곤충 핀 (리츠 곤충 핀, Φ0.10mm, 스테인리스)를 삽입합니다. 핀, 10mm 길이에 대해, 굽거나 대물 렌즈의 표면을 타격하고 손상을 방지하기 위해 (~ 2mm 길이)만큼 짧게 절단해야합니다. 그런 다음 입으로 훅, 앞쪽 끝에 검은 발톱 같은 구조 근처 유충의 머리에 두 번째 곤충 핀을 넣어. </li><li> 칼슘 2 + 무료 생리 식염수 (염화나트륨 140 mm의, KCl을 2 개 mm, MgCl 2 6 mm의 HEPES-NaOH를 5 mM의 추가유충은 촉촉한 유지하는 자당 36 MM (pH7.1)). </li><li> 마이크로 가위 (MB-50-7 Napox, 일본)와 꼬리 근처에 작은 절개를합니다. </li><li> 절개에서 머리로 등쪽 정중선을 따라 길이 방향 절단을합니다. 복부 신경 코드 (VNC) 및 축삭 손상되지 않도록주의해야합니다. </li><li> 옆 머리에 작은 절개를합니다. </li><li> 해부 bodywall의 각 모서리에 4 개의 핀을 놓습니다. 몸 벽은 신체 벽의 분절 패턴을 시각화 할 수있을만큼 뻗어 있지만, 연동 운동을 방해하지 너무 많이해야합니다. </li><li> 뇌와 VNC를 제외하고 내부 장기를 제거하고 + 무료 생리 식염수 칼슘과 샘플을 씻어. </li><li> 몸을 벽에 곤충 핀의 위치와 방향을 변경하여 양측 대칭으로 복부 신경 코드의 방향을 조정합니다. 복부 신경 코드의 위치를​​ 수정하려면, 실 가드 아래로 연결 뇌와 입 사이의 조직을 통해 핀을 삽입합니다. </li> &lt;리&gt; 2 mm 인 버퍼를 교체 칼슘 2 + 링거 용액 (NaCl을 130 MM의 KCl을 5MM, MgCl 2 2mm의 염화칼슘 2 MM의 HEPES-NaOH를 5 개 mm, 자당 36 MM (pH7.3)). </li></ol> 4. 레이저 조명과 영상 <ol><li> 공 초점 현미경 배 건조 대물 렌즈 (UPlanSApo 배, NA 0.16, 올림푸스, 일본) 연결하고 무대에 유충 준비를 설정합니다. </li><li> 공 초점 현미경 복부 신경 코드를 찾습니다 빨간 레이저 (633nm 인)를 해부 준비의 전송 이미지를 얻을 수 있습니다. 이 스캔 각각 ChR2 또는 NpHR의 불필요한 자극을 유도하는 488nm 또는 559nm 레이저를 사용하지 않도록합니다. </li><li> 전송 된 이미지에 대한이자 (ROI)의 영역을 정의합니다. 확대 모드는 ROI의 자세한 결정에 유용 할 수 있습니다. </li><li> 488nm 또는 559nm 빛으로 조명하는 현미경의 필터 설정을 변경합니다. </li><li> 몸을 벽을 시각화 할로겐 램프의 준비를 조명. 목전자 준비는 공 촛점 현미경에 부착 된 CCD 카메라로 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 몸을 벽의 움직임을 기록하고 움직임을 모니터링 상태에서 레이저 빔을 전환 끄십​​시오. </li></ol>

<ol>
	<li>Cattaert, D., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+the+central+generator+of+locomotor+rhythm+by+noncompetitive+NMDA+receptor+antagonists+in+Drosophila+larvae.">Blockade of the central generator of locomotor rhythm by noncompetitive NMDA receptor antagonists in Drosophila larvae.</a> J. Neurobiol. 48, 58-73 (2001).</li><li>Fox, L. E., Soll, D. R., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+and+modulation+of+locomotion+pattern+generators+in+Drosophila+larvae:+effects+of+altered+biogenic+amine+levels+by+the+tyramine+beta+hydroxlyase+mutation.">Coordination and modulation of locomotion pattern generators in Drosophila larvae: effects of altered biogenic amine levels by the tyramine beta hydroxlyase mutation.</a> J. Neurosci. 26, 1486-1498 (2006).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+TRP+channel+NompC+in+Drosophila+larval+and+adult+locomotion.">The role of the TRP channel NompC in Drosophila larval and adult locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Gomez-Marin, A., Louis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+sensation+during+orientation+behavior+in+the+Drosophila+larva:+more+sense+than.">Active sensation during orientation behavior in the Drosophila larva: more sense than.</a> Curr. Opin. 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Neurosci. 28, 533-563 (2005).</li><li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps.">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li><li>Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. 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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

신경 활동의 시간적, 지역 섭동은 신경 회로의 네트워크 역학 분석을위한 귀중한 기술이다. 이 프로토콜에서는, 우리는 레이저를 이용하여 optogenetics하여 신경 활동을 조작하는 방법을 제시한다. 레이저의 높은 방향성 수은 또는 크세논 램프를 사용하여 넓은 시야의 자극보다 더 지역화 optogenetic 자극 할 수 있습니다. 레이저 조명은 이미 이전의 연구에서 optogenetics에 적용되어 있지만, 같은 유리 섬유, micromanipulator에, 레이저 소스와 같은 특별한 설정은 대부분의 이전 연구에 필요합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 지역의 조명에 종래의 공 촛점 현미경을 사용합니다. 공 촛점 현미경 시스템이 널리 사용되기 때문에,이 방법은 많은 실험실에서보다 높은 해상도 optogenetics을 적용 할 수있는 기회가 열립니다. 유충의 해부 및 레이저 힘 : 프로토콜은 두 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 뇌, 복부 신경 코드 또는 운동 신경 운영 시간에만 손상을 입히는 경우NG 해부, 유충이 덜 전시 또는 없음 자연스러운 연동 운동합니다. 정밀 스프링 가위 등의 측면에 절개를 만들고 집게와 내부 장기를 제거 할 때 특히 필수적이다. 해부에 대한 자세한 정보는 이전에 21보고되었습니다. 둘째, 만약 충분한 자극에 대한 0.1의 레이저 파워 ~ ChR2 또는 1 NpHR을위한 ~ 10 mW의 / mm 2가 필요합니다 1 mW의 / mm 2 달성 할 수있다. 우리는 조명의 예상 면적으로 나눈 대물 렌즈 아래에 총 빛의 힘으로 레이저 파워를 평가했다. 우리는 파워 미터 (mobiken, 산와 MI 테크노스, 일본)를 사용하여 전체 광 전력을 측정했다. 우리는 원형 일정한 시간 약 회절 한계에 조명 영역을 제공하는 레이저의 파장의 제곱 조명의 영역을 추정 하였다. 샘플에 효과적인 조명 전력은 스캔 속도와 감각을 변경하여도 레이저 출력의 힘에 의해뿐만 아니라 조정 할 수 있지만,반복 어. 우리는 63 시간을위한 20 ~ 100 마이크로 초 / 픽셀로 레이저를 검색합니다. 또한, optogenetics 단백질과 ATR의 양의 발현 수준은 자극 효율성을 위해 중요하다. 레이저 파워 (현미경 시스템을 최적화하여), 2) optogenetics 단백질의 발현 수준 (유전자형과 양육 온도를 확인하여), 3) 금액은 1) : 유충이 더 optogenetic 반응을 보였다 없을 경우 따라서, 다음 사항을 점검하고 수정해야합니다 ATR (ATR의 농도를 조정하고 기간을 공급하여). NpHR 13 알 수없는 이유에 의하여 ChR2보다 ATR의 높은 농도를 필요로합니다. ChR2는 여기에 설명 된 것보다 낮은 ATR (예를 들어 0.1 MM) (1 ㎜)를 포함하는 음식을 사육 유충에서 잘 작동합니다. 1 ㎜의 ATR에 유충을 먹이는 ChR2 사진 반응을 만들기위한 충분로서, 우리는 ChR2 실험의 첫 번째 재판이 농도를 권장합니다. ATR의 농도는 이후 1 ㎜에서 아래로 적정 할 수 있습니다. ATR에 대한 노출 기간에 관해서는, 우리는 추천기간은 강력한 optogenetic 제어를 위해 여기에 설명. 우리는 종종 짧은 기간 동안 ATR에 유충을 먹이 때 optogenetic 반응을 관찰하는 데 실패했습니다. 이 프로토콜에서는, 레이저 조명 및 이미지 수집은 별도의 컴퓨터에 의해 운영됩니다. 그래서, CCD 카메라로 레이저 조명의 시공간적 패턴의 명확한 탐지 데이터 분석을위한 중요합니다. 레이저 반점이나 줄이 CCD 이미지의 희미한 경우, 할로겐 램프 및 신체 벽에 볼을 유지하면서 레이저 조명을 시각화하는 CCD 카메라의 게인 값의 파워를 최적화합니다. 이 프로토콜에서와 같이 시공간 조명 애벌레 모터 회로에 대한 정보를 제공하지만, 방법은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 에 관해서는 &quot;공간&quot;부분, 조명의 위치는 몸을 벽의 움직임을 비디오 테이프에 사용되는 낮은 배율 CCD 이미지가 기록됩니다. 따라서, 조명 영역은 세포 수준에서 세그먼트 레벨에서 할당하지만 할 수 있습니다. &quot;T에 관해서레이저로 공 초점 현미경 조명에 의해 레이저 스캔에 전환 사이 emporal &quot;측면, 시간 지연은 공 촛점 현미경 시스템 및 스캔 상태에 따라 달라집니다. 따라서, 시행 착오에 의해 약간의 테스트가 조명 시간을 조절해야합니다. 조명의 타이밍이 할 수 있기 때문에, ImageJ에 같은 적절한 소프트웨어를 사용하여 CCD 이미지 영화에서 결정, 시간적 해상도에서 중요한 요소는 CCD 카메라 영상의 프레임 속도입니다. 우리는 일반적으로 초당 7.5-15 프레임에 대한 프레임 속도를 설정합니다. optogenetic 도구의 발전은 우리에게이 프로토콜을 수정할 수있는 기회를 제공합니다. 우리는 제 3 령기 OK6-GAL4을 가진 애벌레와 UAS-ChR2 [H134R] 또는 UAS-NpHR2를 사용했습니다. 대신 ChR2의 다른 optogenetic 도구 [H134R] 또는 NpHR2 같은 ChR2로 [T159C/E123T] NpHR3 또는 아치 활동 제어 (22)의 효율을 높일 수 있습니다. 또한, 다른 GAL4 라인을 사용하거나 다른 발달 단계에서 분석하면 모터 circui에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다TS. 이 프로토콜에서는, 모터 활동은 CCD 카메라로 bodywall 수축의 전송 이미지에 의해 측정 하였다. ChR2 또는 NpHR과 신경 활동을 조작하면서 칼슘에 민감한 형광 분자 (예를 들면 GCaMP)와 모터 뉴런의 활동을 직접 모니터 할 수 있습니다. 이 경우, 광범위한 지역과 고감도 CCD 카메라 (예 : EMCCD 카메라)의 푸른 빛 조명은 할로겐 램프 대신에 사용하고 일반 CCD 카메라는 이전에 여기에 설명되어 있습니다. 낮은 배율 렌즈 샘플 및 모니터링 bodywall 위의 높은 배율의 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)에 의해 복부 신경 코드의 조명 : 추가 대물 렌즈를 사용하여 모니터링 bodywall 운동은 더 진보 된 방법이 될 수 있지만 자극의 공간 분해능을 향상시키기 위해 (예 : 4 개) 샘플 아래에. 이 듀얼 렌즈 시스템은 우리가 높은 공간 해상도 신경계를 자극 할 수 있습니다.

초파리 유충에서 앞으로 연동 운동은 전방 세그먼트 후방에서 근육 수축의 전파에 의해 발생합니다. 이 운동은 세로 몸 축을 따라 복부 신경 코드 내에서 모터 뉴런의 연속 활성화에 의해 실현됩니다. 이 패턴 전파 활동 뒤에 회로를 검사하려면, 신경 활동 지역의 섭동은 정보 접근 방법이 될 수 있습니다. 약물 분석은 신경 조직에서 신경 전달 물질과 같은 특정 물질을 제어 할 수 있지만 유충의 복부 신경 코드가 세로 축을 따라 유사한 neuromeres로 구성된 반복적 인 구조이므로, 약물 약물의 효과는 거의 모든 세그먼트 사이에서 유사 할 수 있습니다. 또한, 하나의 세그먼트 소수 optogenetic 또는 온도에 민감한 프로브 분자를 표현할 수 있습니다. 그러나, 특정 GAL4 라인을 생성하기가 매우 어렵습니다. 여기에서 우리는 몇 가지 세그먼트에서 뉴런을 조작하기위한 방법을 제시레이저 조명을 사용하여 사항. 공 초점 현미경 공간적으로 국한 조명의 장점 복용 한 지역에서 뉴런의 활동을 교란 할 수 있습니다. 뉴런 특정 GAL4 라인의 하위 집합으로 프로브의 발현 패턴과 결합,이 레이저 조명 방식은 크게 교란에 대한 공간 해상도를 향상시킵니다. 이 방법은 기존의 공 초점 현미경을 필요로하기 때문에, 추가 실험실 장비의 구입은 일반적으로 필요하지 않습니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 모터 출력 13 전파하는 동안 모터 신경 세포 활동의 역할을 하였다. 연동 운동하는 동안 몇 가지 부분에서 모터 뉴런의 활동을 차단하여, 우리는 모터 신경 자체의 활동이 모터 출력 신호의 전파해야하는지 여부를 테스트 할 수 있었다. 모터 뉴런의 지역 및 과도 봉쇄 연동 운동의 전파를 체포. 봉쇄가 제거 된 후, 프로pagation는 파도가 체포되었다 세그먼트에 나타났다. 이 현상은 모터 신경 세포의 활성화없이 propagative 파가 더 복부 신경 코드를 따라 진행 할 수없는 제안, 따라서 모터 뉴런의 활성화는 연동 운동이 필요합니다. 우리는 이전이나 다 등. (2011) 13 자세한 데이터와이 현상에 대해 토론을보고했다. 여기, 우리는 해부 애벌레의 움직임을 모니터링하면서 대화식으로 신경 활동을 교란하는 방법을 설명합니다. 다양한 GAL4 라인과 활동 조작을위한 시공간 패턴의 시리즈를 사용, 하나는 모터 회로의 교란 응답 속성을 통해 회로 논리를 조사 할 수 있습니다.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name</td>
 <td>Company</td>
 <td >Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BX61WI Microscope</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>BX61WI</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluoview FV1000 confocal system</td>
 <td>Olympus Corporation</td>
 <td>FV1000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CCD camera</td>
 <td>Sony</td>
 <td>XCD-V60</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>all-trans retinal</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>R2500-500MG</td>
 <td>200 mM stock in 95% EtOH</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silpot184</td>
 <td>Dow Corning Toray</td>
 <td>3255981</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

optogenetic perturbation of neural activity with laser illumination in semi-intact drosophila larvae in motion

초파리 유충의 운동력이 1-6 회로의 기본 연결을 구성 요소의 유전 접근의 미덕에 의해 개발 및 생리적 신경 과학의 훌륭한 모델 시스템입니다. 애벌레 신경 회로의 optogenetics 7,8의 응용 프로그램은 우리가 공간적 패턴 방법 9-13에 신경 활동을 조작 할 수 있습니다. 일반적으로 표본을 광범위 수은 램프 조명 LED를하는 경우, 대상 뉴런 너무 특이성 등 GAL4-UAS 시스템 14,15 같은 이진 유전자 발현 시스템에 의해 제어됩니다. 이 작품에서 &quot;하위 유전 해결 방법&quot;에 대한 공간 분해능을 향상시키기 위해, 우리는 로컬로 기존의 공 초점 현미경에 구현 된 레이저를 사용하여 복부 신경 코드의 뉴런의 하위 집합을 조명. 반 그대로 유충의 몸을 벽의 움직임을 모니터링하면서, 우리는 대화 형으로 활성화 또는 channelrhodopsin 16,17 O와 신경 활동을 억제각각 R halorhodopsin 18-20. 신경 조직의 공간적 및 시간적으로 제한된 조명함으로써, 우리는 행동의 특정 단계에서 회로의 특정 뉴런의 활동을 조작 할 수 있습니다. 이 방법은 복부 신경 코드를 로컬 신경 조립 및 모터 출력의 시공간적 패턴의 활동 사이의 관계를 연구하는 데 유용합니다.

<html> ChR2와 모터 뉴런의 지역 및 과도 활성화. 우리는 모터 뉴런에 ChR2을 표명했다. 각 VNC 세그먼트 프로젝트에서 몸을 벽의 해당 세그먼트에 새로운 모터 뉴런의 축삭. 우리는 블루 레이저로 VNC 중 하나 또는 두 개의 세그먼트를 자극하면 해당 세그먼트의 근육이 수축 (그림 1) 전시. NpHR와 모터 뉴런의 지역 및 과도 억제. 우리는 모터 뉴런 NpHR을 표명했다. 우리는 연동 근육의 수축하는 동안 노란색 레이저 VNC의 몇 가지 (1 ~ 2) 세그먼트를 자극 할 때, 전파 전파은 신체 벽의 해당 부분 (그림 2)에서 체포되었다. 우리는 레이저 조명 13 꺼질 때 다음 파도가 체포 세그먼트에서 다시 시작됩니다. 50513fig1.jpg &quot;고도 =&quot;그림 1 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot;5.5in &quot;FO : SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50513/50513fig1highres.jpg &quot;/&gt; 그림 1. ChR2와 모터 뉴런의 지역의 활성화. 필렛 준비의 지역 활성화 A. 체계. 모터 뉴런에 ChR2을 표현 복부 신경 코드의 몇 부분의 푸른 빛 조명으로, 해당 분야에서 근육 (화살표 머리) 계약을 체결하고 있습니다. 해부 유충의 B. 전송 이미지. 복부 신경 코드 지역의 조명 (화살표 머리) 체벽의 근육 (화살표)의 분절 수축을 유도합니다. <img src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2.jpg" alt="그림 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50513/50513fig2highres.jpg"/> 그림 2. 필렛 준비의 로컬 억제 NpHR. A. 제도와 모터 뉴런의 지방 억제. 노랑 L 님모터 뉴런, 자발적-발생한 연동 운동 (상단에 화살표 머리) 동안 근육 수축 완화에 NpHR을 표현 복부 신경 코드의 몇 가지 세그먼트의 광명 조명 해부 유충 (바닥에 화살표 머리). B. 변속기 이미지 . 복부 신경 코드 (화살표 머리) 지역의 조명 자발적으로 계약 한 몸 벽 세그먼트 (화살표) 완화.

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Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명<em&gt; 초파리</em&gt; 기존의 공 초점 현미경 내에서 레이저를 사용하여 유충. 이 기술은 모터 회로의 역학을 설명하기 위해 몇 neuromeres의 신경 활동 지역의 섭동을 달성하기 위해 연구자 수 있습니다.

세미 그대로의 레이저 조명과 신경 활동의 Optogenetic 섭동<em&gt; 초파리</em모션&gt; 유충

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

11.5K 조회수.  The University of Tokyo. 준 그대로의 모터 출력의 변화 (근육 수축) 모니터링하면서 여기에 우리가 motoneuronal 활동 optogenetic 조작에 대한 프로토콜을 설명 초파리 기존의 공 초점 현미경 내에서 레이저를 사용하여 유충. 이 기술은 모터 회로의 역학을 설명하기 위해 몇 neuromeres의 신경 활동 지역의 섭동을 달성하기 위해 연구자 수 있습니다.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C로 생체내 레이저 Axotomy에서 엘레간스

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

연구

신경과학

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.
The Drosophila larva is an established model system to study thermal nociception, a sensory response to potentially harmful temperatures that is evolutionarily conserved across species1,2. The advantages of Drosophila for such studies are the relative simplicity of its nervous system and the sophistication of the genetic techniques that can be used to dissect the molecular basis of the underlying biology4-6 In Drosophila, as in all metazoans, the response to noxious thermal stimuli generally involves a "nocifensive" aversive withdrawal to the presented stimulus7. Such stimuli are detected through free nerve endings or nociceptors and the amplitude of the organismal response depends on the number of nociceptors receiving the noxious stimulus8. In Drosophila, it is the class IV dendritic arborization sensory neurons that detect noxious thermal and mechanical stimuli9 in addition to their recently discovered role as photoreceptors10. These neurons, which have been very well studied at the developmental level, arborize over the barrier epidermal sheet and make contacts with nearly all epidermal cells11,12. The single axon of each class IV neuron projects into the ventral nerve cord of the central nervous system11 where they may connect to second-order neurons that project to the brain.
Under baseline conditions, nociceptive sensory neurons will not fire until a relatively high threshold is reached. The assays described here allow the investigator to quantify baseline behavioral responses or, presumably, the sensitization that ensues following tissue damage. Each assay provokes distinct but related locomotory behavioral responses to noxious thermal stimuli and permits the researcher to visualize and quantify various aspects of thermal nociception in Drosophila larvae. The assays can be applied to larvae of desired genotypes or to larvae raised under different environmental conditions that might impact nociception. Since thermal nociception is conserved across species, the findings gleaned from genetic dissection in Drosophila will likely inform our understanding of thermal nociception in other species, including vertebrates.

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of thermal nociceptors1,2 while the second involves a wholesale (global) activation of most or all such neurons3. Together, these techniques allow visualization and quantification of the behavioral functions of Drosophila nociceptive sensory neurons.

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In this article, we demonstrate assays to study thermal nociception in Drosophila larvae. One assay involves spatially-restricted (local) stimulation of ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

의 Proprioceptors의 시각화<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레와 Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

에 Appetitive 연관 강한 학습<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

의 이스케이프 문제의 Optogenetic의 자극<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory machinery, such as in patients experiencing peripheral neuropathy or injury-induced sensitization, are not well characterized. The genetically tractable Drosophila model has been used to study the cells and genes required for noxious heat detection, which has yielded multiple conserved genes of interest. Little is known however about the cells and receptors important for noxious cold sensing. Although, Drosophila does not survive prolonged exposure to cold temperatures (&#8804;10 &#186;C), and will avoid cool, preferring warmer temperatures in behavioral preference assays, how they sense and possibly avoid noxious cold stimuli has only recently been investigated.
Here we describe and characterize the first noxious cold (&#8804;10 &#186;C) behavioral assay in Drosophila. Using this tool and assay, we show an investigator how to qualitatively and quantitatively assess cold nociceptive behaviors. This can be done under normal/healthy culture conditions, or presumably in the context of disease, injury or sensitization. Further, this assay can be applied to larvae selected for desired genotypes, which might impact thermosensation, pain, or nociceptive sensitization. Given that pain is a highly conserved process, using this assay to further study&#160;thermal nociception will likely glean important understanding of pain processes in other species, including vertebrates.

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Here we demonstrate a novel assay to study cold nociception in Drosophila larvae. This assay utilizes a custom-built Peltier probe capable of applying a focal noxious cold stimulus and results in quantifiable cold-specific behaviors. This technique will allow further cellular and molecular dissection of cold nociception.

콜드 통각에 대한 소설 분석<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.