전자 치밍 대식세포는 비 자기 기원의 분자를 검출하는 전문이기 때문에, 그들은 특히 transfect하기 어렵다. 우리는 플라스미드와 같은 DNA 템플릿에서 생성된 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고도로 효율적인 질입이 허용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법의 주요 장점은 검출 가능한 세포 독성 또는 면역 원성이 없는 상태에서 높은 형질 전환율이 달성된다는 것입니다.
절차를 시연하는 것은 마크 허브 내 실험실에서 postdoc 될 것입니다. RNA 전사 키트의 모든 구성 요소를 해동하여 시작합니다. 시약을 5초 동안 소용돌이치게 하고 2, 000배 g에서 2초 동안 회전한 다음 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
원고 방향에 따라 0.5 마이크로리터 미세 센트리후르 튜브에서 체외 RNA 전사 반응을 준비한다. 튜브를 소용돌이쳐 아래로 회전합니다. 그런 다음 열 믹서에 400 rpm에서 혼합하면서 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오.
인큐베이션 후, DNase의 마이크로리터 2개를 반응 믹스에 직접 넣습니다. 소용돌이와 튜브를 아래로 회전하고, 또 다른 15 분 동안 열 믹서에 인큐베이션. 대조겔용 DNA 처리 제품의 2마이크로리터 알리쿼트를 예약하여 섭씨 영하 80도에 보관하십시오.
폴리아 테일링의 경우, 10X 폴리아 폴리머라제 반응 버퍼의 5개의 마이크로리터와 5개의 폴리아 폴리머라제 마이크로리터를 DNA-처리 반응에 첨가한다. 소용돌이와 믹스를 스핀 다운. 그런 다음 30 분 동안 열 믹서에 인큐베이션하십시오.
반응이 완료되면 제어 젤에 대한 2 마이크로 리터 알리쿼트 (aliquot)를 가져 와서 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 원고 방향에 따라 폴리A 꼬리 제품에 직접 5-프라임 dephosphorylation 시약을 추가합니다. 소용돌이와 튜브를 스핀 다운하고, 또 다른 30 분 동안 열 믹서에 인큐베이션.
남극 인산화를 가열하기 위해 섭씨 80도에서 2분 간 배양하여 탈포염 반응을 따르십시오. 그런 다음 전용 RNA 정화 키트를 사용하여 생체 외 전사 mRNA를 정화합니다. 마이크로볼륨 분광계로 용출된 mRNA의 농도와 순도를 측정합니다.
이전에 수집된 알리쿼트와 함께 데니밍 아가로즈 젤을 실행하여 단일 제품의 존재, 올바른 성적증명서 길이 및 폴리A 테일링의 존재를 확인합니다. mRNA 경질 완충제의 미리 계산된 부피를 반응 튜브에 mRNA 경질 시약 및 mRNA의 부피를 뺀 것으로 전환에 대비한다. mRNA 스톡을 해동하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 섞습니다.
그런 다음 반응 튜브에 미리 계산된 mRNA 부피를 추가합니다. 소용돌이및 반응 믹스및 mRNA 경질 시약을 스핀다운한 다음, 반응 혼합 튜브에 mRNA 경전 시약의 적절한 부피를 첨가한다. 튜브를 소용돌이쳐 아래로 회전합니다.
그런 다음 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 한편, 대식세포의 배양 배지를 신선한 따뜻한 배양 매체로 대체한다. 배설 믹스의 인큐베이션이 완료되면, 대식세포가 들어있는 플레이트 웰에 믹스를 넣고 외부에서 우물의 중간까지 원을 그리며 떨어뜨립니다.
투명하게 분배되도록 하려면 플레이트를 수직 및 수평 방향으로 부드럽게 흔들어 주세요. 그런 다음 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 최소 6시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 형광 현미경 검사법, 유동 세포형 또는 면역blot로 경질 효율을 분석합니다.
이 절차의 가장 중요한 부분은 모든 대식세포가 동일한 양의 mRNA와 접촉하도록 트랜스페션 믹스의 균일한 분포를 보장하는 것입니다. 이 프로토콜은 1차 대식세포의 전환에 대해 플래그 태그가 달린 NEMO 및 IKK-베타 변종을 코딩하는 mRNA 인코딩을 성공적으로 생성하는 데 사용되었습니다. mRNA의 정확한 크기와 폴리A 테일링은 아가로즈 겔 전기포광에 의해 검증되었다.
GFP를 인코딩하는 mRNA를 생성하고 유동 세포측정 분석을 수행함으로써 경피 효율을 확인했습니다. 경질율은 전과된 mRNA의 양과 함께 증가하여 PM의 경우 50~65%, BMDM의 경우 80~85%에 달했습니다. PM과 BMDM 모두에서, 전과 된 세포에서 EGFP의 발현 수준은 시간 및 복용량 의존방식으로 증가하였다.
중요한 것은, 프로피듐 요오드 양성 또는 부속서 V 양성 대식세포의 분석은 형질 전환 절차가 lytic 또는 세포 사멸 세포 사멸세포를 유도하지 않았다는 것을 확인했습니다. MRNA의 트랜스페션 효율은 플래그 태그가 달린 니모 또는 IKK-베타 변이체를 면역형광 현미경으로 분석되었다. 비율은 니모 mRNA에 대 한 약 60%와 IKK 베타 mRNAs에 대 한 55%.
이 프로토콜은 또한 mRNA 인코딩 Cre 재조합을 생성하는 데 사용되었다. 400, 000 BMDM의 트랜스페션과 400 나노그램의 Cre 재조합 mRNA는 48시간 후에 니모 단백질을 거의 완전히 고갈시켰으며, 이는 매우 효율적인 트랜스페션을 나타냅니다. 인터류신 1 베타, 인터류신-6 및 종양 괴사 인자의 검출 가능한 양이 없는 것은 경질 절차가 프로 염증 성 신호를 활성화하지 않는다는 것을 나타낸다.
우리의 비교적 간단한 방법은 마침내 1 차적인 대식세포에서 돌연변이 또는 태그가 지정된 단백질을 효율적으로 표현할 수 있게 합니다. 이것은 분자 수준에 대식세포 기능의 분석을 실질적으로 더 할 것입니다.
