이 작품은, 생명 공학, 인도, DNA 지문 및 진단을위한 센터의 핵심 자금의 정부 부서의 혁신적인 젊은 Biotechnologist 상 BT/BI/12/040/2005 및 BT/PR13289/BRB/10/745/2009 보조금에 의해 지원되었다 하이 데 라 바드. MNR 및 GB는 주니어와 마니 팔 대학의 박사 학위의 추구를 향한 과학 산업 연구위원회의 선임 연구 장학금의 수혜자입니다. SB는 마니 팔 대학의 박사 학위를 추구으로 주니어 공학학과의 수석 연구 활동의받는 사람입니다.

그것은 C.를 수행하는 것이 좋습니다 글라 브라 감염 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2와 실험실 실험 (BSL-2). <ol><li> THP-1 대식 세포 단일 층의 제조. </li><li> C. 준비 글라 브라 세포 현탁액. </li><li> C.와 THP-1 대식 세포의 감염 글라 브라 셀. </li><li> 콜로니 형성 단위의 분석을 통해 식균 작용의 속도와 세포 내 복제의 측정. </li><li> 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 세포 내 복제의 모니터링. </li></ol> 1. THP-1 대식 세포 단일 층의 제조 <ol><li> THP-1은 급성 단핵구 백혈병 14 고통받는 1 살짜리 남자 아이의 말초 혈액에서 파생 된 인간의 단핵 세포 라인입니다. THP-1, 현탁 세포주, 일상적으로 10 % FBS (소 태아 혈청)으로 보충 된 RPMI-1640 배지에서 가습 된 5 % CO 2에서 37 ° C로 유지된다. 포르 12 myrista 치료TE 13 - 아세테이트 (PMA, 포르 볼 에스테르) 대 식세포로 THP-1 단핵 세포의 말단 분화 초래한다. 중요한 사실은, PMA 처리는 세포 생존에 영향을주지 않으며 분화 된 세포는 분열하지 않는다. </li><li> 종자 약 1.5 × 10의 100mm 배양 접시에있는 6 THP-1 단핵구 RPMI-1640 완전 배지 (RPMI-1640 배지 10 % 혈청, 2 MM의 글루타민과 1X 항생제로 보충, 10 ㎖ / 요리)와 세포가 37로 증가하자 2 일 동안 5 % CO 2에서 C를 °. </li><li> THP-1 세포를 13 × 105 세포 / ml의 밀도에 도달 세포 배양 층류 후드에 배양 접시를 전송하고 부드럽게 침전 세포를 재현 탁하도록 소용돌이했으면. </li><li> 세포 현탁액을 피펫, 4 분 동안 1,000 rpm으로 (130 XG)에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기에 배치합니다. 뜨는을 취소하고 5 ㎖ 신선한, 예비 가온, RPMI-1640 완전한 매체에 THP-1 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 혈구와 세포를 열거하고 CEL 희석10 6 세포 / ㎖로 데워진 RPMI-1640 완전한 매체의 최종 밀도 L 서스펜션 </li><li> (포르 볼 12 - 미리 스테이트 13 - 아세테이트 용액은 디메틸 설폭 사이드에서 제조) 10 ㎖ THP-1 세포 현탁액 (최종 농도 16 NM)에 160 mM의 PMA 주식 1 μl를 추가하고 잘 섞는다. 24 잘 조직 배양 플레이트의 각 웰에 1 ml의 세포 현탁액을 분배하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C로 유지 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 오래된 매체를 제거, 1 ml의 RPMI-1640 완전한 매체를 데워진 추가하고 세포가 5 % CO 2에서 37 ° C에서 12 시간 동안 복구 할 수 있습니다. </li><li> 현탁액이 타원형 모양의 THP-1 단핵구 세포가 평평 모양의 스핀들 및 식세포로 분화 졌음을 보장하기 위하여 거꾸로 현미경으로 세포를 관찰합니다. 이 분화 된 세포는 지금 C.을 수행 할 준비가 된 것입니다 글라 브라 감염 연구. </li></ol> 2. C. 준비 글라 브라 &amp; #(160), 세포 현탁액 C. 글라 브라 야생형 균주 BG2는 THP-1 대식 세포를 감염시키기 위해 사용된다. C. 글라 브라 셀 액체 YPD (효모 추출물 (1 %), 펩톤 (2 %), 덱 스트로스 (2 %)) 배지에서 일상적으로 배양 하였다. 단단한 YPD 배지는 배지 고압 증기 멸균 전에 2 %의 한천을 첨가함으로써 제조된다. <ol><li> C.의 문화를 준비하려면 글라 브라가, 멸균, 일회용 루프 한천 플레이트에서 하나의 식민지을 주워와 10 ㎖ YPD 액체 배지에 접종하고 30 ℃에서 (200 rpm)으로 진탕 14 ~ 16 시간 동안 배양 </li><li> 테이블 위에 마이크로 원심에서 5 분 4,000 RPM (1,800 XG)에서 원심 분리기이 문화 (1 ㎖), 멸균 PBS (인산염 완충 식염수, 산도 7.4)와 세 번 세포를 세척하고 1 ㎖의 PBS에 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> C.의 OD 600을 측정 글라 브라 세포 현탁액 및 2 × 106 세포 / ml의 밀도를 얻기 위해 멸균 PBS의 적절한 부피로 희석 (OD 600= 0.1). 대안 적으로, 원하는 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 효모 세포를 카운트함으로써 달성 될 수있다. </li></ol> 3. C.와 THP-1 식세포의 감염 글라 브라 셀 <ol><li> 50 μL의 C. 추가 THP-1 식세포 (10 6 세포를 24 웰 배양 플레이트의 웰 당 시드) 0.1의 MOI (감염의 다중성)를 얻어 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 부화에 글라 브라 세포 현탁액. </li><li> 가능한 효모 수를 결정하기 위해 50 μL C를 희석 글라 브라 세포 현탁액 멸균 PBS의 100 배와 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시. 30 ° C에서 접시를 품어 수동 1-2일 후 나타나는 효모 콜로니의 수를 계산합니다. 이 숫자는, 이제부터는, 0 시간의 C.로 언급 될 것이다 글라 브라 CFUs (콜로니 형성 단위). </li><li> C.와 THP-1 세포의 2 시간의 공동 배양 한 후 24 - 웰 조직 배양 플레이트를 반전시킴으로써 글라 브라 셀 폐기 배지 INA 저수지 및 nonphagocytosed 세포 C.를 제거하는 예비 가온 멸균 PBS로 가볍게 세 번 씻어 글라 브라 셀. PBS와 부드러운 세척은 THP-1 대식 세포 단일 층에 손상을 초래하지 않고 모든 세포 효모의 완전한 제거를 달성하기 위해 절대적으로 필수적이다. </li></ol> 4. 식민지가 단위 분석을 형성을 통해 식균 작용 속도 및 세포 내 복제의 측정 <ol><li> 를 Lyse C. 글라 브라 2 O 2 분 동안 잘로부터 대식 파편을 제거하고 마이크로 원심 분리 튜브에 세포 용 해물을 수집 가볍게 긁어 1 ㎖ 무균 H에서 THP-1 마크로파지를 감염. 전체 대식 세포 용해 현미경 검증은 모든 내면화 효모의 복구를 위해 필수적이다. </li><li> 멸균 PBS에 용해 액의 100 배 희석액을 준비 YPD 고체 배지에 100 μl를 접시 30 ° C에서 접시를 품어 </li><li> 1~2일 후, C.의 수를 수동으로 계산 글라 브라는 AP를 식민지YPD 매체에 peared는 희석 계수 (2 시간의 CFUs)에 거는와 C의 비율을 의미한다 식균 작용의 속도를 계산 다음과 같은 공식을 사용하여 2 시간의 coincubation 후 THP-1 식세포에 의해 섭취되는 글라 브라 셀. % 식균 작용은 = [(2 시간에서 CFUs) / (0 H에서 CFUs)] X 100 </li><li> C.의 세포 복제 속도를 측정하려면 THP-1 식세포에서 글라 브라 세포는 점은 감염의 예를 게시 다른 시간에 세포 내 효모를 수집합니다. 4, 6, 8, 10, 12, 24 시간, 3.3-4.3 단계를 반복함에 따라. </li><li> C.의 배 서바이벌 / 복제를 계산 2 시간 (포식 효모)에 그 어떤 주어진 시점에서 총 CFUs 나누어 THP-1 식세포에서 글라 브라 셀. </li></ol> 5. 공 초점 라스를 사용하여 세포 내 복제 모니터링어 스캐닝 현미경 <ol><li> 제 1 절에서 설명하는 단계에 따라 2 ~ 4 잘 챔버 슬라이드의 각 웰에있는 PMA 처리 된 5 × 5 THP-1 세포를 배정하고 12 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 데워진 RPMI-1640 완전 배지와 오래 된 매체를 교체하고 세포를 12 시간 동안 PMA 처리를 복구 할 수 있습니다. </li><li> GFP를 준비 (녹색 형광 단백질) C.에게 - 태그 글라 브라 세포 현탁액 2 항에서 기술과 1의 MOI에 THP-1 대식 세포에 감염으로. 만약 C. GFP를 표현하는 FITC (플루오 레세 인 이소 티오 시아 네이트)으로 표시 효모 세포는 초기 이벤트가 감염 즉 게시 모니터링하는 데 사용할 수있는 사용할 수없는 글라 브라는 변종. 식균 작용의 속도와 2 시간에 phagolysosomal 성숙. </li><li> , 5 % CO 2와 37 ° C에서 2 시간 동안 슬라이드를 품어 매체를 삭제하고 무균으로 배를 씻어 신중하게 반전, PBS는 데워진. </li><li> 500 μL는 RPMI-1640 완전한 메디 데워진 추가음 하나의 슬라이드의 각 실에 22 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 그것을 품어. </li><li> 2 시간의 C.를 해결하려면 글라 브라에 감염된 THP-1 식세포, 다른 슬라이드의 각 실에 (PBS에서 준비) 3.7 %의 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 어둠 속에서 20 분 동안 실온에서 그것을 품어. </li><li> 워시, PBS로 세 번 슬라이드 500 μL 트리톤-X (0.7 %)를 추가하고, 어둠 속에서 5 분 실온에서 알을 품다. </li><li> PBS로 세척 슬라이드 배는, 문화의 슬라이드에서 챔버를 제거하고 공기 어둠 속에서 3 ~ 5 분 동안 건조. </li><li> 정중 기포 형성을 회피 슬라이드 DAPI를 포함 Vectashield 장착 매체 (4 &#39;,6-diamidino-2-페닐 인돌)를 사용하여 커버 슬립을 장착. 부드럽게 킴 와이프로 물기를 제거하고 손톱 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. 4 ° C에서 사용할 때까지의 어둠에 보관 슬라이드. </li><li> 반복 THP-1 세포에게 24 시간 후 감염을 처리하기 위해 5.4 5.6-5.9 단계를 반복합니다. </li><li> 레이저 스캐닝 confo를 이용한 이미지 셀칼 현미경 (60X 기름 침지 목표, DAPI 및 GFP의 얼룩에 대한 405 nm의 및 488 nm에서 여기, 각각). </li></ol>

<ol>
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W., Azeredo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata,+Candida+parapsilosis+and+Candida+tropicalis:+biology,+epidemiology,+pathogenicity+and+antifungal+resistance.">Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance.</a> FEMS Microbiol. Rev. 36 (2), 288-305 (2012).</li><li>Kaur, R., Ma, B., Cormack, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+family+of+glycosylphosphatidylinositol-linked+aspartyl+proteases+is+required+for+virulence+of+Candida+glabrata.">A family of glycosylphosphatidylinositol-linked aspartyl proteases is required for virulence of Candida glabrata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+THP-1+Cells:+an+attractive+model+for+the+assessment+of+intracellular+growth+rates+of+Mycobacterium+tuberculosis+isolates.">Activated THP-1 Cells: an attractive model for the assessment of intracellular growth rates of Mycobacterium tuberculosis isolates.</a> Infect. Immun. 72 (2), 1169-1173 (2004).</li><li>Murayama, T., Ohara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Cytomegalovirus+induces+Interleukin-8+production+by+a+human+monocytic+cell+line,+THP-1,+through+acting+concurrently+on+AP-1-+and+NF-kB-binding+sites+of+the+Interleukin-8+gene.">Human Cytomegalovirus induces Interleukin-8 production by a human monocytic cell line, THP-1, through acting concurrently on AP-1- and NF-kB-binding sites of the Interleukin-8 gene.</a> J. Virol. 71 (7), 5692-5695 (1997).</li><li>Gross, O., Poeck, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syk+kinase+signalling+couples+to+the+Nlrp3+inflammasome+for+anti-fungal+host+defence.">Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence.</a> Nature. 459, 433-436 (2009).</li><li>Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+leukemia+cell+line,+THP-1:+a+multifacetted+model+for+the+study+of+monocyte-macrophage+differentiation.">The human leukemia cell line, THP-1: a multifacetted model for the study of monocyte-macrophage differentiation.</a> Experientia. 47 (1), 22-31 (1991).</li><li>Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+maturation+in+cultured+human+monocytic+leukemia+cells+by+a+phorbol+diester.">Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol diester.</a> Cancer Res. 42 (4), 1530-1536 (1982).</li><li>Casta&#241;o, I., Kaur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn7-based+genome-wide+random+insertional+mutagenesis+of+Candida+glabrata.">Tn7-based genome-wide random insertional mutagenesis of Candida glabrata.</a> Genome Res. 13 (5), 905-915 (2003).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

선천성 면역계는 편의적 진균 감염의 조절에 중요​​한 역할을한다. 대 식세포는 섭취와 곰팡이 병원균의 파괴에 의해 방어 항진균제에 기여한다. 따라서, 생존 및 / 또는 대 식세포의 항균 기능을 반작용에 필요한 요인의 해명은 곰팡이 독성 전략에 대한 우리의 이해를 진행합니다. 이러한 상황에서, 우리는 인간 편의적 진균 병원체 C.의 상호 작용을 특성화하기 위해 인간 단구 세포주 TH...

칸디다 종은 면역 저하 환자의 1에 생명을 위협하는 침습성 진균 감염의 주요 원인이다. 칸디다 글라 브라, 신흥 병원 내 병원체는 지리적 위치 1-3에 따라 중환자 실 환자에서 두 번째 또는 세 번째 가장 자주 고립 칸디다 종입니다. 계통 발생 학적으로, C. 글라 브라, 반수체 신진 효모, 더 밀접하게 비 병원성 모델 효모 사카로 병원성 칸디다 종보다 사카로 마이 세스 세레 비시에 관련되어 있습니다. C. 포함 알비 칸스 4. 이과 일치, C. 글라 브라는 짝짓기, 분비 단백질 분해 활성과 형태 학적 소성 4-5 등 일부 주요 곰팡이 독성 특성이 부족하다. 비록 C. 글라 브라는 균사를 형성하지 않는, 그것은 생존과 6-8는 고유 발병 메커니즘을 개발했다고 제안 쥐와 인간 대 식세포에 복제 할 수 있습니다. 제한된 정보는 전략에 대해 사용할 수 있는지 C. 글라 브라는 영양이 부족한 세포 대식 세포 환경을 생존과 산화 및 호스트 면역 세포 5 마운트 비산 화성 호스트의 응답을 방해하기 위하여 사용한다. 관련 식세포 모델 시스템은 C.의 상호 작용을 묘사하는 필수 조건이다 기능 유전체 및 단백체 접근 방식을 통해 호스트 식세포 세포와 글라 브라. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를) 및 인간 및 뮤린 기원의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)는 각각 이전 C.의 상호 작용을 연구하는데 사용되어왔다 숙주 면역 세포 7,9와 글라 브라. 그러나, PBMC를하고 BMDMs를 얻기 어려움, 제한된 수명과 다른 포유 동물의 기증자들 본질적인 변화는 이러한 세포의 활용으로 다양한 모델의 시스템을 제한합니다. 여기에서, 우리는 intracellul을 연구하는 생체 시스템의 구축 방법을 설명합니다C. 아칸소 동작 인간 단핵구 세포주 THP-1에서 파생 된 대 식세포에서 글라 브라 셀. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 쉽게 호스트 곰팡이 병원균 상호 작용의 다양한 측면을 연구하기 위해 조작 할 수있는 간단하고 저렴한, 빠르고, 재생 가능한 세포 배양 모델 시스템을 제정했다. THP-1 세포는 이전에 박테리아, 바이러스, 진균 등 10-12 병원균의 광범위한 대 숙주 면역 반응을 해독하는데 사용되어왔다. 단핵구 THP-1 세포는 유지 관리가 용이하고 인간의 단핵구 유래 대 식세포를 모방하고 적절한 대식 세포 마커 (13)를 표현하는 대 식세포에, 포르 볼 에스테르 처리에 따라 차별화 할 수 있습니다. THP-1 대식 모델 시스템의 주요 이점은 사용의 용이성 및 정교한 장비의 요구 사항의 부족이다. 여기에 제시된 프로토콜은 HOS 다른 사람의 곰팡이 병원균의 상호 작용을 연구하기 쉽게 적응할 수있다면역 세포를 톤. 현재의 절차는 또한 고 스루풋 돌연변이 스크린을 사용하여 관심의 병원체에 대한 독성 요소를 식별하기 위해 사용될 수있다. 이 증명의 개념은 인간 대 식세포에서 8 C. 글라 브라의 생존에 필요한 유전자 (56)의 집합을 식별하는 THP-1 배양 모델 시스템의 성공적인 사용에 의해 예시되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:40px;width:163px;">THP-1</td>
			<td style="width:105px;">American Type Culture Collection</td>
			<td style="width:85px;">TIB 202</td>
			<td style="width:243px;">Human acute monocytic leukemia cell line</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">RPMI-1640</td>
			<td style="width:105px;">Hyclone</td>
			<td style="width:85px;">SH30096.01</td>
			<td style="width:243px;">For maintaining THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">P 8139</td>
			<td style="width:243px;">Caution: Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">YPD&#160;</td>
			<td style="width:105px;">BD-Difco</td>
			<td style="width:85px;">242710</td>
			<td style="width:243px;">For growing Candida glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:105px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:85px;">F8775</td>
			<td style="width:243px;">For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl,&#160; pH 7.4) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Saline-sodium citrate (SSC)&#160;</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Prehybridization buffer</td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">Buffer (50% formamide, 5x Denhardt&#8217;s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">VECTASHIELD mounting medium</td>
			<td style="width:105px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:85px;">H-1200</td>
			<td style="width:243px;">For mounting slides for confocal microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">32P-labeled &#945;-dCTP</td>
			<td style="width:105px;">JONAKI-BARC</td>
			<td style="width:85px;">LCP-102</td>
			<td style="width:243px;">For radiolabeling of signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">100 mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">430167</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">24-well tissue culture plate</td>
			<td style="width:105px;">Corning</td>
			<td style="width:85px;">3527</td>
			<td style="width:243px;">To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">4-chamber tissue culture-treated glass slide</td>
			<td style="width:105px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:85px;">REF354104</td>
			<td style="width:243px;">To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:105px;">Rohem India</td>
			<td style="width:85px;"></td>
			<td style="width:243px;">For enumeration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Table top microcentrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:85px;">Microfuge 18</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in microtubes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Table top centrifuge</td>
			<td style="width:105px;">Remi</td>
			<td style="width:85px;">R-8C</td>
			<td style="width:243px;">For spinning down cells in 15 ml tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:105px;">Amersham Biosciences</td>
			<td style="width:85px;">Ultraspec 10</td>
			<td style="width:243px;">To monitor absorbance of yeast cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Plate incubator</td>
			<td style="width:105px;">Labtech</td>
			<td style="width:85px;">Refrigerated</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:105px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:85px;">Innova 43</td>
			<td style="width:243px;">To grow C. glabrata cells</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:163px;">Water jacketed CO2&#160; incubator</td>
			<td style="width:105px;">Thermo Electron Corporation</td>
			<td style="width:85px;">Forma series 2</td>
			<td style="width:243px;">To culture THP-1 cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:105px;">Carl Ziess</td>
			<td style="width:85px;">Ziess LSM 510 meta&#160;</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:105px;">Olympus</td>
			<td style="width:85px;">CKX 41</td>
			<td style="width:243px;">To observe C. glabrata and THP-1 macrophages</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">PCR machine</td>
			<td style="width:105px;">BioRad&#160;</td>
			<td style="width:85px;">DNA Engine</td>
			<td style="width:243px;">To amplify unique tags from input and output genomic DNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">Hybridization oven</td>
			<td style="width:105px;">Labnet</td>
			<td style="width:85px;">Problot 12S</td>
			<td style="width:243px;">For hybridization&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:163px;">PhosphorImager</td>
			<td style="width:105px;">Fujifilm</td>
			<td style="width:85px;">FLA-9000</td>
			<td style="width:243px;">For scanning hybridized membranes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Thermomixer</td>
			<td style="width:105px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:85px;">Thermomixer Comfort</td>
			<td style="width:243px;">For denaturation of radiolabeled signature tags</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:163px;">Gel documentation unit</td>
			<td style="width:105px;">Alphainnontech</td>
			<td style="width:85px;">Alphaimager</td>
			<td style="width:243px;">To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of an in vitro system to study intracellular behavior of candida glabrata in human thp-1 macrophages

세포 배양 모델 계, 호스트 환경 조건 부근 미믹, 미생물 병원체 감염의 특정 단계의 연구를위한 동물 모델 시스템을 저렴하고 재현성 쉽게 처리 가능한 대안이 될 수있는 경우. , 포르 볼 에스테르 치료시, 대 식세포로 분화된다 THP-1 인간 단핵구 세포주는 이전에 결핵균을 포함한 많은 세포 내 병원체의 독성 전략을 연구하기 위해 사용되었다. 여기서, 우리는 시험 관내 세포 배양 모델을 규정하는 프로토콜 토론 호스트 식세포 세포와 기회 주의적 인간의 효모 병원체 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 묘사하는 THP-1 대식 세포를 사용하여 시스템. 이 모델 시스템은 간단하고, 빠르고, 높은 처리량 돌연변이 화면에 순종하고, 더 정교한 장비가 필요하지 않습니다. 전형적인 THP-1 대식 세포 감염 실험 복구 세포를 허용하는 추가 ~ 48 시간으로 약 24 시간 소요식민지 단위 기반의 생존 분석을 형성하기 위해 다양한 매체에 성장 효모. 다른 시험 관내 모델 시스템과 같이,이 접근법의 가능한 제한은 인간 숙주에 존재하는 매우 복잡한 면역 세포 회로에 얻어진 결과를 외삽 곤란하다. 그러나 이것에도 불구하고, 현재의 프로토콜은 곰팡이 병원균 / 회피 항균 응답을 방해 생존, 적응 및 숙주 면역 세포의 영양이 부족한 환경에서 증식하는 데 사용할 수있다 전략을 명료하게하는 것은 매우 유용합니다.

감염 C.와 PMA 처리 THP-1 대식 세포의 분석 글라 브라 야생형 (중량) 세포는 중량 세포가 2 시간의 coincubation 후 55-65%의 속도로 대 식세포에 의해 포식 것으로 나타났다. 또한, C. 글라 브라 세포는 THP-1 식세포에 의해 살해를 저항 할 수 있었고, 적당한 5을 시행 - THP-1 식세포 8 공동 배양 24 시간 후 CFUs의 7 배 증가. THP-1 식세포에서 GFP-발현 플라스미드로 형질 전...

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Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

11.5K 조회수.  Centre for DNA Fingerprinting and Diagnostics, Andhra Pradesh, India.  현재 문서 곰팡이 독성 메커니즘에 대한 우리의 지식을 향상 할 수있는 유용한 도구가 될 것입니다 인간 대 식세포와 통성 세포 내 인간의 곰팡이 병원균 칸디다 글라 브라의 상호 작용을 연구하는 체외 세포 배양 모델 시스템을 구축 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 

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piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

연구

면역학 및 감염병학

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

라이브 식세포에 Phagolysosome 속생의 연구

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...