이 프로토콜은 빛을 사용하여 심장 기능을 특성화하고 제어할 수 있는 초파리 모델을 제시합니다. 이를 통해 연구자들은 손상되지 않은 동물을 사용하여 초파리에서 인간의 심장 질환을 연구 할 수 있습니다. 이 방법은 초파리 심장 기능의 비침습적 OCT 영상 및 광유전학적 제어를 안정적으로 달성할 수 있습니다.
그것은 높은 효율성과 품질을 가지고 있습니다. 광유전학적 페이싱은 잠재적으로 부정맥 장애를 치료하기 위한 요법으로서 전기적 페이싱의 대안이 될 수 있습니다. OCT 이미징 및 광유전학적 페이싱은 심장 오가노이드, 얼룩말 물고기, 배아 인후 및 심장과 같은 다른 모델 시스템으로 확장할 수 있습니다.
시작하려면 바이알당 TM6 이중 통통한 처녀 암컷 위에 5개의 손 GAL4와 UAS Ops 및 Stocks의 수컷 파리 2-3마리를 결합합니다. 다음날, 블루밍턴 초파리 주식 센터의 지시에 따라 핫 플레이트의 용기에 자당 100ml당 5.14g을 추가하여 반정의 식품을 준비합니다. 그런 다음 일정하게 저어 주면서 섭씨 60도까지 식히십시오.
다음으로, 각 바이알에 50 마이크로 리터의 100 밀리몰 올 트랜스 망막 에탄올 용액을 추가하여 좁은 플라이 바이알을 준비하십시오. 혈청 학적 피펫을 사용하여 좁은 파리 사악한 당 5 밀리리터의 파리 음식을 처분하십시오. 최대 속도로 10 초 동안 소용돌이 친 후이 바이알을 연결하고 어두운 천으로 싸서 빛으로부터 보호하십시오.
다음날, 파리가 꾸준히 알을 낳는 음식을 함유 한 모든 트랜스 망막 에탄올로 바이알에 옮깁니다. 바이알로 랙을 빛으로부터 보호하십시오. 24 시간에서 48 시간 후, 낳은 알의 수에 따라 바이알 인구 과잉을 방지하기 위해 부모를 버립니다.
다음으로, 심장 영상을 위해 통통하지 않은 자손을 수집하십시오. UAS 옵션 손 GAL4 유충 또는 번데기를 바이알에서 골라 티슈에 올려 놓고 페인팅 브러시를 사용하여 신체 표면에서 미디어를 부드럽게 닦아냅니다. 중간에 작은 양면 테이프로 현미경 슬라이드를 준비하십시오.
다음으로, 브러시 또는 미세한 핀셋을 사용하여 등쪽이 위로 향하고 슬라이드의 긴면에 수직이되도록 테이프 표면에 유충이나 번데기를 부드럽게 놓습니다. 유충이나 번데기를 테이프 표면에 부착하기 위해 부드러운 압력을 가하십시오. 이제 유충이나 번데기가 아래를 향하도록 이미징 스테이지에 슬라이드를 설치하고 레이저 제어 소프트웨어로 광학 간섭 단층 촬영 또는 OCT 광원을 켭니다.
사용자 지정 스펙트럼 도메인 OCT 제어 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 미리보기 창을 클릭합니다. 그런 다음 스펙트럼 도메인 OCT 소프트웨어에서 스캔 파라미터를 설정합니다.
마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 샘플 단계를 제어하여 플라이 하트에 초점을 맞춥니다. 플라이 큐티클 표면에서 반사되는 빛을 최소화하도록 초점 위치를 조정합니다. 또한 반사를 최소화하기 위해 유충이나 번데기 표면에 미네랄 오일을 바르는 것을 고려하십시오.
다음으로, M 모드 OCT 이미지 획득을 위한 스캔 파라미터를 설정하고 적색광 자극 펄스 없이 5세트의 제어 데이터를 수집하여 안정시 심박수를 계산합니다. 맞춤형 OCT 제어 소프트웨어에서 페이싱 자극을 위한 광 펄스를 설계합니다. 이를 위해 설정 탭을 클릭하고 설계된 광 펄스 시퀀스를 추가하여 다양한 자극 프로토콜에 따라 펄스 주파수, 펄스 폭, 자극 지속 시간 및 대기 시간을 제어합니다.
그런 다음 조명 컨트롤러 소프트웨어를 열어 빨간색 광 펄스를 생성합니다. 모드 선택에서 펄스 모드를 선택합니다. 펄스 프로파일 설정에 대한 그림을 두 번 클릭하고 팔로워 모드를 선택합니다.
오프 강도를 0으로 유지하고 실제 전력 밀도를 계산할 때 켜기 강도 백분율을 설정합니다. OCT Control 소프트웨어에서 획득을 클릭하여 가벼운 자극으로 뛰는 초파리 심장의 M 모드 비디오를 획득하십시오. 이미징 획득 중에 플라이 하트 아래로 빨간색 빛의 깜박임을 기록합니다.
적색 이동 채널로돕신 및 NPHR 비행 모델로 플라이 하트 기능을 제어하려면 다양한 페이싱 설정이 필요합니다. 사용자 정의 개발 된 플라이 하트 분할 소프트웨어를 열고 파일 선택을 클릭하십시오. 그런 다음 그래픽 사용자 인터페이스에서 분석할 파일을 선택합니다.
위쪽 텍스트 상자에 심장 영역의 수직 및 수평 경계를 픽셀 단위로 입력합니다. 크기 조정을 클릭합니다. 하단의 슬라이더를 사용하여 전체 심장 영역이 표시되고 전체 컬렉션의 전체 상자를 채우는지 확인합니다.
예측 탭을 클릭하면 프로그램이 컬렉션의 모든 조각을 살펴보고 약 3분 후에 심장 영역을 선택합니다. 예측이 완료되면 HR 플롯을 클릭하여 시간 경과에 따른 심장 영역의 플롯을 새 창에 표시합니다. 올바른 피크 또는 밸리 영역을 선택하고 펄스를 선택한 다음 HR 탭을 선택하여 최종 수치를 생성합니다.
기능 매개 변수는 CSV 파일에 동시에 저장됩니다. 손 GAL4 드라이버의 조직 특이성은 녹색 형광 단백질 발현을 이미징하여 검증하였다. 유충과 번데기 몸체 단면의 일반적인 OCT 이미지가 여기에 나와 있습니다.
다양한 심장 상태를 모방하기 위해 네 가지 유형의 광 펄스가 설계되었습니다. 5 초의 대기 시간 후에 10 초 동안 지속되는 단일 펄스는 회복 가능한 심장 마비를 일으켰습니다. 안정시 심박수보다 낮은 주파수에서 심장 페이싱의 경우, 안정시 심박수의 절반에 해당하는 페이싱 주파수를 갖는 두 개의 광 펄스 시퀀스와 안정시 심박수의 1/4이 8 초 동안 지속되고 그 사이에 6 초의 대기 시간이 사용되었습니다.
적색 이동 채널로돕신 활성화로 인한 심박수를 증가시키는 자극 패턴은 3개의 광 펄스 시퀀스로 구성되었다. 빛 신호에 따른 심장 수축 빈도가 감소하면 유충과 번데기를 모방하는 심박수가 느려졌습니다. 서로 다른 자극 주파수에서 일련의 3 개의 광 펄스 트레인이 유충에 적용되었으며 번데기 심장은 광 펄스에 따라 심박수가 증가한 것으로 나타났습니다.
올바른 자손의 준비 선택, 표본 장착 및 이미징 절차가 필수적입니다. 우리는 광유전학적 페이싱 기술을 더 큰 동물 모델로 이전하고, 포유류의 심장 질환을 연구하고, 부정맥을 치료하기 위한 새로운 치료법을 모색하기를 희망합니다.
