This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 &#8216;Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments&#8217; and HE1964/18 within priority program 1580.

10 nm의 금 나노 입자 (골드 NP에) 15 1. 합성 <ol><li> 솔루션을 준비 : 160 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 2 ml의 1 % 수성 금 염화을 추가합니다. </li><li> 용액 B를 준비 : 32 ml의 밀리-Q, 또는 두 번 증류 물에 8 ml의 1 % 트라이 구연산 나트륨 × 2 H 2 O 160 ㎕의 1 % 타닌산을 추가합니다. </li><li> 60 ° C에 용액 A와 B를 따뜻하게하고 교반하면서 그들을 섞는다. 바로 다크 블루 색상을 관찰합니다. 약 15 분 후 붉은 색을 관찰한다. 그 후, 95 ° C까지 가열 5 분을 유지하고 RT에 대한 해결책을 냉각. </li><li> 탄소 코팅 격자에 NP 현탁액의 드롭을 추가하고 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과형 전자 현미경으로 된 NP의 크기 및 형태를 확인한다. </li></ol> 로다 민 N-히드 록시 숙신 에스테르 (NHS)와 BSA와 레이블 골드 NP에 2. 코팅 (16) <ol><li> 30 분 동안 15,000 XG에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 900 μL에게 원심 분리기를 금 NPS를 추가합니다. 연산전통적, 5 월 한 번에 여러 개의 튜브를 준비합니다. </li><li> 900 μL의 펠렛 살균 밀리 Q 물을 다시 중단하고 100 μL 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS를 추가, 상층 액을 버리고 30 분 동안 800 rpm으로 소용돌이에 섞는다. </li><li> 초과 BSA를 제거하려면 60 분 동안 15,000 XG에서 준비를 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고, 125 μl의 PBS에서 금 BSA NPS를 다시 일시 중지, 1 M 중탄산 12.5 μl를 추가합니다. </li><li> 즉시 사용하기 전에, 로다 민 NHS / DMSO의 10 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 금 BSA NP에 현탁액 1ml를 할 로다 민 NHS / DMSO 용액 30 μl를 추가합니다. 빛에 노출을 피하고, 800 rpm으로 혼합 동안 실온에서 2 시간 (또는 O / N)에 대한 반응을 품어. </li><li> 48 시간 - 36의 기간 동안 5 버퍼 변경 4 ºC에서 PBS에 대한 투석을 통해 금 BSA-로다 민 NPS를 정화. </li><li> , NPS를 안정화 각 1 ml의 금 BSA-로다 민 NP에에 200 ㎎ / ㎖ BSA / PBS의 10 μl를 추가합니다. 15, 무료 또는 BSA-로다 민 발표 원심 분리기를 제거하려면,60 분 동안 000 XG. 빛에 대한 노출을 피하기 위해, 4 ° C에서 OD (520), 및 저장소를 측정, 2 ㎎ / ㎖ BSA / PBS에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 밀리-Q 또는 더블 증류수로 NP에 10 배 희석, 탄소 코팅 격자 상에 드롭을 추가하고, 공기를 건조 할 수 있습니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 NP에의 크기 및 형태를 확인한다. 주 : NP 제제에서 사용되는 모든 재료는 멸균시키고, 동작은 세포 배양 후드에서 화염 또는 옆 벤치에 행 하였다. </li></ol> HeLa 세포 3. 문화 <ol><li> 영구적 LAMP1-GFP를 발현하는 HeLa 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 DMEM에서 배양하고, 5 % CO 2를 함유하는 분위기하에 37 ℃에서 성장된다. </li><li> 8 잘 챔버 슬라이드 (Ibidi)에서 잘 50,000의 밀도로 세포를 종자 및 / N을 O를 품어. </li></ol> 박테리아 4. 문화 <ol><li> 사용 살모넬라 엔테 혈청 형 Typhimurium의 NCTC 12023 줘야D 타입 (WT) 변형. 비교를 위해, SIF에 대한 키 이펙터 시파 부족 SPI2-T3SS 및 Δ 시파에서 Δ ssaV 결함이있는 돌연변이 균주를 사용합니다. 강화 된 GFP의 구성 적 발현 플라스미드 pFPV25.1을 품고 균주를 사용합니다. 참고 : 세균 균주가 50 ㎍ / ㎖의 카르 베니 실린 및 / 또는 50 ㎍ / ㎖의 카나마이신 (Δ ssaV, Δ 시파의 추가와 함께 50 ㎍ / ml의 카르 베니 실린 (WT)와 LB의 추가와 함께 (LB) 루리아 - 베르 타니 국물에 일상적으로 배양 )의 플라스미드를 유지하는 데 필요한. </li><li> 다음 신선한 LB에 1:31 희석 3.5 시간 동안 성장을 계속, 적절한 항생제로 3 ㎖ LB에서 박테리아의 단일 콜로니를 접종하고 폭기 진탕 조건에서 37 ºC에서 / N을 O 성장. 이 시간 시점에서 배양 후반 로그 상에 도달하고 박테리아 매우 침습적이다. &#39;롤러 드럼&#39;폭기 테스트 튜브 문화를 배양하는 것이 편리하다. </li></ol> HeLa 세포의 감염에 의해 5.살모넬라 균과 골드 BSA-로다 민 NPS는 체이스 - 라벨 (방식에 대한 그림 1 참조) 펄스 <ol><li> 계대 배양 균의 OD (600)를 측정하고 1 ㎖의 PBS (~ 3 × 108 CFU / ㎖) 600 = 0.2 중독 묽은의 다양성을 달성하기 위해 8 웰 챔버 슬라이드에서 HeLa 세포에 박테리아의 적당량을 추가 감염 100 (MOI). </li><li> 비 내면화 박테리아를 제거하기 위해 PBS로 3 회, 세포 배양기에서 30 분 동안 인큐베이션 세척 (이 시점을 0 시간의 감염 후, 0 시간 또는 파이로 설정 하였다). 100 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 함유하는 신선한 배지 300 μl를 추가하고 1 시간 동안 유지한다. 그런 다음 배양 시간의 나머지 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 1 시간 동안 100 ㎍ / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 배양 배지로 배양 한 후, 배지는 공동 (30 mM의 HEPES, pH가 7.4, FCS, L 글루타민, 페놀 레드 및 중탄산 나트륨없이 이글스 MEM) 매질을 묘화로 대체10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 ntaining. 골드 BSA-로다 NPS는 OD = 0.1 (520)의 최종 농도를 얻기 위해 HeLa 세포에 첨가 하였다. 참고 : 골드 BSA-로다 민 NPS는 또한 감염 전에, 또는 다양한 시간 포인트 파이에서 세포에 첨가 할 수있다 </li><li> 1 시간 배양 한 후, 배지를 제거 PBS로 3 회 세척하고, 배양 시간의 나머지 10 % FCS 및 10 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 새로운 영상 매체의 300 μl를 추가합니다. 참고 : 배양 기간이 사용 된 NP 및 세포주의 농도에 따라 달라질 수 있습니다. RAW264.7 대 식세포를 위해, 우리는 충분히 내재화 허용 OD 520 = 0.05의 농도로 된 NP와 그 30 분의 인큐베이션을 관찰했다. </li></ol> 6. 이미징 <ol><li> 서로 다른 시간 지점에서 고해상도 이미징을위한 가습 환경 챔버와 공 초점 레이저 주사 (CLSM) 또는 회전 디스크 (SD) 현미경으로 공 초점 이미징 시스템을 사용합니다. </li><li> 온도 C에 스위치가 안정 될 때까지 시스템을 조작부 기다립니다. 이러한 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택 등 GFP에 적합한 여기 / 방출 설정을 사용하여 금 BSA-로다 민 NP에 같은 이미지 설정을 최적화합니다. 이 프로토콜의 경우, 512 X 512 픽셀의 400 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 μm 인 Z-스텝 크기를 사용한다. GFP 각각 아르곤 레이저 (488 nm의)와 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)를 사용하여 금 BSA-로다 민을 흥분. 세포의 형태를 관찰하기위한 명 시야 (BF) 채널을 포함. 현미경 시스템 및 다른 감염 조건의 경우, 설정은 적절하게 조정되어야한다. 참고 사진 승수 (PMT) 검출기로 검출 된 BF 채널과 신호의 광원과 같은 아르곤 레이저를 사용합니다. </li><li> 표시된 시간 - 점에서 PI, 스테이지 현미경 및 기록 이미지에 감염된 세포를 함유하는 8 웰 챔버 슬라이드 마운트. </li></ol> 이미지 7. 분석 <ol><li> 현미경 이미지 분석 소프트웨어를 사용 (참조 <strong&gt; 재료 및 장비의 표) 세포 내 살모넬라 균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 개조를 분석합니다. &#39;열기&#39;를 클릭하고 파일을 선택하여 데이터를 엽니 다. 참고 : 또한, 같은 ImageJ에 나 피지 같은 오픈 소스 소프트웨어 패키지 양적 이미지에 사용될 수있다 분석한다. </li><li> 아이콘 뷰를 능가 클릭의 개체 도구 모음에서 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon1.jpg" /> 새로운 표면 항목을 추가 할 수 있습니다. 에 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (다음). </li><li> 관심 (ROI)의 지역을 선택 세그먼트 ROI를 분석합니다. 보기 영역에서 이미지 위에 겹쳐 사각형 테두리가 절에서는 투자 수익 (ROI)을 대표한다. Y-, 해당 x 축에 값을 입력하고 Z- 필드 또는 직접 크기와 ROI의 위치를​​ 변경하려면 미리보기 사각형에 화살표를 클릭합니다. 다음을 클릭합니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src<html> = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg&quot;/&gt; (다음). </li><li> 소스 채널로 선택 채널 3 (금 BSA-로다 민 NP에 대한 신호). 결과 영역의 부드러움을 설정하는 부드러운 옵션을 선택합니다. 수동으로 값을 정의 또는 자동으로 생성 된 값을 적용합니다. 임계 값의 경우, 절대 강도 옵션을 선택합니다. </li><li> 임계 조정 용의 옵션을 선택하고 값을 설정. 보기 영역에서, 표면 임계 미리보기가 회색으로 표시됩니다. </li><li> 탭 분류 표면에 생성 된 표면은 여러 기준에 의해 필터링 할 수 있습니다. 기본 필터는 다른 필터 &#39;복셀&gt; (10)의 수&#39;는 &#39;추가&#39;를 클릭하여 포함시킬 수있다. 필터링이 필요없는 경우, 삭제 버튼을 클릭하여 모든 필터를 삭제합니다. 클릭 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon2.jpg" /> (다음). </li><li> 표면 생성을 완료하려면 클릭/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg은 &quot;/&gt; (마침). 개체 목록에서 지금 확인되지 않은 항목의 볼륨 및 새로 생성 한 표면의 상자 것은보기 영역에 표시됩니다. </li><li> 통계를 내 보냅니다. 이제 능가보기에서 대상의 색상은 지역에 따라 보라색에서 빨간색으로 변화한다. 그리고 &#39;플롯 번호 영역&#39;표는 통계 정보 (예를 들어, ID 번호와 객체의 영역)를 보여줍니다. 클릭하여 Excel 파일을 사면 (1)의 모든 통계를 내 보냅니다 <img alt="아이콘" fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/52058/52058icon4.jpg" /> (저장). </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

포유류 세포의 엔도 리소좀 시스템은 영양소 흡수, 호르몬 - 매개 신호 전달, 면역 감시 및 항원 제시 (17)과 같은 중요 생리 학적 과정을 제어한다. 지금, 마커의 다양한 세포 내 이입 경로 및 추적 연구의 표지에 사용 된 최대. 예를 들어, LysoTracker 프로브는 선택적으로 낮은 내부 pH가 세포 구획에 축적하고 효과적으로 나노 몰 농도 18 살아있는 세포에 레이블을 지정할 수 있습니다 ...

등의 금속 NP에, 양자점, NP는 폴리머, 실리카 NP는, 탄소 도트 포함한 형광 나노 입자 (NPS는), 지난 수십 년 동안 1,2- 상당한 주목을 받고있다. 기존의 유기 염료에 비해 형광 NPS는 이러한 강한 신호 강도 photobleaching에 저항과 높은 생체 적합성과 같은 3,4- 바람직한 화학적, 광학적 및 기계적 특성을 보여준다. 이러한 장점은 그 세포 내 감지 및 라이브 세포 이미징에 대한 선택의 방법합니다. 또한, 전자 밀도가 된 NP의 다양한 EM 5 초 미세 수준에서 광학 현미경 (LM)과 높은 해상도로 추적 라이브 셀의 조합을 할 수 있습니다 상관 현미경 분석에 대한 사용을 촉진, 전자 현미경 (EM)로 볼 수 있습니다. 예를 들어, 금 NPS는 효율적 민감한 진단 살아있는 세포뿐만 아니라 면역 표지 (6)의 분야에서 바이오 센서로서 사용 장시간왔다. 최근의tudies 다른 크기 및 형상 골드 NPS에서 세포주 많은 다양한 흡수는 일상적 엔도 좀 경로를 통해 운송, 따라서 큰 잠재력의 존재는 세포 내 소포 반송 추적 및 엔도 리소좀 시스템 라벨링 적용될 용이하게 할 수 있음을 나타내 7,8 . 살모넬라 엔테, 시겔 flexneri 및 리스테리아 균 등의 미생물 병원균, 비 식세포 숙주 세포 9 침입하는 다른 메커니즘을 개발했습니다. 내면화 한 후, 병원균, 중 세포질에 지역화 또는 막 결합 구획에 압수은, 자신의 호스트 환경과 상호 작용하고 자신의 생존 (10)를 선호하는 이들을 조절. 예를 들어, 살모넬라 엔테는 상주하며 세포 내 phagosomal 구획 감염 11시 살모넬라 함유 공포 (SCV)를 지칭 내에서 복제합니다. 성숙 SCV, 골지체으로 트래픽 세포 내 이입 경로와 지속적으로 상호 작용을 진행하고, 살모넬라 유도 된 필라멘트와 같은 광범위한 관상 구조, (SIF), 넥신 세관 정렬, 살모넬라 유도 된 분비 캐리어 막 단백질 3 (SCAMP3) 세관 등의 형성을 유도 . 12 ~ 14. 이러한 병원성 세균이 숙주 세포 경로를 조작하는 방법을 공부하는 것은 이해 감염성 질환에 필수적이다. 여기서, 금 BSA-로다 된 NP는 숙주 세포 엔도 리소좀 시스템에 라벨 유체 추적자로 사용하여, 인간의 위장관 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (살모넬라)와 병원체의 상호 작용을 연구하는 모델 박테리아로서 사용 세포 내 이입 통로를 개최. WT 살모넬라 돌연변이 균주에 감염된 비감염 세포와 세포에서의 세포 내 금 BSA-NP에 로다는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 촬영 하였다.이어서 Imaris 소프트웨어는 살모넬라 감염 엔도 좀 / 리소좀 극단적 재 배열을 유도 나타내는 NPS에서의 분포를 정량화하는 데 사용되었다. 이 방법의 설명에 이어, 유사한 실험은 내재화 된 NP의 장기 거동을 추적 및 진핵 세포의 세포 내 이입 경로에 다양 외인성 또는 내인성 인자 물질의 영향을 조사하기 위해 설계 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:193px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:149px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:176px;">Comments/ Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gold chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>520918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tannic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>403040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tri-sodium citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NHS-Rhodamine</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>46406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A1492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamcyin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carbenicillin</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">8-well chamber slides</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80826</td>
			<td>tissue culture treated, sterile</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaris Software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>version 7.6</td>
			<td>various configurations available</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of fluorescent nanoparticles to study remodeling of the endo-lysosomal system by intracellular bacteria

바람직한 화학, 광학 및 기계적 특성을 가진 형광 나노 입자 (NPS는) 세포 내 소기관에 레이블 유망한 도구입니다. 여기서, 우리는 진핵 세포의 엔도 리소좀 시스템 라벨과 세포 내 병원체 살모넬라 엔테 의해 호스트 세포질 통로의 조작을 모니터링하기 위해 골드 - 로다 BSA NPS를 이용하는 방법을 소개한다. NPS는 용이 늦은 엔도 솜 / 리소좀으로 HeLa 세포에 의해 내부화 된 및 집중 하였다. 살모넬라 감염 Salmonella- 유도 막 구조체 및 소포 및 축적 된 NP의 재 배열을 유도. 우리는 공 촛점 현미경 이미지의 정량적 분석을 위해 Imaris 소프트웨어 패키지를 배포. 개체의 개수 및 비감염 세포에서 크기 분포가 매우 WT 살모넬라 엔도 리소좀 시스템의 개장 나타내는 살모넬라 -infected 세포들로부터 구별 하였다.

골드 NPS는 구연산과 타닌산에 의해 염화 금산의 감소를 통해 확립 된 방법을 통해 생성되었다. 도 2a에 도시 된 바와 같이, 합성 금 NPS는 약 10 nm의 크기와 모양에 준 구형이다. BSA 코팅 및 로다 민 - 라벨은 형태 나 크기 (그림 2B)에 영향을 미치지 않았다. 이것은 금 NP에 용이 다양한 포유 동물 세포에 의해 흡수 및 세포 내 이입 시스템 (7)에서 ?...

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Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다.

형광 나노 입자의 응용 프로그램은 세포 내 세균에 의해 엔도 - 리소좀 시스템의 리모델링을 연구하기 위해

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

application-fluorescent-nanoparticles-to-study-remodeling-endo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K 조회수.  Universität Osnabrück.  이 문서에서는 합성 및 나노 입자의 형광 라벨 NPS ()하는 방법을 설명합니다. NPS는 진핵 세포의 엔도 - 리소좀 시스템에 레이블을 펄스 - 체이스 실험에 적용되었다. 세포 내 병원균 살모넬라 엔테의 활동에 의한 엔도 - 리소좀 시스템의 조작은 라이브 세포 이미징 및 정량화 따랐다. 

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Multiplex Detection of Bacteria in Complex Clinical and Environmental Samples using Oligonucleotide-coupled Fluorescent Microspheres

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated to a microbiota dominated by a number of bacterial species, including Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, and others1-3. This condition is associated with a range of negative health outcomes, including HIV acquisition4, and it can be difficult to manage clinically5. Furthermore, diagnosis of BV has relied on the use of Gram stains of vaginal swab smears that are scored on various numerical criteria6,7. While this diagnostic is simple, inexpensive, and well suited to resource-limited settings, it can suffer from problems related to subjective interpretations and it does not give a detailed profile of the composition of the vaginal microbiota8. Recent deep sequencing efforts have revealed a rich, diverse vaginal microbiota with clear differences between samples taken from individuals that are diagnosed with BV compared to those individuals that are considered normal9,10, which has resulted in the identification of a number of potential targets for molecular diagnosis of BV11,12. These studies have provided a wealth of useful information, but deep sequencing is not yet practical as a diagnostic method in a clinical setting. We have recently described a method for rapidly profiling the vaginal microbiota in a multiplex format using oligonucleotide-coupled fluorescent beads with detection on a Luminex platform13. This method, like current Gram stain-based methods, is rapid and simple but adds the additional advantage of exploiting molecular knowledge arising from sequencing studies in probe design. This method therefore provides a way to profile the major microorganisms that are present in a vaginal swab that can be used to diagnose BV with high specificity and sensitivity compared to Gram stain while providing additional information on species presence and abundance in a semi-quantitative and rapid manner. This multiplex method is expandable well beyond the range of current quantitative PCR assays for particular organisms, which is currently limited to 5 or 6 different assays in a single sample14. Importantly, the method is not limited to the detection of bacteria in vaginal swabs and can be easily adapted to rapidly profile nearly any microbial community of interest. For example, we have recently begun to apply this methodology to the development of diagnostic tools for use in wastewater treatment plants.

We describe a multiplex method for the detection of microorganisms within a sample using oligonucleotide-coupled fluorescent beads. Amplicon from all organisms within a sample is hybridized to a panel of probe-coupled beads. A Luminex or Bio-Plex instrument is used to query each bead for bead type and hybridization signal.

Oligonucleotide - 결합 형광등 Microspheres를 사용하여 복잡한 임상 및 환경 샘플에서 박테리아의 멀티 플렉스 감지

Bacterial vaginosis (BV) is a recurring polymicrobial syndrome that is characterized by a change in the "normal" microbiota from Lactobacillus-dominated ...

연구

면역학 및 감염병학

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

핫 수성 - 페놀 추출에 의한 그람 음성 박테리아에서 정화와 Lipopolysaccharide의 시각화

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

유도 발현 시스템을 적용하면 세포 내 신호와 세균 독성 요인의 간섭을 연구하기 위해

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a fascinating approach to investigate immune modulation of cutaneous inflammation in mouse models of human diseases. Here we present a cost-effective protocol that delivered naked DNA in mouse skin and leads to transgene expression. The method is coined &#34;acufection&#34;, denoting acupuncture-mediated DNA transfection. To perform acufection, mouse skin was first infused with DNA in phosphate-buffered saline (PBS) and then pricked lightly with a bundle of acupuncture needles to facilitate the absorption of DNA and transfection into cells. The plasmid DNA is presumably taken up by the keratinocyte and dendritic cells (DCs) in the skin and expressed into protein. Mechanical prick with the needles per se did not cause skin damage or induce keratinocyte activation. The expression of the transfected genes was detected in the skin at both transcriptional and translational levels following acufection for 2 days and maintained up to 7 days. The primary goal for the development of this acufection method was to investigate a previously undefined isoform of IL-15. Using this method, an alternatively spliced IL-15 isoform with partially deleted exon 7 (IL-15&#916;E7) was expressed in the skin and subsequently treated with a Toll-like receptor 7 (TLR7) agonist, imiquimod (IMQ), to induce inflammation. Acufection-delivered IL-15&#916;E7 in skin suppressed keratinocyte proliferation, epidermal thickness and neutrophil recruitment in IMQ-induced cutaneous inflammation. With increasing interest in identifying the regulatory mechanisms of cutaneous inflammation, the protocol described here provides a cost effective and versatile alternative to the gene gun system or microseeding for DNA delivery in vivo. It may potentially allow discovery of the function of a novel gene in the skin or for investigating new treatment for cutaneous diseases.

Development of an Economical DNA Delivery System by &quot;Acufection&quot; and its Application to Skin Research

This protocol is a cost-effective alternative for expressing naked plasmid DNA in mouse skin. The overall goal of the protocol is to deliver immune-related genes into skin tissue to delineate the functional role of a specific gene in cutaneous inflammation.

&quot;Acufection&quot;와 피부 연구에의 응용에 의한 경제적 인 DNA 전달 시스템의 개발

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

소설 급지대 무료 시스템 대량 생산을 위한 생체 외에서 Murine 자연 킬러 세포의

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic purposes. However, the visualization and quantification of multiple antigens in a single tissue section using conventional chromogenic IHC is challenging. Multiplexed imaging is especially relevant in lymphoma research and diagnostics, where markers have to be interpreted in the context of a complex tumor microenvironment. Here we describe a protocol for multiplexed fluorescent IHC staining to enable the quantitative assessment of multiple targets in specific cell types of interest in lymphoma.The method covers aspects of antibody validation, antibody optimization, the multiplex optimization with markers of lymphoma subtypes, the staining of tissue microarray (TMA) slides, and the scanning of the slides, followed by data analysis, with specific reference to lymphoma. Using this method, scores for both the mean intensity of a marker of interest and the percentage positivity are generated to facilitate further quantitative analysis. Multiplexing minimizes sample utilization and provides spatial information for each marker of interest.

Here we describe a protocol for multiplex fluorescent immunohistochemical staining and imaging for the simultaneous localization of multiple cancer-associated antigens in lymphoma. This protocol can be extended to the colocalization analysis of biomarkers within all tissue sections.

멀티플렉스 형광 Immunohistochemical 얼룩, 이미징, 및 림프 종 조직학 샘플 분석

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

혐기성 박테리아에 의한 쥐 질 집락화 모델

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...