저자는 동물들과 함께 그녀의 도움을 안정화 siRNA의 솔루션과 헤더 토빈을 준비하는 마이클 골드버그에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 DEI에 DOD 혁신​​ 상 W81XWH - 08 - 1-0659에 의해 투자되었다. SK의 박사 학위 취득 후 교육을 수잔 G 코멘 재단 (KG101329)에 의해 지원되었다. 저자는 설계도의 준비를 위해 크리스틴 존슨에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 주입 용액의 제조 <ol><li> 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 관심의 다른 수용액에 0.2 % 에반스 블루 염료를 준비합니다. 이 중요한 염료 췌관 주사의 성공을 평가하는 데 유용합니다 및 기술에 대한 전문 지식을 개발할 때 시각화 원조로 추천합니다. </li></ol> 필요한 부피가 주입되는 동맥의 개수 및 위치에 의존 할 것이다. 암컷 생쥐의 10 유방 동맥 주입 할 수 있지만 인해 작은 선 (腺)의 크기로, 선 쌍 1과 5는 일반적으로 용액 10 μL로 주입된다. 다른 모든 유방 쌍은 20 μL로 주입된다. 이 볼륨은 전체 유관 트리를 채우기에 충분하다. 2. 수술 전 준비 <ol><li> 각 마우스의 체중을 기록한다. 모든 임상 연구에서와 같이, 동물의 무게는 잠재적 인 독성을 평가하기 위해 (일주일에 두 번 이상) 정기적으로 모니터링해야한다. </li><li> m를 마취이소 플루 란 챔버를 사용하여 여러개 눈 윤활제를 적용합니다. 절차를 수행하는 동안 마우스는 코 콘을 통해 산소 이소 플루 란의 흡입 2~4% 농도를 사용하여 마취 할 것입니다. 조심스럽게 따라 이소 플루 란의 수준을 조절, 호흡의 변화에​​ 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 피하 전에 진통제 등의 절차에 멜 록시 캄 (5 ~ 10 ㎎ / ㎏)을 주입한다. </li><li> 유두 영역에 이상 - 더 - 카운터 제모 크림을 적용합니다. 5 분을 기다린 후 부드럽게 원 운동을 사용하여,면 - 팁 어플리케이터 느슨한 머리를 제거합니다. 따뜻한 물에 젖은 축축한 종이 타월을 사용하여 크림을 제거합니다. 면도로 인해 유두를 손상의 위험을 권장하지 않습니다. </li><li> 부드럽게 사지를 테이핑하여 입체경에서 마우스를 고정합니다. </li><li> 알코올 면봉으로 닦아 주사 부위. </li></ol> 3. 췌관 내 주입 <ol><li> 입체경 아래에 주입하는 적절한 젖꼭지를 찾습니다. 뽐내는 마이크로 해부 벌금을 사용하여젖꼭지 입구를 덮고 죽은 피부를 제거하는 zers. </li><li> 부착 된 33 G 금속 허브 바늘로 50 μL 주사기에로드 주입 솔루션의 20 μL. 때때로, 주사 후, 소량 (1 μL 이하) 바늘을 잡아 당겨에 젖꼭지 밖으로 누출 수 있습니다. 따라서, 잠재적 인 손실을 고려하여 각각 11, 21 μl를 주입하는 것이 좋습니다. </li><li> 미세 핀셋으로 가볍게 유두를 잡고 삽입을 위해 위치를 약간 들어 올립니다. 그것은 유두를 잘라 필요가 없습니다. </li><li> 급속 유관 루멘 내에 유체를 이동으로 인한 잠재적 인 손상을 최소화하기 위해 천천히 용액을 주입한다. 사출 속도는 약 40 μL / 분으로 유지되어야한다. </li></ol> 4. 수술 후 관리 <ol><li> 주사 부위를 관찰한다. 젖꼭지 지역 또는 주변 조직에 외상의 흔적이 없어야합니다. 유두 주변 지역의 붓기 가능성이 유방 지방 패드 주입 신속한를 나타냅니다성공적인 췌관 주사보다 연구. </li><li> 코 콘에서 동물을 제거하고 복구를위한 별도의 케이지로 이동합니다. 저체온증을 방지하고 회복을 지원하기 위해 가열 램프 아래에 케이지를 놓습니다. 마우스는 단독으로 보관되어 그들은 의식과 이동성을 회복 할 때까지주의 깊게 감시한다. </li></ol> 5. 유선 조직의 분석 <ol><li> 조사 종료 후, 마우스는 분리 챔버에서 CO 2 압축 가스는 다음의 경추 탈구하여 안락사된다. 젖샘은 절제하고 전체 마운트 제조 11, 조직학, 또는 RNA와 단백질의 분리를 위해 사용될 수있다. </li></ol>

<ol>
	<li>Dooley, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+lavage+for+detection+of+cellular+atypia+in+women+at+high+risk+for+breast+cancer.">Ductal lavage for detection of cellular atypia in women at high risk for breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 93, 1624-1632 (2001).</li><li>Jacobs, L., Sukumar, S., Stearns, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraductal+therapy+for+the+prevention+of+breast+cancer.">Intraductal therapy for the prevention of breast cancer.</a> Curr Opin Investig Drugs. 11, 646-652 (2011).</li><li>King, B. L., Love, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraductal+approach+to+the+breast:+raison+d'etre.">The intraductal approach to the breast: raison d'etre.</a> Breast Cancer Res. 8, 206 (2006).</li><li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductal+access+for+prevention+and+therapy+of+mammary+tumors.">Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors.</a> Cancer Res. 66, 638-645 (2006).</li><li>Stearns, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+and+clinical+evaluation+of+intraductally+administered+agents+in+early+breast+cancer.">Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer.</a> Sci Transl Med. 3, 106ra108 (2011).</li><li>Flanagan, M., Love, S., Hwang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+of+Intraductal+Therapy+for+Ductal+Carcinoma+in+Situ.">Status of Intraductal Therapy for Ductal Carcinoma in Situ.</a> Curr Breast Cancer Rep. 2, 75-82 (2010).</li><li>Nguyen, D. -. A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C., Ip, M. M., Asch, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in mammary gland biology and breast cancer research. , 259-270 (2000).</li><li>Behbod, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intraductal+human-in-mouse+transplantation+model+mimics+the+subtypes+of+ductal+carcinoma+in+situ.">An intraductal human-in-mouse transplantation model mimics the subtypes of ductal carcinoma in situ.</a> Breast Cancer Res. 11, R66 (2009).</li><li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 401-404 (2009).</li><li>Reddy, J. P., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RCAS-TVA+system+for+introduction+of+oncogenes+into+selected+somatic+mammary+epithelial+cells+in+vivo.">The RCAS-TVA system for introduction of oncogenes into selected somatic mammary epithelial cells in vivo.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14, 405-409 (2009).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+mammary+gland+development+and+function+in+mouse+models.">Evaluation of mammary gland development and function in mouse models.</a> J. Vis. Exp. , e2828 (2011).</li></ol>

저자는 재정적 공시가 없습니다.

형질 전환 및 녹아웃 마우스는 유방암의 개별 유전자의 생체 내 역할을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 그러나, 많은 비용과 시간이 소요되는 이러한 동물을 생성 할 수 있으며 유전자 녹다운 때때로 유선 해당 유전자의 특정 효과를 인식 저희 배제하는 통상 유비쿼터스이다. 따라서, 대상 최저 다른 장기에 비 특정 부작용과 독성의 문제를 완화하는 것이다. 여기에 소개 된 siRNA의 췌관 주입 마우스 유방 동맥의 지역화 된 유전자 최저 수 있습니다. 그것은 siRNA를 전달로 제한되지 유선에 대한 대상 및 지역화 된 약물 전달을위한 빠른 방법입니다. 이러한 유선 특정 약물 전달은 다른 장기에 불특정 부작용 및 독성을 방지하고 유선의 발달과 유방 종양을 형성하는 동안 특정 시간 지점에서 유전자 변화를 연구 할 수 있습니다. SI의 증거는 없다비 주입 땀샘에서 RNA 입자 간 또는이 방법이 유선에서 지역화 된 유전자 최저에 대한 선호하는 방법을 제공합니다 추가 증거를 제공하는 다른 기관. 또한, 췌관 주사 치료제 장기간 모니터링을 허용하도록 수개월 동안 매주 또는 격주로 반복 될 수있다. 이 기술은 마우스 유방 덕트 다양한 시약 췌관 대금 시금위한 가능성을 연다. 잘 특성화 마우스 모델에서 현지화 된 배달의 발전은 비 침습의 응용 프로그램을 가속한다, 인간의 치료 전략을 대상으로.

마우스 유방 선은 젖꼭지에서 중앙 덕트에 수렴 복잡한 유관-폐포 나무로 구성되어있다. 마우스뿐만 아니라 인간, 유방 종양의 대부분은 우유 덕트 안감 상피 세포에서 유래. 현재 가능한 치료는 정맥 화학 요법, 방사선 및 수술을 포함한다. 현지화 된 췌관 치료는 1-3 탐구 감소 독성과 부작용의 측면에서 상당한 이점을 제공하고 있습니다. 이러한 널리 적용 할 수 있습니다 전에 그러나, 몇 가지 과제가 남아있다. 마우스 유방 동맥의 비교 절차를 수행 할 수있는 능력은 췌관 개입의 특성을 용이하게한다. 여기에 우리가 직접 마우스 유방 덕트에 시약의 전달을위한 비 침습적 인 방법을 제시한다. 유방암 환자와 마우스 모델 모두에서 화학 요법 제의 췌관 배송은 이전의 증거와 매우 효과적인 것으로 표시되었습니다독성 또는 장기 조직 병리학 적 3-6을 변경합니다. 또한, 종양 세포 주입 및 암 유전자의 렌티 바이러스 벡터 배달 이전에 췌관 주입 7-10을 통해 가능한 것으로 표시되었습니다. 약물 전달뿐만 아니라,이 절차는 siRNA를 췌관 내 주입을 통해 유선 유전자의 지역 침묵에 유용합니다. siRNA의 솔루션의 작은 볼륨의 주입은 유선의 해부학과 생리학을 변경하지 않으면 효과가있다. 우리의 실험실에서 우리는 최근에 자발적으로 (브록 등., 게시되지 않은) 종양의 진행의 예방의 결과로 유방 종양을 개발하는 형질 전환 마우스의 주요 매개체 유전자의 성공적인 침묵을 보여 주었다. 우리는 눈에 보이는 조직의 손상 또는 독성 2 주 간격으로 7 번까지 같은 젖꼭지에 격주 주사를 반복 할 수있게되었습니다. 췌관 내 주사는 DEVEL를 해결하기 위해 성인 마우스를 초과 할 수임신, 수유 및 퇴화 동안이나 종양 발생과 진행 과정 이후 단계를 대상으로 유선 개발과 관련된 opmentally 특정 이벤트. 8 주령 한 젊은 처녀 암컷은 우리의 실험실에서 비 침습적으로 주입되었다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>2-4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meloxicam</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>5-10 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans blue dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2129-10G</td>
			<td>0.2% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hair removing cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Choose sensitive option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro-dissecting tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>rs-4976</td>
			<td>With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamilton syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7637-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>33-gauge needle</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7803-05</td>
			<td>point style 4, 12 degree bevel (standard)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>siGLO cyclophilin B control siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001610-01-05</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland

여기에서 우리는 췌관 내 주사를 통해 마우스의 유방 동맥에 여러 가지 시약을 제공 할 수있는 프로토콜을 설명합니다. 현지화 된 약물 전달 및 노크 다운 유방 상피 세포 내 유전자로 인해 이러한 임신과 수유 등의 발달 단계와 무관 한 적절한 표적 분자의 부족으로 달성하기 어렵다. 여기서, 우리는 생쥐의 젖꼭지에 췌관 내 주사를 통해 성년의 모든 단계에서 유선에 시약의 지역화 전달을위한 기술을 설명합니다. 주사 마취, 살아있는 쥐에서 수행하고, 유선에 대한 비 침습 및 지역화 된 약물 전달을 허용 할 수 있습니다. 또한, 주사​​는 유두를 손상하지 않고 몇 개월에 걸쳐 반복 될 수있다. 같은 에반스 블루 같은 중요한 염료 기술을 습득하는 것은 매우 도움이됩니다. 청색 염료의 췌관 주입하면, 전체 유관 나무는 눈에 보이지됩니다. 또한, 형광 표지 시약도 허용유선 내에서 시각화 및 유통. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제, 작은 분자를 포함하는 화합물의 다양한 적응할 수있다.

젖꼭지는 쉽게 머리가 (그림 1A)를 둘러싼 지역에서 제거 된 후에 실체를 사용하여 지역화 할 수 있습니다. 사출 기술을 마스터하기 위해서는 에반스 청색 염료를 주입하고, 선 (腺)의 무결성 (그림 1B 및 C)를 모니터링하는 것이 좋습니다. 이 방법은 하나의 시각적 염료 전체 유관 시스템 (그림 1C 및 2A)에 도달 여부를 평가 할 수 있습니다 각 동맥에 주입 할 수있는 적절한 볼륨을 결정 할 수 있습니다. 주입 에반스 청색 화상의 화상은 전체 유관 트리 카민 명반 염료 (도 2B)로 염색되는 전체 장착 유방 선에 비교 될 수있다. 이 주입 방법의 견고성은 운영자에 크게 의존되어 있습니다. 예를 들어, 덕트를 관통하는 유방 지방 패드에 주입 발생하고 용액을 주입하는 것은 너무 빠르 유관 상피 CEL가 손상 될LS 및 염증 반응을 자극. 성공적인 췌관 주입은 유선으로 지역화 된 약물 전달을 가능하게하고, 그렇지 않으면 종종 관찰 비특이적 부작용을 줄일 수 있습니다. 찬란 주사 선 (腺)의 예제 이미지는 그림 3에서 볼 수 있습니다 cyclophilin (비 필수 유전자)를 대상으로 siRNA를 태그. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig1.jpg" /> 그림 1. 사타구니 유선 에반스 블루 염료로 유두를 통해 주입했다. 20 μL 에반스 블루 염료 주입 후 주입 및 B 전에 유두의) 외관). 제공된 팽윤 또는 조직 손상 피부를 열면. C)을 관찰하고, 염료는 전체 유방 유관 트리의 시각화를 허용한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig2.jpg" /> 그림 2. 에반스 블루의 분석을 전체 마운트투사 선. A) 동물로부터 적출 즉시 지방 후 카민 염료와 같은 선 (腺)의 주입. B) 전체 마운트 염색 후 유리 슬라이드에 확산 해부 선 (腺)의 대표 이미지가 삭제되었다. A)과의 비교는 주입 된 솔루션은 유방 유관 트리를 채우고 선 해부학 적 손상되지 않은 것을 확인합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50692/50692fig3.jpg" /> 그림 3. 신선한 조직 샘플의 형광 siRNA를 췌관 배달. 대표 이미지는, 48 시간의 주 사후을 절제.

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Intraductal Injection for Localized Drug Delivery to the Mouse Mammary Gland

마우스 유방 동맥에 수성 시약의 비 침습성 췌관 전달을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 특히 유방 덕트를 대상으로 유 방 땀 샘의 젖꼭지로 지역화 주입을 활용합니다. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제와 작은 분자를 포함한 화합물의 다양한 적응할 수있다.

마우스 유선 화 된 약물 전달을위한 췌관 주입

Herein we describe a protocol to deliver various reagents to the mouse mammary gland via intraductal injections. Localized drug delivery and knock-down of ...

intraductal-injection-for-localized-drug-delivery-to-mouse-mammary

Research

JoVE Journal

Biology

34.6K 조회수.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School.  마우스 유방 동맥에 수성 시약의 비 침습성 췌관 전달을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 특히 유방 덕트를 대상으로 유 방 땀 샘의 젖꼭지로 지역화 주입을 활용합니다. 이 기술은 siRNA를, 화학 요법 제와 작은 분자를 포함한 화합물의 다양한 적응할 수있다. 

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Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

연구

생물학

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

쥐에서 유선의 형태론과 유방암 위험의 변화

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

마우스 모델에서 유선 개발 및 기능 평가

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

설치류 부고환 정자의 포스 포 분석

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple method for the immune detection of proteins, the mouse lactating mammary gland being taken as an example. A protocol for the preparation of the tissue samples, especially concerning the dissection of mouse mammary gland, tissue fixation and frozen tissue sectioning, are detailed. A standard protocol to perform indirect immunofluorescence, including an optional antigen retrieval step, is also presented. The observation of the labeled tissue sections as well as image acquisition and post-treatments are also stated. This procedure gives a full overview, from the collection of animal tissue to the cellular localization of a protein. Although this general method can be applied to other tissue samples, it should be adapted to each tissue/primary antibody couple studied.

The indirect immunofluorescence protocol described in this article allows the detection and the localization of proteins in the mouse mammary gland. A complete method is given to prepare mammary gland samples, to perform immunohistochemistry, to image the tissue sections by fluorescence microscopy, and to reconstruct images.

마우스 유선의 냉동 섹션에 간접 면역 형광

Indirect immunofluorescence is used to detect and locate proteins of interest in a tissue. The protocol presented here describes a complete and simple ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

마우스 내부 귀를 대상으로 약물 전달 방법의 비교 연구 : Bullostomy<em&gt; 대</em&gt; Transtympanic 주입

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal architecture. Here, a small pocket below the skin was created using Mayo scissors, allowing separation of the glands within the subcutaneous tissue from the underlying peritoneum. Visualization of the glands was aided by the use of 3.5x-R surgical micro loupes. The pelt was inverted and pinned back allowing identification of the intact mammary fat pads. Each of the #4 abdominal glands was bluntly dissected by sliding the scalpel blade laterally between the subcutaneous layer and the glands. Immediately post-harvest, glands were placed in 10% neutral buffered formalin for subsequent tissue processing. Excision of the entire gland is advantageous because it primarily eliminates the risk of excluding important tissue-wide interactions between ductal epithelial cells and other microenvironmental cellular populations that could be missed in a partial biopsy. One drawback of the methodology is the use of serial sections from fixed tissues which limits analyses of ductal morphogenesis and protein expression to discrete locations within the gland. As such, changes in ductal architecture and protein expression in 3 dimensions (3D) is not readily obtainable. Overall, the technique is applicable to studies requiring whole intact murine mammary glands for downstream investigations such as developmental ductal morphogenesis or breast cancer.

Here, we present a protocol for the isolation of whole, intact mouse mammary glands to investigate extracellular matrix (ECM) expression and ductal morphology. Mouse #4 abdominal glands were extracted from 8-10 week old female nulliparous mice, fixed in neutral buffered formalin, sectioned and stained using immunohistochemistry for ECM proteins.

세포 외 기질 식 및 선 형태 분석을 그대로, 전체 마우스 유 방 땀 샘의 절연

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Partial Bile Duct Ligation in the Mouse: A Controlled Model of Localized Obstructive Cholestasis

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile duct proliferation. However, long-term experiments can lead to increased morbidity and mortality. In select mouse strains with underlying liver disease, meaningful comparisons can be made even with ligation of a single lobe of the liver, which can reduce animal losses and expenses. Here, we describe partial bile duct ligation (pBDL) in the mouse, in which only the left hepatic bile duct is ligated, causing biliary obstruction in the left lobe but not the remaining lobes. With careful microsurgical technique, pBDL experiments can be cost-effective, since the unligated lobe serves as an internal control to the ligated lobes, when subjected to the same conditions in the same animal. Unlike cBDL, a separate sham-operated control group is not necessary. pBDL is highly useful to directly compare localized versus systemic effects of cholestasis and other retained bile components. pBDL can also be repurposed as a novel method to investigate mechanisms related to medications and cell migration.

Here, we present partial bile duct ligation as a surgical model of liver injury and regeneration in rodents.

마우스에 부분적 담 관 결 찰: 지역화 된 폐쇄성 Cholestasis의 제어 모델

In rodents, complete bile duct ligation (cBDL) of the common bile duct is an established surgical technique for studying obstructive cholestasis and bile ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

트랜스-내부 세포 배아 줄기 세포의 대량 주입 리드 더 높은 Chimerism 요금

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Bovine Mammary Gland Biopsy Techniques

Bovine mammary gland biopsies allow researchers to collect tissue samples to study cell biology including gene expression, histological analysis, signaling pathways, and protein translation. This article describes two techniques for biopsy of the bovine mammary gland (MG). Three healthy Holstein dairy cows were the subjects. Before biopsies, cows were milked and subsequently restrained in a cattle chute. An analgesic (flunixin meglumine, 1.1 to 2.2 mg/kg of body weight) was administered via jugular intravenous [IV] injection 15-20 min prior to biopsy. For standing sedation, xylazine hydrochloride (0.01-0.05 mg/kg of body weight) was injected via the coccygeal vessels 5-10 min before the procedure. Once adequately sedated, the biopsy site was aseptically prepared and locally anaesthetized with 6 mL of 2% lidocaine hydrochloride via subcutaneous injection. Using aseptic technique, a 2 to 3 cm vertical incision was made using a number 10 scalpel. Core and needle biopsy tools were used. The core biopsy tool was attached to a cordless drill and inserted into the MG tissue through the incision using a clock-wise drill action. The needle biopsy tool was manually inserted into the incision site. Immediately after the procedure, an assistant applied pressure on the incision site for 20 to 25 min using a sterile towel to achieve hemostasis. Stainless steel surgical staples were used to oppose the skin incision. The staples were removed 10 days post-procedure. The main advantages of core and needle biopsies is that both approaches are minimally invasive procedures that can be safely performed in healthy cows. Milk yield following the biopsy was unaffected. These procedures require a short recovery time and result in fewer risks of complications. Specific limitations may include bleeding after the biopsy and infection on the biopsy site. Applications of these techniques include tissue collection for clinical diagnosis and research purposes, such as primary cell culture.

This article presents a bovine mammary gland biopsy using core and needle biopsy tools. Harvested tissue can be used for cell culture or to assess mammary physiology and metabolism including gene expression, protein expression, protein modifications, immunohistochemistry, and metabolite concentrations.