우리는 신중하게 원고를 읽는 한스 라이너 간척지, 마틴 마차부 워커 잭슨 감사합니다. , neurodegenerative 질병의 우수성 센터 (COEN, 저자는 국가 노스 린 - 웨스트 팔리 (SR), 전산 신경 과학 BMBF-Projekträger DLR 미국 - 독일어 협업 (SR CRCNS)의 연구 MIWF의 사역에 의해 제공되었다 자금을 받았다; SR) 및 본 교내 자금 지원 프로그램의 대학 (BONFOR, SR).

1. 시스템 요구 사항 <ol><li> 현미경 시스템 : 수상 돌기의 좋은 시각화 중요합니다. 가능한 경우, 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 시스템을 사용합니다. 사파이어 초고속-펄스 레이저 (카멜레온 울트라 II, 코 히어 런트)와 높은 NA 목적 : 본 실험에서 우리는 티타늄을 갖춘 TRIM 범위 II, LaVision 바이오텍, 빌레펠트, 독일, 울티마 IV 시스템, 프레리 기술, 매디슨, 위스콘신 사용 (60X, 0.9 NA, 올림푸스) 우리는 패치 피펫을 통해 형광 염료로 가득했던 돌기를 시각화 수 있습니다. 사진 손상이 2 광자 스캔을 사용하여 덜 심각한 것으로 생각되지만, 레이저 전력을 감소 (조직에서 아래의 8 MW) 및 체류 시간 (아래 1 마이크로 초) 또는 가능한 한 많이. </li><li> 두 번째 가능성은 최대한 노출 시간을 줄이기 위해 인수 기적 넓은 필드 형광 광원 (LED 또는 형광 램프)을 유발하는 것입니다. 우리는 통합 된 광원 (TILLPho과 단색을 사용했습니다Dodt 대비 적외선 조명 (TILLPhotonics, Grafelfing에서, 독일)가 장착 된 자이스 Axioskop 2 FS 직립 현미경 토닉, Grafelfing에서, 독일). 우리의 실험에서 노출 시간을 밀리 일반적으로 10에서 최대였다. 30 밀리. </li><li> 2 채널 마이크로 이온 도입 시스템을 예를 들어 MVCS-C-02 (NPI 전자, 탐, 독일)의 빠른 용량 보정., 빠른 마이크로 이온 도입 앰프를 사용 뾰족한 이온 도입 미세 전극은 25 저항이 - MΩ 100 (결정적 팁 크기와 피펫 모양에 따라), 그리고 iontophoretic 앰프의 용량 보정이 최적으로 조정되어있는 경우 빠른 상승 시간은 달성 될 수있다. 이 빠른 보상 iontophoretic 피펫을 밀리 초 이하의 범위에서 간단하고 신속한 증상과 전류 펄스를 적용함으로써 1 ㎛ 13 아래에 자리 크기의 높은 공간 해상도를 가진 송신기를 배출 할 필요가 있습니다. 이온 도입 앰프 알 수 있습니다우리가 실험실에서 테스트하지 않은 여러 다른 회사에서 너무 없습니다. 이 장치는 정전 용량 보상 회로가 장착되어 있지 우리의 지식이다. </li></ol> 2. 솔루션을 준비합니다 <ol><li> 인공 뇌척수 (ACSF)과는 실험 설계에 필요한되는 내부 솔루션을 준비합니다. 필요한 내부 솔루션에 유일한 추가는 광학 기기에 따라 빨간색이나 녹색 형광 염료 (예 : 50-200 μM 알렉사 형석 488 또는 594 하이 드라 지드, Invitrogen 사)입니다. 정상 ACSF을 위해, 60 염화나트륨, 100 자당, 2.5 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 1 염화칼슘 2, 5 MgCl 2, 20 포도당 : MM의 해부에 사용할 수 ACSF 자당, 여기 예제 밀리미터에있는 패치 클램프 실험 해결책 : 125의 NaCl, 3 KCl을, 1.25의 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3를 2.6 염화칼슘, 1.3 MgCl 2, 15 포도당. </li><li>모든 세포 솔루션을 지속적으로 (95 % O 2 5 % CO 2) Carbogenize. </li><li> 밀리미터, 예를 들어, 내부 솔루션을 준비 : 140 K-글루코 네이트, 7 KCl을, 5 HEPES-산, 0.5 MgCl 2, 5 포스 포 크레아틴 (phosphocreatine), 176 EGTA, 50과 - 200 μM 알렉사 488. </li><li> 글루타민산 염에 대한 마이크로 이온 토 포레 시스는 150 밀리미터 글루탐산과 솔루션을 준비하고 수산화 나트륨으로 7.0으로 산도를 조정합니다. 50 -200 μM 알렉사 형석 488 또는 시각화를위한 594 하이 드라 지드 (Invitrogen 사)를 추가합니다. </li><li> GABA의 이온 도입이 1 M GABA 솔루션을 준비하고 염산 15 5 산도를 조정합니다. pH가 GABA가 충전에 만 다음은 이온 도입하여 적용 할 수 있습니다. 솔루션의 낮은 pH는 GABA 전송 자체 16,17 영향을 미칠 수있는 세포 공간으로 배출 양해 바랍니다. 빛으로부터 GABA 솔루션을 보호하고 오래된 솔루션은 그 효과를 잃을 수 있기 때문에 자주 신선한 GABA 재고 솔루션을 준비합니다. </li><li> 그것은 GABA 성 이벤트, 안녕을 확인하기 어려운 경우GH 염소 - 구동력 내부 솔루션은 KCl을을 떠나는하여 예를 들어, GABA 이온 도입이 작동하는지 확인합니다 GABA 성 이벤트를 시각화하는 데 도움이 될 수 있지만 생리적 원동력이 권장 될 수 시냅스 통합을 조사 할 수 있습니다. 작은 GABA 성 이벤트의 일반적인 탐지를 위해, 그림 88에 표시된 프로토콜은 도움이 될 수 있습니다. </li></ol> 3. 이온 도입 피펫을 당겨 테스트 <ol><li> 일반적으로, 오른쪽 피펫을 당기는 것은 어쩌면 조절 신경 전달 물질의 이온 도입을 달성하기 위해 가장 중요한 단계입니다. 세포 배양에 이온 도입을 사용할 때, 10 날카로운 미세 전극과 유사한 매우 미세한 전극을 가져올 수 있습니다. 그들은 각도 조직으로 낮출 때 심각한 조각에 패치 클램프 실험에서는, 그러나,이 매우 얇은 피펫은 불가능 깊은 수상 돌기에 도달하기 위해 만드는 조각 표면에 구부립니다. </li><li> 따라서, 그래서 아주 작은 팁 피펫을 잡아 그 없음 해당 없음eurotransmitter은 누설 할 수 있지만, 끝은 여전히 조직 (그림 2)에 침투 할만큼 충분히 단단해야합니다. 또는 P-97 풀러, 서터 악기 회사, 예를 들어, 150기가바이트 F 8P 클래스 피펫 (과학 제품, 호프 하임, 독일)와 수평 풀러 (예를 들어 DMZ-유니버셜 풀러, 이츠 - 악기 GmbH를, Martinsried, 독일 사용 , 가파른 각도 (그림 2 및 표 2)와 작은 오프닝뿐만 아니라 짧은 꼭지를 달성하기 위해 여러 당기는 단계 노바 토, CA). </li><li> 그것은 iontophoretic 피펫에게 10를 가져 오기 위해 석영 유리 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이들은 더 나은 기계적 성질을 가지고하고보다 신뢰할 수 있어야되지만 특수 레이저 풀러가 필요합니다. 그러나 일반적으로 패치 피펫을 당기에 사용되는 정상적인 유리 피펫, 좋은 결과를 얻을 수도 있습니다. </li><li> 처음 그들을 사용하기 전에 조직이없는 약실에있는 피펫 성능 및 저항 테스트시간은 글루타민산의 누설 때문에 조직을 해칠 수 있습니다. </li><li> 제대로 이온 도입 앰프를 설정합니다. 그런 신경 전달 물질과 염료 함유 용액에 피펫을 채우고 욕조 (ACSF)에 넣습니다. </li><li> 정전 용량 (그림 3)을 보상한다. 일반적으로 매우 날카로운 피펫은 무딘 것보다 더 높은 용량을 갖게됩니다. </li><li> 피펫의 저항을 확인하십시오 : 여기에 사용되는 마이크로 이온 도입 앰프는 피펫 저항을 측정하기위한 빌드에서 기능이 있습니다. 그것은 표준 오실로스코프 수집 소프트웨어와 컴퓨터에 연결된 A / D 보드를 모니터링 할 수있는 간단한 직사각형 테스트 펄스를 불러 일으킨다. 모양과 팁 크기에 따라 끝에서 25 사이의 저항이 있어야합니다 - MΩ 90. </li><li> 피펫 팁 밖으로 형광 염료가 누수 60X 또는 40X 물 침지 목표 및 형광 이미징 스위치로 가능하다면 팁에 초점, 확대 (글루의 경우 작은 양을 적용tamate) 또는 부정이 (GABA, 그림 4의 경우) (&lt;0.02 μA) 현재 유지합니다. 그 누설을 취소하는 데 도움이되지 않는 경우 피펫을 변경합니다. </li><li> 강한 단계 전류를 적용하거나 수동 트리거를 사용하여 용액을 피펫 밖으로 배출 될 수 있는지 확인하기 위해 형광 이미지의 끝을 모니터링 할 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 전류 펄스의 극성을 배출하도록되어 분자의 전하에 따라 있습니다. 글루 탐 산염을 추출하려면 그것은 음의 전류와 GABA 양의 전류 (그림 4)의 경우.입니다 </li><li> 염료와 송신기의 블록 배출이 높은 방출에게 현재 여러 번 적용하여 해제 할 수있는 피펫에 기포. </li><li> 거기에 눈에 띄는 누설하지 및 테스트 배출이 성공하면 함께 촬영 커패시턴스를 보상하고 실험을 시작합니다. </li><li> 주의 : 용량 보정이 피드백 회로에 의해 달성되기 때문에,이 회로는 오버 할 수 있고 또는 그것을 overcomp 경우 진동ensated. 부드럽게 커패시턴스 보상 다이얼 설정을 사용합니다. </li><li> 필라멘트 속성을 변경했을 수 있기 때문에 풀러의 안정성에 따라서, 때때로 수시로 풀러 설정을 조정하는 것이 필요하다. 일단 좋은 피펫을 설계하는 경우 그러나, 그것은 몇 일 동안 사용할 수 있습니다. 따라서 끝난 후 실험 팁을 손상시키지 않고 밀폐 용기에 iontophoretic 피펫을 저장합니다. </li><li> 다음 실험은 신경 전달 물질의 용액을 피펫을 채울 경우, 팁을 취소하고 다음 속성 (예 : 저항) 변화에 크게 확인하는 몇 가지 강력한 배출 펄스를 적용합니다. 그런 다음 용량을 보정하고 다시 피펫을 사용합니다. 다른 신경 전달 물질의 솔루션을 하나의 피펫을 사용하지 마십시오. </li></ol> 4. 뇌 조각을 준비한다 <ol><li> 마이크로 이온 토 포레 시스를 처음 사용하는 경우 확실히 안정적으로 작동 풀러 프로그램을 수립 한 후 슬라이스를 준비합니다. </li> &lt;귀하의 기관 또는 지방 자치 단체의 동물 관리 지침에 따라 리&gt; 수행 마취 잘린 프로 시저. </li><li> 뇌의 제거 후, 차가운 얼음 ACSF 자당 (프로토콜 2.1 참조)로 전송할 수 있습니다. </li><li> 적절한 두께의 조각 (예를 들어, 300 μM)로 관심의 영역을 잘라. </li><li> 30 분 동안 35 ° C에서 ACSF 자당의 조각을 품어. 그 후, 실온에서 정상 ACSF을 포함 침수 보유 챔버로 전송. </li><li> 준비와 실험을 통해 95 % O 2, 5 % CO 2 조각을 둘러싼 ACSF을 carbogenize. </li></ol> 5. 전체 세포 녹음 설정 <ol><li> 전체 셀 모드를 설정 한 후, 오래 지속 위치를 피하기 위해, 패치 셀 전에 슬라이스 표면 근처 이미 이온 도입 피펫 (들)을 놓습니다. </li><li> 낮은 저항 패치 피펫 (3 - 5 MΩ)를 당겨, D로 채 웁니다너희는 내부 솔루션을 포함하고 피펫에 긍정적 인 압력 (30-60 밀리바)를 적용합니다. </li><li> 시각적 인지도를 아래에서 목욕 및 방법 세포 (적외선 dodt 대비 또는 두 개의 광자 그라데이션 대비 이미지)를 입력합니다. </li><li> 전압 클램프 모드에서 테스트 펄스 (예 : -10 MV, 20 밀리 초)을 피펫 저항을 모니터링 할 수 있습니다. 조직 오프셋 잠재력을 수정 만질 때. </li><li> 셀을 접근하고 부드럽게 명확하게 볼 수있다 &quot;보조개&quot;가 표시 될 때까지 그것으로 피펫 팁을 누릅니다. 60 mbar의 부정 압력을 -65 mV에서 막 잠재력을 전환 - 즉시 피펫의 압력을 해제, 40을 적용합니다. </li><li> 유지 전류가 100 펜실바니아 아래 값에 도달하면, 부정적인 압력을 놓습니다. </li><li> 기가 씰을 설정 한 후 (저항&gt; 1 GΩ), 피펫 또는 커패시턴스 보상 회로의 간단한 overcompensation에 짧은, 강한 흡입과 파열 막. </li><li> 어떤 모드에 따라 (전압 또는 전류 클램프)가 필요합니다실험 설계에 대해 적절하게 보상한다. </li><li> 최종 위치로 iontophoretic 피펫을 가지고 시작합니다. 성공적으로 패치 클램프 녹음을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명이 필요한 경우, 18,19 사용할 수있는 몇 가지 훌륭한 지침이 있습니다. </li></ol> 6. Iontophoretic 피펫을 놓고 시냅스 Iontophoretic 잠재적를 생성 <ol><li> 일반적으로, iontophoretic 이벤트는 소마 또는 GABA 마이크로 이온 도입 축삭 초기 세그먼트 돌기 샤프트에서 글루타민산 마이크로 이온 도입 가시 돌기에서, 예를 들어, 원하는 실험에 따라 정의 된 위치에서 유발 될 수 있습니다. </li><li> 터치하지 않고 약 1 ㎛ 거리에있는 셀을 접근. 그 위치에 도달하면 그것은 더 신경 전달 물질이 유출되지 않고 피펫 용량을 정확하게 보상하는 것을 중요합니다. </li><li> 글루타민산 염과 셀을 접근하는 것은 iontophoretic pipett 가득 경우E는 세포막 전위의 검출 탈분극이 발생, 가능하면 현재 유지 조정하거나 피펫을 변경합니다. </li><li> 짧은 음의 전류 펄스를 적용 0에서 시작하고 (예 : 0.1-0.4 밀리 초, 0.01-1 μA 펄스) 체계적으로 전류를 증가시킨다. 이 iontophoretic 전류가 특정 실험에서 원하는 응답을 셋업 연상하는 범위에서 찾을 수 있도록 도와줍니다. </li><li> 응답 검출이없는 경우, 피펫 수백 마이크로 미터를 들고 팁을 청소하는 (&gt; 0.1 μA) 강한 방출 전류를 적용한다. , 커패시턴스 보상을 조정 셀을 접근하고 다시 시도하십시오. </li><li> 응답이 아직없는 경우, 현재의 유지를 줄일 수 있습니다. 이 절차를 통제 신경 전달 물질의 방출을 일으킬 수 있기 때문에 다이얼 설정을 매우주의해야합니다. 따라서 지속적으로 막 잠재력에 각각의 변화를 감지 녹음을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 이 GABA 성 이벤트를 감지하기 어려운 경우에 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다n 내부 용액 조성물은 높은 염소의 항복 - 원동력. 이를 위해 염소를 감소 - 피펫 솔루션 파일 (. 프로토콜 2.6 절 참조) 농도를. 이 높은 구동력으로 인해 휴식 막 잠재력에 큰 GABA 성 이벤트가 발생합니다. </li><li> 또한, -100 MV에서 -48 MV (그림 88)에 막 잠재적 가능성의 결과로 긴 현재의 단계를 주입. 이 프로토콜과 염소가 - 원동력은 탈분극 GABA 반응을 일으키는 원인이 과분극 전위 증가합니다. </li><li> 그것은 사건의 GABA 성 특성을 결정하는 데 도움이 유발 사건의 반전 가능성을 결정하는 단계 전류 주입 프로토콜을 사용하는 것도 가능하다. GABA의 누설 글루타민산 누설보다 감지하기 어렵습니다. 이 경우, 입력 저항의 지속적인 모니터링은 GABA 가득 피펫에 접근 할 때 도움이 될 수 있습니다. 입력 저항이 감소하면, 현재 할 수있는 B를 유지E는 증가하거나 다른 피펫을 사용하여야한다. </li><li> 글루타민산 염 이온 도입에 대한 제어 실험, 우리는 글루타민산 누수로 인해 발생 될 수있는 지역의 칼슘 유입을 시각화하기 위해 피펫 용액에 200 μM OGB-1없이 EGTA를 사용하여, 칼슘 2 + 이미징 실험을 제안한다. </li><li> 일반적으로, 안정된 반응을 달성하는 것은 시간이 지남에 드리프트를 방지하기 위해 기계적으로 안정 피펫을 가지고하는 것이 매우 중요하다. 드리프트 온도 변화로 인해 발생할 수 있습니다, 그 때문에 측정 온도 드리프트를 방지하기 전에 적어도 반 시간 장비에 전환하는 것이 좋습니다. 피펫 홀더에 좋은 카트리지 씰을 사용하고 끝이 정말 고정되어 있는지 확인합니다. 홀더 자체는 또한 테프론 테이프로 고정 할 수 있으며, 또한, 또한 드리프트의 잠재적 인 소스입니다 headstage 또는 조작자의 케이블에는 장력이 없는지 확인합니다. </li></ol>

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+and+sensitivity+of+a+human+olfactory+receptor+functionally+expressed+in+human+embryonic+kidney+293+cells+and+Xenopus+Laevis+oocytes.">Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes.</a> J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).</li><li>Cash, S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+summation+of+excitatory+inputs+by+CA1+pyramidal+neurons.">Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons.</a> Neuron. 22, 383-394 (1999).</li><li>Eccles, J. C., Jaeger, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationship+between+the+mode+of+operation+and+the+dimensions+of+the+junctional+regions+at+synapses+and+motor+end-organs.">The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).</li><li>Kwon, H. B., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+induces+de+novo+growth+of+functional+spines+in+developing+cortex.">Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex.</a> Nature. 474, 100-104 (2011).</li><li>Fino, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-Photon+and+Visible-Light+Photoactivation+of+Neurons+and+Dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines.</a> Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 우리가 돌​​기에 시냅스 통합을 조사하는 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 토 포레 시스를 적용하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 성공적으로 체외에서 생체 9,20-22 다른 뇌 영역에서 글루타메이트와 GABA 성 시냅스 전달을 조사하는 데 사용되었습니다. 마이크로 이온 토 포레 시스는 60 년 이상에 사용되고 있습니다 만, 초기에 주로 로컬 느리거나 중간 ?...

중추 신경계의 뉴런은 얇은를내는 돌기 프로세스 1 시냅스 다양한 입력을받을 수 있습니다. 거기 흥분성 돌기 입력의 대부분은 글루타메이트 시냅스에 의해 매개된다. 이 시냅스는 흥분성 시냅스 후 전위 (EPSPS)의 시냅스 선형 통합의 결과, 공간적으로 분산 된 방식으로 활성화 할 수 있습니다. 시냅스가 동시에 돌기에 공간 근거리에서 활성화 된 경우 이러한 흥분성 입력은 위에 선형으로 통합 돌기 스파이크 2-5을 생성 할 수 있습니다. 또한, 흥분성 입력의 통합은 수지상 나무의 입력의 위치에 따라 달라집니다. 말초 술 지역에 도착 신호가 훨씬 더 감쇠 케이블 필터링 6에 의한 근위 입력보다. 해마에서 정점 술의 돌기에 먼 입력은 인접 dendri에 비해 다른 뇌 영역에 의해 생성되는TES 7. 흥미로운 질문은 따라서, 어떻게 시냅스 입력을 다른 돌기 구획에 의해 처리하고 돌기 통합은 여러 가지 방법으로 신경 세포의 발화에서 이러한 계층 입력의 영향을 조절합니다.합니다 기능적 속성, 수상 돌기의 형태 학적 특징뿐만 아니라, 입력의 위치와 클러스터링 결정적 글루타메이트 시냅스 8,9의 효능을 결정 또한 흥분성 입력, GABA 성 터미널에서 추가 금지 입력의 돌기 통합에 영향을주지 않습니다. 시냅스 통합의 서로 다른 측면을 이상적으로 돌기 도메인에 서로 다른 신경 전달 물질의 공간적 정의 응용 프로그램을 허용 신경 전달 물질의 마이크로 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 뉴런의 신호 통합을 조사하는 글루타민산 염과 GABA의 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 여기에서 보여줍니다. 이 응용 프로그램, 뾰족한위한집중 신경 전달 물질의 솔루션으로 가득 고 저항 피펫이 사용됩니다. 이 피펫은 신경 전달 물질 수용체가있는 세포의 외부 막에 가까운 위치에 있습니다. 수지상 가지의 좋은 시각화가 필요합니다. 이 최고의 패치 피펫을 통해 도입 된 형광 염료를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 매우 짧은 (&lt;1 밀리 초) 전류 펄스는 (10의 범위 - 100 NA) 청구 신경 전달 물질의 분자를 추출하는 데 사용됩니다. 이 짧은 펄스 및 효과적인 커패시턴스 보상, 시냅스 후 전위 또는 전류는 흥분성 입력의 위치를​​ 정확하게 알려진 의미 높은 시간적 및 공간적 정밀도로 유발 될 수 있습니다. 글루타민산 마이크로 이온 토 포레 시스 (그림 1 9) 여기에 표시된대로 6 μm의보다 작은 정의 된 반경에 시냅스를 활성화 할 수 있지만, 단일 시냅스 해상도 10-12에 도달 할 수도 있습니다. 하이네, M., 외 </eM&gt; 빠른 마이크로 이온 도입의 공간 해상도도 정기적으로 글루타메이트 13의 2 광자 uncaging을 달성 반점의 크기보다 작은 0.5 μm의 아래 사이즈를 발견 조정할 수 있습니다 것을 보여 주었다. 빠른 마이크로 이온 도입으로 두 개 이상의 iontophoretic 피펫을 사용하여 수지상 나무의 다른도 먼 장소에 배치 쉽게 할 수 있습니다. 이러한 방법으로, 서로 다른 경로에서 포함 흥분성 이벤트의 통합을 조사 할 수 있습니다. 그것은 동시에 글루타민산 염과 GABA 채워진 iontophoretic 피펫을 사용하는 것도 가능하다. 이 방법으로 흥분성 입력 (에 경로, 오프 경로 억제)을 기준으로 서로 다른 위치에서 GABA 성 억제의 효과를 연구 할 수 있습니다. 또한, 특정 신경 도메인을 대상의 interneurons에 의한 억제 효과는 말초 돌기처럼, 소마 또는 축삭 14, GABA 이온 도입을 사용하여 조사 할 수 있습니다. 배양 된 뉴런, 빠른 마이크로 이온 도입은 이전 inve 수있는 기회를 제공합니다더 자세한 10,11의 뉴런에서 단일 시냅스 분포와 시냅스 통신 초등학교 측면을 stigate. 이 문서에서 우리는 입력 위치 입력 강점과 타이밍, 단독으로 또는 상호 작용에의 의존에서 흥분성과 억제의 입력 시냅스 통합 조사를 허용 급성 뇌 조각에 사용하기 위해 글루타민산 염과 GABA 이온 도입을 설정하는 방법을 자세히 보여줍니다. 우리는 장점과 제한 사항이 기술을 어떻게 성공적으로 해결하는 방법을 가리 킵니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

신경 과학의 근본적인 관심사 중 하나는 결국 축삭의 행동 잠재력의 신경을 출력한다 수지상 나무의 매우 복잡한 구조를 따라 흥분성과 억제 입력의 통합을 이해하는 것입니다. 신경 세포의 출력에 대한 특정 시냅스 입력의 다양한 공간적 매개 변수의 영향은 돌기 입력의 거리에 의존 감쇠, 공간적으로 분리 된 입력의 위치에 따라 상호 작용, 흥분 통합, 선형에 GABAergig 억제의 영향을 예를 들어, 현재 조사 중입니다 비선형 통합 모드, 그리고 더 많은. 글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입으로 정확하게 글루타메이트 흥분과 GABA 성 억제의 공간적 통합을 조사 할 수 있습니다. 중요한 기술적 요구 사항 중 하나를 트리거 형광 램프, 발광 다이오드 (LED), 또는 두 광자 SCA 있습니다조직의 중요한 사진 피해를 도입하지 않고 돌기 가지를 시각화하는 현미경을 nning. 또한, 높은 저항 피펫의 빠른 용량 보정을 허용하는 마이크로 이온 도입 앰프를 가지고하는 것이 매우 중요합니다. 또 다른 중요한 점은 송신기가 무의식적으로 실험 기간 동안 피펫에 의해 발표되지 않은 것입니다. 일단 설정되면,이 기술은 높은 신경 전달 물질 및 위치 특이성과 신뢰성 및 재현성 신호를 제공합니다. 글루타메이트와 GABA의 uncaging에 비해 빠른 이온 도입이 시야에 제한없이 같은 시간에하지만, 아주 먼 위치에서 두 송신기를 사용하실 수 있습니다. 이 축삭의 초점 전기 자극에 비해 장점도있다 : 마이크로 이온 도입으로 입력 사이트의 위치는 확실히 알려져있어 관심에만 신경 전달 물질이 방출되어 있는지 확인합니다. 그러나 그와 함께 마이크로 이온 도입 전용으로 간주되어야한다postsynapse이 활성화되고 신경 전달 물질 방출의 연접 양상이 확인되지 않습니다. 이 문서에서 우리는 뇌 절편 실험에서 마이크로 이온 토 포레 시스를 설정하는 방법을 보여줍니다.

이온 도입의 공간 확산을 결정하는 간단한 방법은 배출 글루타민산 염을 일정하게 유지하면서, 수상 돌기에서 단계적으로 iontophoretic 피펫을 철회하는 것입니다. 우리는 마이크로 iontophoretic 자극의 공간적 범위는 약 12 μm의 (그림 1 반경을 보여주는)의 직경이 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 어떻게 이온 도입을 사용할 수 있습니다 조직에 깊은 것은 피펫의 강성에 따라 달라집?...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K 조회수.  University of Bonn. 이 문서에서 우리는 높은 공간과 시간적 정밀도 시냅스 신호의 통합을 조사하는 기술로 신경 전달 물질의 빠른 마이크로 이온 도입을 소개합니다.

비디오: Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

잘라내기 -로드 : 망막 뉴런 사이 간격 접합 추적 커플링의 범위를 검토​​를위한 유용한 도구

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

연구

신경과학

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI Cyber​​Motion 시뮬레이터 : 가로, 세로, 높이로 Multisensory 경로 통합을 조사할 소설 모션 시뮬레이터의 구현

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

에서 시냅틱 형광의 자동 부량<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

성상 세포 운송업자 전류의 디컨 볼 루션 분석 글루타민산 정리의 시간 과정을 도출

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기<em&gt; 생체</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

효소 기반의 바이오 센서를 사용하면 알츠하이머 병 마우스 모델에서 토닉과 Phasic이 품목을 측정하는

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

Vivo에서경작-Murine 이다 빠르고, 간단 하 고 저렴 한 AWESAM 프로토콜을 사용 하 여 같은

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...