이 작품은 파운데이션 부문 드 프랑스,​​ 문화원 국립 드 라 상테 엣 드 라 공들인 MEDICALE, 피에르 &amp; 마리 퀴리 대학 프로그램 &#39;INVESTISSEMENTS 디부 AVENIR&#39;ANR-10 IAIHU-06에서 보조금에 의해 지원되었다.

모든 절차는 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 수행 하였다 (지침 63분의 2,010 / EU) 및 동물 실험에 찰스 다윈 (Charles Darwin) 윤리위원회에 의해 승인했다. 그러나 우리는 대부분의 단계가 모두의 특정 요구에 맞게 적용 할 수 있습니다, 우리가 일상적으로 우리 연구실에서 사용하는 절차를 설명합니다. 1. 수술 준비 참고 : 모든 절개 및 압력 점을 반복해서 국소 마취제 (리도카인 또는 부피 바카)으로 침투한다. 무균 제제 여러 수정이 구현되어야 필요한 경우, 본 절차는 단말이다. <ol><li> 로컬로 분리 복강 내 (IP) 주사를 나트륨 펜 토바 비탈 (40 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (50 ㎎ / ㎏)로 쥐를 마취. </li><li> 동물은 전신 마취하에 이동을 반복 마취의 수술 비행기가 (곤란 발끝까지 아무런 반응을) 달성되지 않았 음을 확인하자. 철에 쥐를 놓습니다edback 가열 담요와 37 ° C 주위 코어 온도를 유지하기 위해 직장 프로브를 삽입합니다. </li><li> 마취제의 후속 주입을 용이하게하기 위해 반복 바늘 천공 (30)에 의해 장기 천공 방지하기 위해 복강에 카테터를 놓습니다. <ol><li> 위의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 위치한 지역 위의 지역 - 작은 (3mm ~ 2)를 통해 머리를 클립. 주 : 탈모 용 크림도 사용할 수있다. </li><li> 날카로운 가위 또는 메스로 피부에 3mm 절개 - 2를 확인합니다. 복강이 관찰 될 때까지 무딘 절개를 사용하여, 지방과 근육 층을 제거합니다. </li><li> 공동의 작은 카테터의 2cm 수술 접착제 상처를 닫습니다 - 1을 삽입합니다. (. 예를 들면,이 프랑스 - 내경 0.043 mm에 대응) 참고 직경 카테터의 전체 길이는 최소화되어야 데드 볼륨을 감소시킨다. 폴리 우레탄 튜브가 가장 적합하다. </li><li> 루프와 봉합 t을그 자리에 고정하는 피부 카테터. </li></ol></li><li> 인공 호흡 동안 환기를 제어하는​​ 기관 튜브를 설치합니다. <ol><li> 이전 단계로서, 관심 영역 준비 (1 - 우측 흉골 상기 기관 위에 2cm)를 모발을 제거하고, 피부를 절개. </li><li> 지방과 근육의 첫 번째 층을 해부 무딘, 다음 옆으로 침샘을 이동하고 부드럽게 근육의 마지막 층을 해부하여 기관을 노출. </li><li> 조심스럽게 기관을 통해 조직을 제거하고 작은 집게를 사용하여 그 아래에 스레드를 밀어 넣습니다. 스레드와 외과 의사의 매듭을 확인했지만 아직 꽉하지 않습니다. </li><li> 이 연골 고리 사이의 기관의 횡 방향을 절개. 기관있는 경우에 면봉 혈액입니다. </li><li> 적절한 직경 기관 튜브를 삽입하고 꾸준한 튜브를 고정하는 나사의 매듭을 조입니다. 추가적인 안정성을 위해 스레드는 상기기도 튜브의 높은 지점에 부착 될 수있다. </li><li> Sutur전자 상처를 촬영하거나 수술 스테이플을 사용합니다. 기관 튜브를 재사용하기위한 것입니다 경우 여기를 수술 접착제를 피하십시오. </li></ol></li><li> 고정대에서 동물을 설치하고 신중하게 다음과 같은 생리 학적 변수 모니터링 : ECOG, SPO 2, ETCO 2, 내부 온도 (심전도, 심전도를 통해) 심장 박동. 모니터링 및 마취 및 생리 학적 상태의 적절한 깊이를 유지하기 위해 이러한 변수를 조정합니다. 구체적으로는, 나트륨 펜 토바 비탈의 작은 투여 량 (10 ㎎ / ㎏)으로 마취 필요한 경우 보충. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 두 눈에 눈 연고를 적용합니다. 세로 절개 (~ 2cm)를 확인 두피 위에 머리를 클립과 메스 나 큐렛을 이용하여 두개골을 덮는 결합 조직을 절제. </li><li> 치과 드릴 관심 영역 위에 작은 (~ 1.5 mm 직경) 개두술을 확인합니다. 참고 : 여기에, 차 체 감각 피질의 배럴 필드가 대상 (7~8mm의 전방을 간가 라인에, 4.5- 5.5 mm)의 중심선 (31) 측 방향. 열을 방출하기 위해 반복적으로 씻어. </li><li> 부드럽게 경질에 작은 구멍을 만들기 위해 여분의 미세 집게를 사용합니다. ECOG 전극을 배치 뇌 공술 (Trepanation) 내에 ~ 0.5 mm 영역을 예약 (다음 단계 참조). 영구적으로 0.9 % NaCl 용액 (또는 인공 뇌 - 척수)와 촉촉한 피질을 유지합니다. </li><li> 아니라 수막에 의해 덮여 피질 영역을 피하고, 경질의 저임피던스 (~ 60 kΩ의)은 전극합니다 (ECOG 전극)을 배치하고, 상기 헤드의 반대편에 두피 근육에 기준 전극을 배치. </li><li> 이 단계 (마지막 펜토 바르 비탈 나트륨 주입 후 30 분)에서, IP 카테터를 통한 나트륨 펜 토바 비탈 (10 내지 15 ㎎ / ㎏ / H) 또는 펜타닐 (3-6 μg의 / kg / H)의 반복 주사하여 마취를 유지한다. 후자는 desynchronized, 깨어처럼, 대뇌 피질의 프로필 발생합니다 반면 전자는 느린 진동, 수면 등, ECOG 패턴 발생합니다. </li><li> 인공 V를 조정호흡 주파수 볼륨 래트의 자발 호흡 (- 115 호흡 / 분 (32)이 정상 범위 (70))와 유사하다되도록 entilation 시스템. 그 후, 기관 튜브로 인공 호흡기를 연결하고 (양면) 적절한 흉부 케이지 인플레이션을 확인합니다. 그렇지 않으면, 기관 축 통기 튜브의 위치를​​ 조정한다. 필요한 경우, 주사기 또는 진공 펌프에 연결된 도관과기도 내에 존재하는 분비를 빨아. </li><li> 29,36 패턴이 마취의 안정적인 수술 비행기를 반영하는 32 ~ 35과 ECOG 모든 생리 학적 변수, 쥐, 40 mg의 마비 각 다리에 gallamine의 triethiodide의 근육 주사를 할 경우 / 최초 주입 kg을 한 후 20 ㎎ / ㎏ 매일 2 시간 19,29,36,50. </li></ol> 2. 세포 내 녹음 <ol><li> ~ 0.2 μm의 끝 유리 마이크로 피펫 (날카로운 미세 전극)를 당겨 같은 저항은 betwee 범위N 50 80 MΩ 번이 M 칼륨 아세테이트 (KAC) 가득합니다. </li><li> (머리의 무대를 통해) 세포 내 앰프에 피펫 솔루션을 연결하는 실버 / 실버 염화물은 (Ag / AgCl을) 와이어 특정 홀더에 피펫을 배치합니다. 홀더는 미세 조작기에 연결해야합니다. 쥐의 목 근육 상에 Ag / AgCl 기준 전극을 배치했다. </li><li> 천천히 관심 영역까지 뇌 피펫 삽입 단계 및 전류에 응답하여 상품의 전압을 모니터링함으로써 저항을 확인. 필요한 경우 피펫을 취소 증폭기의 버튼을 버즈를 사용 (또는 보내 겠). </li><li> 개두술 뇌의 움직임을 줄이기 위해 실리콘 엘라스토머 또는 4 % 아가로 오스와 함께 취재에 앞서 (ECOG 또는 세포 내 전극을 만지지 않도록주의를) 건조 면봉 또는 합성 흡수 삼각형을 사용합니다. </li><li> 셀을 접근 할 때의 저항이 증가 할 때까지 2 μm의 단계 - 1의 피펫을 낮 춥니 다. 그런 다음 penetra하기 위해 증폭기의 잡음 기능을 사용신경 세포에 테. </li></ol> 3. 등전위 상태를 유도 <ol><li> 동시에 신경 세포의 막 전위의 ECOG 및 생리 변수를 모니터링하면서,이 단계에서 적절한 실험 프로토콜 (예를 들어, 응답을 소성하는 것은 세포 내로 주입하는 전류를 전류 - 전압 관계 감각 자극 응답)을 수행한다. </li><li> 세포 내 전극이 레코딩 세션에 걸쳐 막 잠재력과 행동 모두 잠재적 인 속성의 끈기를 분석하여 세포에 안정되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 다음 단계로 이동과 기록이 안정 될 때까지 다시 기다리거나 다른 신경 세포를 검색하지 않습니다. </li><li> 나트륨 펜 토바 비탈의 높지만 적외선 치사량 주사는 IP를 거쳐서 (~ / kg 90 mg을 상기 펜 토바 비탈 초기 조건에서 35 ㎎ / ㎏ 등 및 펜타닐의 초기 조건에서 155 ㎎ / ㎏까지 낮게 될 수있다). 참고 : 15 내 - 20 분 세포 내 및 ECOG 웨스턴 오스트 레일 리아veforms는 일시적으로 점진적으로 완벽한 등전위 상태로 붕괴되는, 37, 38 프로파일 소위 &quot;버스트 억제&quot;에 도달하는 간헐적 인 전기 침묵으로 느리게한다. 심장 박동이 크게 (~ 10 - 20 %) 속도가 느려집니다 것으로 예상되지만 SPO 2 ETCO 2는 상대적으로 안정 유지해야한다. </li><li> 등전위 상태에 도달하지 않은 경우, 펜토 바르 비탈 나트륨을 소량 주입 (~ 단계 3.1 용량의 10 %). 등전위 상태가 아직 달성되지 않은 경우 더 많은 마취제를 추가하기 전에 15 분을 기다립니다. </li><li> 기록 된 뉴런의 통합 특성의 네트워크 동력학의 효과를 비교하는 실험 프로토콜을 반복한다. 주 : 마취 주사를 중단 한 후, 전기 뇌 활동이 완전히 3-4 시간 내에 복구한다. </li><li> 실험의 끝에, 나트륨 펜 토바 비탈을 치사량 주사 하였다 (200 mg / kg, IP)을 래트를 안락사. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

우리는 여기에 네트워크 및 세포 수준에서 모두 생체 내 자연 뇌 전기 활동에 억제하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 절차는 등전점 혼수 41라고도 극단적 뇌 상태로 이끈다. 보기의 임상 적 관점에서, 이러한 활동은 electrocerebral EEG에서 알 수있는 가장 심각한 이상이다. 그것은 주로 하나 죽어 또는 식물 인간 (42)에 지속적으로 환자와 비가역 혼수와 관련되어 있지만...

어떤 환경 적 자극 또는 행동 태스크가 없으면, 「휴식」뇌 뇌파 (EEG) 파 등의 두피에서 기록 될 수있는 전기적 활성도의 연속 스트림을 생성한다. 이 내인성 뇌 활동의 세포 내 상관 관계가 구 심성 네트워크 -1,2-의 지속적인 활성을 반영 흥분성 및 억제 성 시냅스 전위의 조합으로 구성되어있다 (또한 &quot;시냅스 잡음&quot;이라고도 함) 배경 막의 전압 변동을 특징으로한다. 이 자발적인 활동은 경계의 다른 국가와 주파수 및 진폭에 따라 다릅니다. 단일 뉴런의 흥분성 및 응답에 대한 네트워크 활동의 영향을 해명은 신경 과학 3,4의 주요 문제 중 하나이다. 많은 실험과 계산 연구는 통합 propertie에 지속적인 시냅스 활동의 기능에 미치는 영향을 살펴 보았다뉴런의의. 그러나, 배경 잡음의 영향 시냅스 다른 신경 파라미터의 역할은 애매 남아있다. 예를 들어, 막 탈분극의 평균 수준에 긍정적 또는 부정적 5,6- 7-9 활동 전위를 유발하는 감각 입력의 능력과 상관 밝혀졌다. 일부 연구는 심성 시냅스 입력의 연속적 변화 스트림으로 인한 막 전위의 변동이 강하게 그들의 입출력 관계 3,10-13의 이득을 조절하여 하나의 뉴런의 응답에 영향을주는 것을 제안하는 반면 또, 다른 것을 나타 분로 억제에 의해 매개되는 멤브레인 입력 컨덕턴스의 변화에 관계없이, 막 14,15 변동의 크기 신경 이득을 조절하기에 충분하다. 마지막으로, 웨이크 동물 수행 최근의 연구는 단일 신경 감각 정보의 처리는 매우 조심 (A)의 상태에 의존하는 방법을 강조차 현재의 행동 수요 16, 17. 고도로 상호 연결된 시스템에서 주어진 프로세스의 기능적 역할을 규명하기위한 간단한 전략은 부재 구체적 시스템의 기능을 변경하는 방법을 결정하는 것이다. 이 방법은 광범위의 실험 병변 또는 다른 뇌 영역 18-21 불 활성화 또는 특정 이온 채널 (22, 23)의 약리 봉쇄하여, 예를 들어 신경 과학 연구에 사용되었다. 특히, 기능적 연결성 및 네트워크 역학 단일 셀 계산 24-27에 미치는 영향을 발표 할 생체 내에서 적용되었습니다. 그러나, 현재까지 지역 조작은 신경 세포의 발사를 차단 및 / 또는 부분적으로 효과적 일 수있다 기본적인 생물 물리학 적 특성을 교란하기위한 상대적으로 작은 뇌 볼륨 (28)에 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체 실험 방법의 새로운 개발쥐은 전체 뇌 시냅스 활동 (29)의 완전한 억제 후 얻은 것과 특정 네트워크 동적에 포함 된 특정 뇌 상태에 기록 된 하나의 뉴런, 즉,의 전기 생리 특성을 비교합니다. 제어 상황에서, 두 개의 별개의 피질 역학이 생성 될 수있다. 슬립 등 electrocorticographic (ECOG) 패턴을 펜토 바르 비탈 나트륨의 적당한 용량의 주사에 의해 유도 하였다. 다른 방법으로, 깨어있는 상태 (깨어 같은 패턴)을 기본 대뇌 피질의 활동에 필적하는 작은 진폭의 빠른 ECOG 파도 펜타닐 주사에 의해 생성 될 수있다. 동일한 ECOG 세포 내 기록을 유지해서, 내생 뇌 전기 활동의 완전한 침묵은 등전점 ECOG 및 세포 활동 특징 나트륨 펜 토바 비탈의 높은 투여 량의 전신 주입에 의해 수득 하였다. 이러한 극단적 인 혼수의 유도는 잠재적으로 치명적인 consequen을 가질 수 있기 때문에생물학적 기능에 CES는 생리적 변수의 신중하고 지속적인 모니터링이 필수적이었다. 따라서, 우리는 꼼꼼하게 실험을 통해 심장 박동 주파수, 최종 갯벌 CO 2 농도 (ETCO 2) O (2) 포화 (SPO 2)와 쥐의 핵심 온도를 하였다. 우리는 생체 내에서 길고 안정적인 녹음에 특히 적합하다 날카로운 미소 전극을 사용하여 이러한 여러 가지 상태 중 하나의 신경 세포 특성을 평가한다. 여기에 설명 된 절차는, 다른 전기 생리와 촬상 방법과 결합 될 수 있고, 다른 동물 모델로 확장 될 수있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Centravet</td>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 500</td>
			<td>Merial</td>
			<td>Imalg&#232;ne 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl&#160;</td>
			<td>Janssen-Cilag</td>
			<td>Fentanyl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylocaine</td>
			<td>Centravet</td>
			<td>Xylovet</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gallamine triethiodide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECoG amplifier</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>AC amplifier, Model 1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intracellular amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition interface</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>CED power 1401-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Cambridge Electronic Design</td>
			<td>Spike2 version 7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>IVM-3000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PE-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire 0.125mm (intracellular recording)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ag-AgCl reference</td>
			<td>Phymep</td>
			<td>E242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire 0.25mm (ECoG recording)</td>
			<td>WPI</td>
			<td>AGT1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial respiration system</td>
			<td>Minerve</td>
			<td>Alpha Lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiological parameters monitoring</td>
			<td>Digicare</td>
			<td>LifeWindow Lite</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Blanket</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15005-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5</td>
			<td>FST</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps Dumont #5SF</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IP Polyurethane catheter - 0.43x0.69mm&#160;&#160;</td>
			<td>Instech</td>
			<td>BTPU-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon elastomere</td>
			<td>WPI</td>
			<td>KWIK-CAST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>NSK</td>
			<td>Y1001151 and P496</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical glue</td>
			<td>3M</td>
			<td>vetbond</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of an isoelectric brain state to investigate the impact of endogenous synaptic activity on neuronal excitability in vivo

방법 뉴런 프로세스 정보는 고유 막 성질과 심성 시냅스 네트워크의 역학에 모두 의존한다. 강하게 각성 상태의 함수로서 변화 특히 내생 적으로 생성 된 네트워크 활동에 크게 신경 계산을 변조한다. 자발적 뇌 역학 단일 뉴런 &#39;통합 특성에 영향을 얼마나 다른지 조사하기 위하여, 우리는 나트륨 펜토 바르 비탈의 고용량의 전신 주사에 의해 생체 내에서 모든 뇌 활성을 억제 이루어진 래트에서 새로운 실험 전략을 개발했다. 연속적으로 결합 electrocorticogram (ECOG)와 세포 내 기록에 의해 모니터링 대뇌 피질의 활동은 점차 안정 등전점 프로필로 이어지는 둔화된다. 깊은 혼수에 래트를 넣고이 극단적 뇌 상태는 신중 걸쳐 실험 동물의 생리 학적 상수를 측정하여 모니터링 하였다. 세포 내 연구ecordings은 우리의 특성 및 수면 - 각성주기에서 발생하는 것과 같은 생리 학적으로 관련된 대뇌 피질의 역학에 포함 동일한 신경 세포의 통합 특성을 비교하도록 허용하고, 뇌는 완전히 침묵 할 때.

유도 및 등전점 뇌 상태를 유지하는 것은 생체 실험 절차의 섬세한이다. 그것은 바로 신경 세포의 흥분과 전달 함수 (29)에 대뇌 피질의 네트워크 활동의 영향을 연구 할 수있는 강력한 도구로 입증되었다. 그림 1 (그림 1A 전에 동물의 생리 학적 상태의 ECOG 및 중요한 상수를 포함하는 다중 매개 변수 감시를 보여?...

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Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

이 절차는 등전점 뇌 상태의 결과, 생리 학적으로 관련된 뇌 상태 동안 지속적인 전기 활동의 완전한 폐지 후 하나의 뉴런에서 오래 지속되는 생체 세포 내 녹음을 수행한다. 동물의 생리적 상수는 조심스럽게 인공 혼수 상태로 전환하는 동안 모니터링됩니다.

등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기<em&gt; 생체</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

β - 아밀로이드 Oligomeric의 준비 1-42</subHippocampal 조각에 시냅틱 소성 장애의>와 유도

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

연구

신경과학

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotypic 문화에의 연결을 눈사태의 다중 전극 어레이 레코딩

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

글루타민산 염과 GABA의 빠른 마이크로 이온 도입 : 시냅틱 통합을 조사하는 유용한 도구

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

A Procedure for Implanting Organized Arrays of Microwires for Single-unit Recordings in Awake, Behaving Animals

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell level. The technique allows experimenters to examine temporally and regionally specific firing patterns in order to correlate recorded action potentials with ongoing behavior. Moreover, single-unit recordings can be combined with a plethora of other techniques in order to produce comprehensive explanations of neural function. In this article, we describe the anesthesia and preparation for microwire implantation. Subsequently, we enumerate the necessary equipment and surgical steps to accurately insert a microwire array into a target structure. Lastly, we briefly describe the equipment used to record from each individual electrode in the array. The fixed microwire arrays described are well-suited for chronic implantation and allow for longitudinal recordings of neural data in almost any behavioral preparation. We discuss tracing electrode tracks to triangulate microwire positions as well as ways to combine microwire implantation with immunohistochemical techniques in order to increase the anatomical specificity of recorded results.

Implanting organized arrays of microwires for use in single-unit electrophysiological recordings presents a number of technical challenges.&#160;Methods for performing this technique and the equipment necessary are described.&#160;Also, the beneficial use of organized microwire arrays to record from distinct neural subregions with high spatial selectivity is discussed.

동물 행동하자, 깨어있는 단일 단위 레코딩을위한 Microwires의 조직 된 배열을 주입하기위한 절차

In vivo electrophysiological recordings in the awake, behaving animal provide a powerful method for understanding neural signaling at the single-cell ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Murine Model of Controlled Cortical Impact for the Induction of Traumatic Brain Injury

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the United States. In fact, TBI is a contributing factor to over a third of all injury-related mortality. Nonetheless, the cellular and molecular mechanisms underlying the pathophysiology of TBI are poorly understood. Thus, preclinical models of TBI capable of replicating the injury mechanisms pertinent to TBI in human patients are a critical research need. The controlled cortical impact (CCI) model of TBI utilizes a mechanical device to directly impact the exposed cortex. While no model can full recapitulate the disparate injury patterns and heterogeneous nature of TBI in human patients, CCI is capable of inducing a wide range of clinically applicable TBI. Furthermore, CCI is easily standardized allowing investigators to compare results across experiments as well as across investigative groups. The following protocol is a detailed description of applying a severe CCI with a commercially available impacting device in a murine model of TBI.

Here we describe a protocol for the induction of murine traumatic brain injury via an open-head controlled cortical impact.

외상성 뇌 손상의 유도에 대한 제어 피질 영향의 뮤린 모델

The Centers for Disease Control and Injury Prevention estimate that almost 2 million people sustain a traumatic brain injury (TBI) every year in the ...