이 연구는 NIH 보조금 SLB에 GM055360와 RGM에 U54HD068157에 의해 지원되었다. JMB는 펜실베니아 대학 (GM008216)에서 T32 유전학 교육 그랜트에 의해 지원되었다.

STA-PUT 프로토콜은 세 단계를 포함한다 : 1) 장치 및 시약의 설정, 전체 고환에서의 세포 현탁액 2) 준비, 3) 셀 로딩, 침강 및 분수 수집. 두 연구원의 팀에 의해 수행하는 경우, 프로토콜은 평균 8 시간이 소요된다. 1. STA-PUT의 장치를 설정한다 (그림 1) 수집의 방법을 선호하는 경우 *** STA-PUT 장치는 4 ° C 대형 냉장고 나 또한 일부 컬렉터를 수용 할 수있는 차가운 방에 배치해야합니다. <ol><li> 전에 (또는 적어도 몇 시간 전에) 당신이 방법을 수행 밤, 모든 장비 (특히 유리와 튜브)를 세척하고 70 % 에탄올로 소독. 완전도 1에 도시 된 바와 같이 장치를 조립하기 전에 장비를 건조 시키. </li><li> 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C) 및 셀 로딩 챔버 (보안 <str사연&gt; 그림 1A) 상단 플랫폼 및 튜브 클램프 튜브의 두 개의 작은 조각으로 모두를 연결합니다. 클램프 모든 튜브 폐쇄. 가장 오른쪽이 L 실린더에 주둥이를 밀봉. </li><li> 셀 로딩 챔버에있는 작은 교반 막대 (그림 1A)와 2 % BSA를 포함 할 가장 왼쪽이 L 실린더에 큰 교반 막대 (그림 1B)를 놓습니다. </li><li> 플랫폼 (그림 1D)에 2 L 침강 챔버를 놓습니다. 직접 침강 챔버 (도 1D)의 바닥에있는 개구부의 상부에 금속 배플 (도 1F)을 배치. 배플은 분수를 수집하는 동안 셀 그라데이션의 액체 및 중단의 소용돌이로 교반 방지 등이 중요하다. 침전 챔버의 상부에 뚜껑을 놓습니다. </li><li> 삼방 스톱 콕 (도 1G)의 그라운드 글라스 조인트에 진공 그리스의 미량을 적용하면, SE의 아래쪽 콕 클램프dimentation 챔버, 스톱 콕 및 침강 실의 그라운드 글라스 조인트를 연결. </li><li> 튜브와 코크의 오른쪽 콘센트에 셀 로딩 챔버 (그림 1A)를 연결합니다. 마개를 닫습니다. </li><li> 마개의 왼쪽 콘센트에 세포 분별 튜브를 연결합니다. 분별 튜브의 개방 단부에 연결된 유리 파스퇴르 피펫으로 튜브의 조각을 포함한다. 작은 구멍 튜브의 조각은 유리 피펫의 좁은 끝 부분에 부착되어있다. 좁은 피펫은 분수를 수집하는 동안 세포 현탁액의 흐름을 제한합니다. 맨 아래에이 작은 튜브를 클램프. </li><li> 2 L 크렙스 준비 (1X) 실험 (표 1)의 일을 버퍼. 그런 다음, 1X 레브 550 ml의 2 % BSA, 1X 레브에있는 550 ㎖의 4 % BSA 및 1X 크렙스에 50 ㎖의 0.5 % BSA를 준비합니다. 필터와 4 ° C.에 이러한 솔루션을 냉각 </li><li> 오른쪽 2 L 실린더 (그림 1C)의 4 % BSA 용액과 2 % BSA를 부어왼쪽 2 L 실린더 (그림 1B)의 솔루션을 제공합니다. 확인이 실린더를 연결하는 튜브에 큰 거품이 없는지 확인하십시오. </li><li> 이러한 그라데이션을 방해 할 수로, 셀 로딩 챔버로 크렙스 버퍼를 따르고 있는지 더 큰 거품이 없다하고, 침전 챔버와이 챔버를 연결하는 튜브를 입력합니다. 압박 또는 튜브를 가볍게 치는 것은 부드럽게 거품을 제거하는 데 도움이됩니다. 크렙스 버퍼의 모든 튜브가 아닌 세포 실에 있는지 확인합니다. </li><li> 크렙스 완충액 소량 침강 챔버 내로 유동하고 튜브를 채우고있는 큰 기포를 제거하기 위해 세포 분획 튜빙으로 거의 모든 버퍼를 배출되도록. </li><li> 직접 침전 실 아래 부분 수집기를 놓습니다. 모든 분수 튜브가 제자리에 있고 오염을 방지하기 위해 플라스틱 포장으로 덮여 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 전체 고환에서 정자 형성 세포를 분리 <oL&gt; <li> 캘리포니아 주 12 성인 마우스 (바람직하게는 최소 8 주 이전) 및 실온에서 크렙스 버퍼에 어떤 장소 오염 물질을 씻어에서 고환을 해부하다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학의 가이드 라인을 준수하여 수행되었다. </li><li> 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 원뿔 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 45 mg의 콜라게나 제를 추가합니다. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다. </li><li> 투 니카 albuginea을 버리고 정 세관을 발표, 8 ML 크렙스 버퍼를 포함하는 별도의 접시에 고환을 디 캡슐. 투 니카 albuginea는 정 세관을 둘러싸고있는 얇은 막이다. 세관은 쉽게 투 니카 albuginea에서 분리해야합니다. 이를 위해, 투 니카 albuginea의 절개를, 친구 야 함께이 막을 개최집게의 R, 멀리 포셉의 다른 쌍을 사용하여 막에서 밖으로 세관을 밀어. </li><li> 콜라게나 제 용액 25 ㎖를 포함하는 각 원뿔 튜브에 세관을 포함하는 4 ML 크렙스 버퍼를 추가하고 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 끝에, 세뇨관는 &quot;스파게티와 같은&quot;외관을 가져야한다. </li><li> 세관은 튜브의 바닥에 ~ 5 분에 정착 할 수 있습니다. 상층 액을 붓고 세관은 튜브의 바닥에 각각의 시간을 정착 할 수 있도록 (실온에서) 25 ㎖를 크렙스 버퍼에 배를 세척한다. 각 튜브 ~ 5 ㎖ 크렙스 버퍼를 남겨주세요. </li><li> 세탁은, 당신이 정 세관을 추가하려는 직전에 팔콘 튜브에 50 ㎖ 크렙스 버퍼에 30 밀리그램의 트립신을 추가하는 동안. 이 솔루션은 몇 분 동안 33 ° C까지 가열 할 수 있습니다. 두 50 ML 원뿔 튜브에 균등하게 분할합니다. </li><li> 25 ㎖의 세관을 포함하는 두 개의 튜브의 각 트립신 솔루션을 추가합니다. 셀을 방지하기 위해 각각의 튜브에 3 μg의 DNA 분해 효소 (1 μg/10ml)를 추가응집에서의. 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. </li><li> 약 10 배의 상품을 피펫 팅, 세관을 포함하는 용액을 교반의 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 이 솔루션은 더 많은 단일 세포 현탁액과 같이 시작한다. </li><li> 추가로 10 분 동안 33 ° C에서, 동요, 품어. 약 25 배의 상품을 피펫 팅, 단일 세포 현탁액에 세관을 분산 넓은 구멍 피펫을 사용합니다. 당신이 아직도 세관 또는 세포 덩어리를 많이 볼 경우, 피펫으로 더 분산 및 / 또는 각 튜브에 또 다른 3 μg의 DNA 분해 효소 (더블 초기 농도)를 추가합니다. </li><li> 100 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너 (30 ㎖의 세포 현탁액을 각 튜브에 대해 하나)을 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터. 세포 현탁액을 결합하고 세포의 총 수 (10 × 13 7-8 사이 셀이어야한다) 센다. *** 그라데이션에 이상 800,000,000 세포를 넣지 마십시오. </li><li> 2.10 단계에서 얻은 세포 수에 기초하여, appropr 펠렛늦었 5 분 450 RCF에서 필터링 된 세포의 부피 30 ㎖ 크렙스 버퍼로 세척. 반복합니다. *** 보통 22 고환 이상 800,000,000 세포를 얻을 수 있지만 세포의 수보다 더로드되지 않습니다. </li><li> 조심스럽게 기포를 생성하지 않고 (세포 응집의 정도에 따라) DNA 분해 효소 μg 2.5에서 5 사이를 함유하는 25 ㎖의 0.5 % BSA에서 세포를 재현 탁. 세포가 응집하지 않도록합니다. 100 μm의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 단일 ​​세포 현탁액을 필터링합니다. 세포는 이제로드 할 준비가되어 있습니다. 튜브를 몇 번 반전로드하기 전에 잘 섞는다. </li></ol> 3. 셀 로딩 및 침전 <ol><li> 반드시 마개가 닫혀 있는지,하지만 액체가 침전 실 (그림 1D)에 셀 챔버 (그림 1A)로부터의 정보 흐름을 허용 할 위치에서 확인합니다. </li><li> 낮은 설정 교반 막대가 지속적으로 이동 할 수 있도록 (약 70 RPM)에 모두 교반 막대 판을 돌려, 그러나 천천히. </li><li> 셀 챔버 (도 1a)에 세포 현탁액을 넣고 세포를 10 ㎖ / 분 (도 1D)의 속도로 침강 챔버 내로 서서히 유동되도록 스톱 콕을 열어. 마개를 닫습니다. 유속은 침강 실에 체적 간격을 표시함으로써 결정될 수있다. </li><li> 셀 챔버에 0.5 % BSA 용액 5 ㎖을 넣고 10 ㎖ / 분의 속도로 침강 챔버로 흘려. 마개를 닫습니다. 이 단계는 세포 챔버로부터 세포를 세척한다. 배를 반복합니다. </li><li> 그라데이션을 준비 셀 챔버 (그림 1A)와 두 개의 2 L 실린더 (그림 1B 및 C)의 클램프를 열고, 40 ㎖ / 분의 속도 (그림 1D)에서 침강 실에 액체를 배출하기 시작 즉시. 그것은 침전 챔버로 BSA 구배를로드하는 데 약 20 ~ 30 분 소요되도록 유량을 조절합니다. 상단에 거짓말 세포의 얇은, 흐트러 층BSA 그라데이션 볼 수 있어야합니다. BSA의 대부분이로드되면, 마개를 닫고 액체가 분별 튜브에 침전 챔버에서 배출 할 수 있도록 위치로 돌립니다. </li><li> 볶음 판을 끕니다. </li><li> 세포가 1 시간 45 분 동안 침전 할 수 있습니다. 이 시간 동안 장치를 방해하지 않습니다. 기계적 교반 그라데이션을 방해 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 분수의 분류 및 분석 다음 단계를 수행 ***, 그라데이션을 방해하지 않도록주의하십시오. BSA 구배 방해가되는 경우, 절차는 작동하지 않을 것이다! <ol><li> 세포가 침전 한 후, 천천히 50 ML 원뿔 튜브에 침전 실에서 50 ㎖를 배출하고 따로 설정합니다. 이 부분은 일반적으로 세포와 파편의 원치 않는 덩어리가 포함되어 있습니다. </li><li> 분수의 집에 분수 튜브를 연결합니다. *** 그것은 손으로 분수를 수집 할 수도 있습니다 경우 분수 콜레ctor에 사용할 수 없습니다. </li><li> 분수를 수집 : 10 ㎖ (한 포집 관을 채우는)가 매 45 초를 수집되도록 꼭지와 유량을 조절합니다. </li><li> 분수 수집 관을 씌우고 4 ℃에서 450 RCF에서 5 분 동안 회전 조심스럽게 뜨는을 붓고 나머지 액체에 세포를 재현 탁하고, 얼음에 세포를 유지. </li><li> 모든 분수가 수집되면, 현미경으로 다른 세포 집단의 분수를 분석 할 수 있습니다. 상이한 세포 유형은 세포의 크기 및 핵 형태학 8,15 기반으로 구별 될 수있다. 2 (a) 체세포와 감수 세포 정조 세포에 대해 충실 세 풀링 된 분획은 &quot;대표 결과&quot;, (b) 라운드 정자 등을 도시하는데,도 (C) 길게과 정자를 응축. <ul><li> 정조 세포 유형은 12-14μm 캘리포니아입니다. 직경 및 염색질 조성 동질 둥근 핵이있다. </li><li> B 형 정조 세포는 8 9μm 캘리포니아입니다. 직경과 둥근 목 한핵 주변을 따라 더 밀도가 이질 염색질을 보여 D 핵. </li><li> 사전 leptotene의 정모 세포는 7.5-8.2μm 캘리포니아입니다. 직경, B 형 정조 세포보다 세포질을 가지고 있고, B 형 정조 세포와 유사한 모양의 핵이있다. </li><li> Leptotene 차 정모 세포는 8 ~ 10 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 사전 leptotene의 정모 세포의 것과 유사하지만, 핵 막에 더 조밀 한 염색질을 얻을 것 같다 핵이있다. </li><li> 접합기에 이어지는시기로 차 정모 세포는 10 ~ 12 μm의 캘리포니아 있습니다. 직경 및 leptotene 차 정모 세포의 것과 유사 핵이있다. </li><li> Pachytene의 정모 세포 어디서나 12 ~ 18 μm의 캘리포니아에서입니다. 직경과 큰 핵 주변 세포질의 얇은 테두리로 구성되어 있습니다. 조밀 염색질 이상의 덩어리가 핵에서 볼 수있다. </li><li> 원형 정자는 10 ㎛ 캘리포니아입니다. 직경이 중간에 밀집 염색 chromocenter 라운드 핵이있다. </li><li> 잔여체는 직경이 6.5 μm의 원형이며, 핵이 부족 ~하다. </li><li> 길게 및 응축 정자는 정자를 둥글게 크기가 비슷하지만, 고유, 낫 모양의 핵이있다. </li></ul><ol><li> 분수 15로 시작하는 85까지 매 5 분수를 분석 할 수 있습니다. 보통, 15 이하 분수도 혼합 덩어리 진 것입니다, 그리고 85 위의 분수없이 사용할 수있는 세포에 몇 가지를 포함합니다. </li><li> 분수 수집 관 (세포를 원심 분리 후 재 부유 한 후)에서 액체의 5UL을 가지고 크렙스 버퍼에 8 %의 포름 알데히드의 5UL에 추가 부분을 분석 할 수 있습니다. 고정 된 세포는 실온에서 5 분 앉아 할 수 있습니다. </li><li> 고정 된 세포에 0.1 % 트리톤과 DAPI (5 μ / ㎖ 크렙스 버퍼)의 5UL를 추가합니다. 세포를 5 분 동안 실온에서 앉을 수있다. </li><li> 슬라이드 상에 생성 된 용액 10 μl를 놓고 커버 슬립으로 덮고, 각 분획의 순도를 결정하기 위하여 형광 현미경으로 분석한다. </li><li> 감수 분열과 체세포 이배체 세포, 둥근 정자, 그리고 길게 / 응축 정자 : 크기와 핵 형태에서 유사 세포의 다음 인구를 만들 수있는 ( &quot;대표 결과&quot;참조) 분수를 결합합니다. </li></ol></li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 설명하는이 프로토콜은 실험실 생쥐의 사용을 포함하고 모든 관련 지침, 규정 및 규제 기관 준수에 실행되었다. 이 프로토콜에 사용되는 동물은 펜실베니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학 (IACUC 프로토콜 # 804284)의지도와 승인 아래에 유지됩니다.

신뢰할 수있는 세포 배양 시스템은 아직 모든 정자 형성 세포 유형 3을 생성하는 존재하지 않는 정자를 연구하는 사람들은 정자 형성 세포 샘플에 대한 동물 모델에 의존하고 있습니다. 정자 형성 세포가 쉽게 전체 고환에서 수집되어 있지만, 단지 혼합 인구가 발생합니다. 이는 감수 세포, 둥근 정자 및 응축 정자 등이 세포의 특정 아형을 공부하고자하는 사람들을위한 문제가있다. 세 가...

포유류의 정자는 고환 1의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 간단히, 정액을 운반하는 가느 다란 분할의 상피 세포 근처에있는 정조 세포를 같은 줄기 후 감수 분열을 거쳐 정모 세포로 분화. 감수 분열이 완료되면, 그 결과 반수체 세포, 또는 원형 정자는 spermiogenesis, 세포질과 핵의 압축 흘림을 포함하는 분화 과정을 겪는다. 정자는 점차적으로 각각 편모를 개발하고 핵의 신장 및 응축을 받다, 길게 한 후 응축 정자를 생산. 최종 제품은 정소 세관 및 궁극적으로 더 성숙 부고환으로의 루멘 내로 방출되는 정자이다. 정자의 과정에서 특별한 호르몬 분자 조건에 의존하기 때문에고환은 정자의 전체 프로세스에 대한 신뢰할 수있는 체외 배양 시스템은 아직 2,3를 개발되지 않았습니다. 배양 방법은 줄기 세포에서 &quot;원시 생식 세포 유사 세포&quot;및 반수체, &quot;라운드 spermatid 같은 세포&quot;를 만들기 위해 개발되었지만, 이들 방법은 아직 이러한 세포를 다수 생성하여 저장 정자 형성 세포를 생산하는 데 실패 할 수 없다 유형 4.5. 다행히도, 정자 형성 세포 유형은 액체 구배로 분리 될 전체 정소로부터 얻어진 단일 세포 현탁액을 허용하는 크기가 상당히 다르다. STA-PUT 방법은 여기에 설명, 크기와 질량 6-9에 따라 정자 형성 세포를 분리하기 위해 선형 BSA의 그라데이션과 간단한 침을 사용합니다. FACS 및 elutriation 10-13 : STA-PUT 방법은 정자 형성 세포 유형을 구분하는 다른 두 가지 가장 널리 사용되는 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. STA-PUT 장치는 ONL 필요전문 유리의 Y 여러 조각 추운 방이나 대형 냉장고에 조립. 따라서, 셀 소터 나 elutriator를 사용하는 것보다 덜 비싸다. 각 세포 집단의 순도는 FACS 11로 얻은만큼 높지는 않지만 STA-PUT 방법은, 세포 분류와 비교할 시간 프레임에서 FACS에 의해 분류 될 수있는 것보다 정소 당 세포의 높은 금액을 산출한다. 셀 (자기 활성화 된 셀 정렬, MACS)이 최근 성공적으로 혼합 고환 세포 인구에서 정조 세포의 농축을 위해 사용되어왔다, 그러나 14 마커 적절한 표면의 지식의 부족으로 인해 정모 세포 또는 정자를 분리하는 현재 적합하지 않은 자석 구슬을 이용하여 정렬. FACS 나 MACS 이상의 STA-PUT 방법의 또 다른 장점은 대부분 FACS 프로토콜과 대조적으로, 어떤 DNA 또는 염색 다른 타입을 필요로하지 않기 때문에 이후의 배양에 적합 가능한 세포를 분리 할 수​​있는 능력이다. L을 필요로 연구를위한정자 형성 세포 유형의 아게 수율은 ~ 90 %의 순도, STA-PUT 이상적인 방법입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">BSA</td>
			<td style="width:109px;">Affymetrix/USB</td>
			<td style="width:255px;">10857 100MG</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">0.5%, 2%, and 4% BSA solutions</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="91">
			<td height="91" style="height:91px;width:311px;">KREBS (10x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20</td>
			<td style="width:183px;">Autoclave/filter and store at 4 &#176;C for several months.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:311px;">KREBS (1x)</td>
			<td colspan="2" style="width:364px;">Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.</td>
			<td style="width:183px;">To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Collagenase</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">C9891-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">DNAse</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">DNEP-5MG</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="35" rowspan="2" style="height:35px;width:311px;">Trypsin</td>
			<td rowspan="2" style="width:109px;">Sigma</td>
			<td rowspan="2" style="width:255px;">T9201-1G</td>
			<td rowspan="2" style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="18">
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">DAPI</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Triton-X100</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Formaldehyde (~37%)</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">TABLE 2: EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;"> </td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Equipment</td>
			<td style="width:109px;">Company</td>
			<td style="width:255px;">Catalog #</td>
			<td style="width:183px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:311px;">Complete STA-PUT apparatus</td>
			<td style="width:109px;">ProScience Glass Shop</td>
			<td style="width:255px;">STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)</td>
			<td style="width:183px;">Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">10 &#956;m mesh filter</td>
			<td style="width:109px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:255px;">22363549</td>
			<td style="width:183px;"> </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Mouse dissection tools</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:311px;">14 ml round bottom fraction collection tubes with caps</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher </td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td colspan="3" height="22" style="height:22px;width:547px;">Need approximately 100 tubes</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:311px;">Fraction collector</td>
			<td style="width:109px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:255px;">Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40</td>
			<td style="width:183px;">Alternate can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Microscope slides, cover glass</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:311px;">Light/Fluorescent Microscope</td>
			<td colspan="3" style="width:547px;">Preference of researcher</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of spermatogenic cell types using sta-put velocity sedimentation

포유류의 정자는 고환의 정 세관에서 여러 단계에서 발생하는 복잡한 분화 과정이다. 현재, 체외에서 정자 형성 차별화 있도록 신뢰성있는 세포 배양 시스템은없고, 정자 형성 세포의 대부분의 생물학적 연구는 마우스와 쥐와 같은 동물 모델에서 조직 수확을 필요로합니다. 비 정자 형성 (간질, 세르 톨리, 골수, 상피 세포) 및 정자 형성 모두 (정조 세포, 정모 세포, 둥근 정자, 정자 및 정자를 응축) - - 고환은 많은 종류의 세포가 포함되어 있기 때문에 정자에 관련된 생물학적 메커니즘 연구를 분리해야 이들 상이한 세포 유형의 농축. 이 경우, 고환에서 - - 선형 BSA 그라데이션을 통해 STA-PUT 방법은 세포의 이종 집단의 분리를 허용한다. 개별 세포 유형은 CE에 따라 다른 침강 속도로 침강LL 사이즈, 및 다른 세포 유형의 농축 분획을 수거하고 추가 분석에 이용 될 수있다. STA-PUT 방법은 특정 셀 정렬 방법으로 수득 될 수있는 예를 들어 세포 유형의 고도로 순수한 분획물을 초래하지 않지만, 각 분획의 전체 세포의 더 높은 수율을 제공 않는다 (7 ~ 8 × 10 8 세포의 시작 인구에서 ~ 1 × 108 세포 / 정자 형성 세포 유형). 이 고수익 방법은 전문 유리를 필요로하고 형광 활성화 된 셀 분류기 (FACS) 또는 elutriator 같은 전문 장비에 대한 액세스가 제한 실험실을위한 이상적인 방법하고, 어떤 차가운 방이나 대형 냉장고에 수행 할 수 있습니다.

STA-PUT 절차에서 이상적인 결과는 셀의 크기 및 밀도에 기초하여 세포의 고환에서 상당히 눈에 띄는 박리이다. 정소로부터 격리 세포 BSA 그라데이션을 통해 침전되는 동안, 셀들의 몇몇 뚜렷한 밴드가 관찰 될 수있다. 세포 덩어리는 상관 그라데이션의 바닥에 가라 그리고 다른 분획을 오염되지 경향이있다. 좀 더 그라데이션까지 대형 체세포 및 감수 세포 될 것입니다. 멀리 그라데이션까지 아직?...

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Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다.

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

separation-spermatogenic-cell-types-using-sta-put-velocity

Research

JoVE Journal

Biology

25.6K 조회수.  University of Pennsylvania.  STA-PUT 방법은 크기와 밀도에 따라 정자 형성 세포의 다른 인구의 분리 할 수​​ 있습니다. 

비디오: Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

연구

생물학

Electrophoretic Separation of Proteins

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to investigate subunit compositions, and to verify homogeneity of protein samples. It can also serve to purify proteins for use in further applications. In polyacrylamide gel electrophoresis, proteins migrate in response to an electrical field through pores in a polyacrylamide gel matrix; pore size decreases with increasing acrylamide concentration. The combination of pore size and protein charge, size, and shape determines the migration rate of the protein. In this unit, the standard Laemmli method is described for discontinuous gel electrophoresis under denaturing conditions, i.e., in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS). 

In this video, we demonstrate a method for electrophoretic separation of proteins using poly-acrylimide gel electrophoresis (PAGE).

단백질의 전기 영동 분리

Electrophoresis is used to separate complex mixtures of proteins (e.g., from cells, subcellular fractions, column fractions, or immunoprecipitates), to ...

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension and microscopically visualize sperm accumulation around the pipette1. Sperm chemoattraction in vertebrates such as frogs, rodents and humans is more difficult to detect and requires quantitative assays. Such assays are of two major types - assays that quantitate sperm movement to a source of chemoattractant, so-called sperm accumulation assays, and assays that actually track the swimming trajectories of individual sperm.
Sperm accumulation assays are relatively rapid allowing tens or hundreds of assays to be done in a single day, thereby allowing dose response curves and time courses to be carried out relatively rapidly. These types of assays have been used extensively to characterize many well established chemoattraction systems - for example, neutrophil chemotaxis to bacterial peptides and sperm chemotaxis to follicular fluid. Sperm tracking assays can be more labor intensive but offer additional data on how chemoattractancts actually alter the swimming paths that sperm take. This type of assay is needed to demonstrate the orientation of sperm movement relative to the chemoattrractant gradient axis and to visualize characteristic turns or changes in orientation that bring the sperm closer to the egg.
Here we describe methods used for each of these two types of assays. The sperm accumulation assay utilized is called a "two-chamber" assay. Amphibian sperm are placed in a tissue culture plate insert with a polycarbonate filter floor having 12 &mu;m diameter pores. Inserts with sperm are placed into tissue culture plate wells containing buffer and a chemoatttractant carefully pipetted into the bottom well where the floor meets the wall (see Fig. 1). After incubation, the top insert containing the sperm reservoir is carefully removed, and sperm in the bottom chamber that have passed through the membrane are removed, pelleted and then counted by hemocytometer or flow cytometer.
The sperm tracking assay utilizes a Zigmond chamber originally developed for observing neutrophil chemotaxis and modified for observation of sperm by Giojalas and coworkers2,3. The chamber consists of a thick glass slide into which two vertical troughs have been machined. These are separated by a 1 mm wide observation platform. After application of a cover glass, sperm are loaded into one trough, the chemoattractant agent into the other and movement of individual sperm visualized by video microscopy. Video footage is then analyzed using software to identify two-dimensional cell movements in the x-y plane as a function of time (xyt data sets) that form the trajectory of each sperm.

Eggs and the extracellular coatings around eggs frequently release peptides, proteins and small molecules that communicate with sperm to guide them to the egg thereby promoting fertilization. Using frog sperm we describe and compare two classes of assays used to detect sperm chemoattraction &#x2013; sperm accumulation assays and sperm tracking assays.

감지 개구리 정자 Chemoattraction에 대한 Assays 두 종류의

Sperm chemoattraction in invertebrates can be sufficiently robust that one can place a pipette containing the attractive peptide into a sperm suspension ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from the seaweed genera Gelidium and Gracilaria, and consists of repeated agarobiose (L- and D-galactose) subunits2. During gelation, agarose polymers associate non-covalently and form a network of bundles whose pore sizes determine a gel&#39;s molecular sieving properties. The use of agarose gel electrophoresis revolutionized the separation of DNA. Prior to the adoption of agarose gels, DNA was primarily separated using sucrose density gradient centrifugation, which only provided an approximation of size. To separate DNA using agarose gel electrophoresis, the DNA is loaded into pre-cast wells in the gel and a current applied. The phosphate backbone of the DNA (and RNA) molecule is negatively charged, therefore when placed in an electric field, DNA fragments will migrate to the positively charged anode. Because DNA has a uniform mass/charge ratio, DNA molecules are separated by size within an agarose gel in a pattern such that the distance traveled is inversely proportional to the log of its molecular weight3. The leading model for DNA movement through an agarose gel is &#34;biased reptation&#34;, whereby the leading edge moves forward and pulls the rest of the molecule along4. The rate of migration of a DNA molecule through a gel is determined by the following: 1) size of DNA molecule; 2) agarose concentration; 3) DNA conformation5; 4) voltage applied, 5) presence of ethidium bromide, 6) type of agarose and 7) electrophoresis buffer. After separation, the DNA molecules can be visualized under uv light after staining with an appropriate dye. By following this protocol, students should be able to: 
 
1. Understand the mechanism by which DNA fragments are separated within a gel matrix 
2. Understand how conformation of the DNA molecule will determine its mobility through a gel matrix 
3. Identify an agarose solution of appropriate concentration for their needs 
4. Prepare an agarose gel for electrophoresis of DNA samples 
5. Set up the gel electrophoresis apparatus and power supply 
6. Select an appropriate voltage for the separation of DNA fragments 
7. Understand the mechanism by which ethidium bromide allows for the visualization of DNA bands 
8. Determine the sizes of separated DNA fragments 
&#160;

A basic protocol for the separation of DNA fragments using agarose gel electrophoresis is described.

의 DNA 조각의 분리를위한 아가로 오스 젤 전기 영동

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of protein-bound DNA and aligning the short reads to a reference genome. Enriched regions are revealed as peaks, which often differ dramatically in shape, depending on the target protein1. For example, transcription factors often bind in a site- and sequence-specific manner and tend to produce punctate peaks, while histone modifications are more pervasive and are characterized by broad, diffuse islands of enrichment2. Reliably identifying these regions was the focus of our work.
Algorithms for analyzing ChIPseq data have employed various methodologies, from heuristics3-5 to more rigorous statistical models, e.g. Hidden Markov Models (HMMs)6-8. We sought a solution that minimized the necessity for difficult-to-define, ad hoc parameters that often compromise resolution and lessen the intuitive usability of the tool. With respect to HMM-based methods, we aimed to curtail parameter estimation procedures and simple, finite state classifications that are often utilized.
Additionally, conventional ChIPseq data analysis involves categorization of the expected read density profiles as either punctate or diffuse followed by subsequent application of the appropriate tool. We further aimed to replace the need for these two distinct models with a single, more versatile model, which can capably address the entire spectrum of data types.
To meet these objectives, we first constructed a statistical framework that naturally modeled ChIPseq data structures using a cutting edge advance in HMMs9, which utilizes only explicit formulas-an innovation crucial to its performance advantages. More sophisticated then heuristic models, our HMM accommodates infinite hidden states through a Bayesian model. We applied it to identifying reasonable change points in read density, which further define segments of enrichment. Our analysis revealed how our Bayesian Change Point (BCP) algorithm had a reduced computational complexity-evidenced by an abridged run time and memory footprint. The BCP algorithm was successfully applied to both punctate peak and diffuse island identification with robust accuracy and limited user-defined parameters. This illustrated both its versatility and ease of use. Consequently, we believe it can be implemented readily across broad ranges of data types and end users in a manner that is easily compared and contrasted, making it a great tool for ChIPseq data analysis that can aid in collaboration and corroboration between research groups. Here, we demonstrate the application of BCP to existing transcription factor10,11 and epigenetic data12 to illustrate its usefulness.

Our Bayesian Change Point (BCP) algorithm builds on state-of-the-art advances in modeling change-points via Hidden Markov Models and applies them to chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIPseq) data analysis. BCP performs well in both broad and punctate data types, but excels in accurately identifying robust, reproducible islands of diffuse histone enrichment.

다양한 ChIPseq 데이터 유형의 게놈 차원의 분석을위한 소설 베이지안 변경 - 포인트 알고리즘

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Separation of Mouse Embryonic Facial Ectoderm and Mesenchyme

Orofacial clefts are the most frequent craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal facial development3. In human and mouse, initial growth and patterning of the face relies on several small buds of tissue, the facial prominences4,5. The face is derived from six main prominences: paired frontal nasal processes (FNP), maxillary prominences (MxP) and mandibular prominences (MdP). These prominences consist of swellings of mesenchyme that are encased in an overlying epithelium. Studies in multiple species have shown that signaling crosstalk between facial ectoderm and mesenchyme is critical for shaping the face6. Yet, mechanistic details concerning the genes involved in these signaling relays are lacking. One way to gain a comprehensive understanding of gene expression, transcription factor binding, and chromatin marks associated with the developing facial ectoderm and mesenchyme is to isolate and characterize the separated tissue compartments.
Here we present a method for separating facial ectoderm and mesenchyme at embryonic day (E) 10.5, a critical developmental stage in mouse facial formation that precedes fusion of the prominences. Our method is adapted from the approach we have previously used for dissecting facial prominences7. In this earlier study we had employed inbred C57BL/6 mice as this strain has become a standard for genetics, genomics and facial morphology8. Here, though, due to the more limited quantities of tissue available, we have utilized the outbred CD-1 strain that is cheaper to purchase, more robust for husbandry, and tending to produce more embryos (12-18) per litter than any inbred mouse strain8. Following embryo isolation, neutral protease Dispase II was used to treat the whole embryo. Then, the facial prominences were dissected out, and the facial ectoderm was separated from the mesenchyme. This method keeps both the facial ectoderm and mesenchyme intact. The samples obtained using this methodology can be used for techniques including protein detection, chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, microarray studies, and RNA-seq.

A protocol for separation of embryo facial ectoderm and mesenchyme is described. We use Dispase II to treat whole embryos first, dissect whole facial prominences out, and then separate the facial ectoderm and mesenchyme.

마우스 배아 얼굴 외배엽과 Mesenchyme의 분리

 Orofacial clefts are the most frequent  craniofacial defects, which affect 1.5 in 1,000 newborns worldwide1,2. Orofacial clefting is caused by abnormal ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical proteins, such as antibodies, vaccine candidates and enzymes. These must be purified from the plant biomass but chromatography steps are hindered by the high concentrations of host cell proteins (HCPs) in plant extracts. However, most HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C facilitating subsequent purification of the target protein. Here, three methods are presented to achieve the heat precipitation of tobacco HCPs in either intact leaves or extracts. The blanching of intact leaves can easily be incorporated into existing processes but may have a negative impact on subsequent filtration steps. The opposite is true for heat precipitation of leaf extracts in a stirred vessel, which can improve the performance of downstream operations albeit with major changes in process equipment design, such as homogenizer geometry. Finally, a heat exchanger setup is well characterized in terms of heat transfer conditions and easy to scale, but cleaning can be difficult and there may be a negative impact on filter capacity. The design-of-experiments approach can be used to identify the most relevant process parameters affecting HCP removal and product recovery. This facilitates the application of each method in other expression platforms and the identification of the most suitable method for a given purification strategy.

Three heat precipitation methods are presented that effectively remove more than 90% of host cell proteins (HCPs) from tobacco extracts prior to any other purification step. The plant HCPs irreversibly aggregate at temperatures above 60 &#176;C.

본래 식물을 표백제로 또는 추출물의 열처리에 의한 담배 숙주 세포 단백질 제거 방법의 비교

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

거대한 바이러스 혼합물 분리를 위한 형광 활성화 세포 분류에 대한 대체 전략으로서의 단일 세포 마이크로 포부

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Methods Article

STA-PUT 속도의 침전을 사용하여 정자 형성 세포 유형의 분리