저자는 플랫폼의 자금 조달 및 지원에 대한 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 원고 및 편집 지원의 중요한 검토를 위해 박사 캐롤 E. 파커 감사합니다. CHL도 지원을위한 감사 브리티시 컬럼비아 단백질 체학 네트워크.

1. 조직의 단면 <ol><li> , 액체 질소를 사용하여, 한 번 수확 한 문제의 표본을, 플래시 동결 (배송이 필요한 경우) 드라이 아이스에 그들을 발송하고, 조직 절편 때까지 -80 ° C에 저장합니다. (상용 샘플을 사용하는 경우, 샘플은이 방식으로 제조되도록.) </li><li> MALDI 목표에 맞게 관리 크기로 장기를 잘라. 기관의 불필요한 부분을 잘라냅니다. 여기에 설명 된 본 연구의 경우, 소 송아지 렌즈는 조직 절편하기 전에 이전에 설명 된 절차 (35)를 사용하여 디 캡슐화 하였다. </li><li> -80 ° C 냉동고에서 전체 장기를 제거하고 저온 ​​조직 절단 무대에 수정합니다. 소 송아지 렌즈를 해결하려면, 저온 유지 장치의 조직을 절단 단계에서 물이 한 두 방울을 배치합니다. 이 응고되기 전에 빨리 물에 렌즈를 배치합니다. 또한, 최적의 절삭 온도 (10 월) 화합물은 또한 절단 단계에 조직 문제를 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 의 OCT 화합물을 사용하는 경우, 소형의 OCT 말 량이 적용되어야 손질 컷 조직 절편은 이온화 분석 5,36,37의 검출을 방해 할 수의 OCT 화합물로 오염되지 않도록주의해야한다. </li><li> 저온 유지 장치 내부의 온도가 -18 ℃로 평형을 허용 추운 또는 따뜻한 온도는 각각 부드럽게 또는 열심히 조직에 사용할 수 있습니다. 그런 다음 equatorially 20 μm의 두께 조각으로 조직을 잘라. 대부분의 조직에 대해 10 ~ 15 μm의 두께 조각을 사용; 때문에 소 렌즈 조직의 깨지기 쉬운 특성으로, 그러나, 20 μm의 두께 슬라이스를 사용 하였다. 소 렌즈 용 티슈의 경우, 제 조직 섹션을 버리고 만 적도면에 또는 가까이있는 슬라이스를 사용한다. </li><li> 접안 렌즈 티슈가 묘화되는 경우, 산화 인듐 주석 (ITO) 코팅 된 유리 슬라이드의 표면 prewet하는 포름산 (순도 98 %, LC-MS 그레이드) 1.5 μl를 사용한다. </li><li> 조심스럽게 ITO-공동의 표면에 조직 섹션을 전송저온 유지 장치 내부 ated 유리 현미경 슬라이드. 조직 절편 신속 해동하고 슬라이드면에 단단히 부착 될 것이다. 일반적으로, 여러 조직 섹션 이와 같이 동일한 ITO 코팅 된 슬라이드 상에 장착 될 수있다. </li><li> MALDI 매트릭스 도장 전에 15 분간 슬라이드를 냉동 건조. </li><li> 매트릭스 테스트를 위해 적절한 용매에 각각의 행렬을 녹입니다. 수동으로 조직 섹션에 각 매트릭스 용액 1 μl를 발견. 또한, MALDI 감도의 검증 용 티슈 상 저분자 보정 표준을 더럽힐. </li><li> 교정 유체 펜으로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 비전 도성 표면에 기록하여 ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 세 교육 마크를 추가합니다. 평판 스캐너를 사용하여 조직 슬라이드의 광학 이미지를 촬영하고는 TIFF 또는 JPG 등의 적절한 형식으로 저장합니다. </li></ol> 2. 매트릭스 코팅 2.1. 자동화 된 매트릭스 코팅 <ol><li> AP자동 브루 커 ImagePrep 또는 유사한 전자 매트릭스 분무기를 이용하여 조직 절편의 표면에 용매로서 아세토 니트릴 또는 혼합 아세토 니트릴 / 물을 함유 플라이 매트릭스 솔루션. </li><li> 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다. </li><li> 외투 매트릭스 코팅 (2 초 스프레이, 30 초 배양하고, 각 사이클 동안 60 초 건조 시간)의 스물 사이클을 이용하여 유리 슬라이드. </li></ol> 2.2. 수동 매트릭스 코팅 <ol><li> 전자 행렬 분사기의 제조 재료와 호환되지 않는 유기 용매 (예 : 클로로포름, 에틸 아세테이트) requi다면빨강, 매트릭스를 적용 할 공압 보조 에어 브러쉬 스프레이를 사용합니다. 에어 브러쉬 총의 용매 저장소에 제조 된 매트릭스 솔루션을 추가하고 주요 스프레이 가압 질소 가스의 완만 한 흐름을 적용합니다. </li><li> 매트릭스 코트 슬라이드의 가장자리를하지 않도록 테이프로 ITO 코팅 된 유리 슬라이드의 전면의 가장자리를 커버. 이것은 대향 표면에 교시 마크 조직 슬라이드 정렬을 위해 사용될 수 있음을 보장한다. 이들이 ITO 코팅 된 슬라이드의 전기 전도성을 유지하기 위해 접점으로서 사용되는 행렬로 상기 슬라이드의 가장자리를 커버하지 않는다. </li><li> 안정하고 미세한 스프레이가 관찰 된 후에, 수동 매트릭스 스프레이 완전히 코팅 조직 절편을되도록. 간신히 가능한 피 분석 비편 재화를 방지하기 위해 각 사이클 동안 표면을 적시기 위해 필요한 매트릭스 용액의 최소량을 적용한다. 일반적으로, 코팅하는 매트릭스 스프레이 약 10 사이클 조직 절편을 사용하여, 사이클의 수는티슈 타입 및 매트릭스 조성물에 의존. </li></ol> 3. MALDI MS <ol><li> 물 (최종 혼합물 중 0.1 % 포름산 함유) : 60:40 이소프로판올 1:200의 요인에 의해 &quot;ES 튜닝 혼합&quot;표준 용액을 희석하여 질량 보정 용액을 준비한다. </li><li> 2 μL / 듀얼 모드 전기 분무 이온화 (ESI) ESI 측에서 FTICR 질량 분석기에 / MALDI 이온 소스에 희석 &quot;ES 조정 믹스&quot;솔루션의 분을 소개합니다. </li><li> 광대역 검출 1,024 킬로바이트 / 초의 데이터 수집의 제약없이, 포지티브 이온 ESI 모드 FTICR 악기 운항. 일반적인 ESI 매개 변수는 모세관 전기 분무 전압 3,900 V되며 방패 전압 3,600 V 스프레이, 분무기 가스 (N 2) 흐름, 2 L / 분; 건조 가스 (N 2) 흐름과 온도, 4 L / 분 200 ° C; 1 전압, 15 V 분리기에, 비행 (TOF)의 시간 0.009 초, 충돌 가스 (AR) 흐름, 0.4 L / S, 소스 이온 축적 시간, 0.1 초;및 충돌 셀 이온 축적 시간 0.2 초. 좋은 시간 영역 자유 유도 감쇄 (FID) 신호를 유지하면서, m / z 200에서 1,400 질량 범위의 분석 감도를 극대화하기 위해 조정 FTICR 작업 매개 변수를 설정합니다. 일반적으로, ICR 작업 매개 변수 조수의 전압 8 V되며 오프셋 전압, 8 V를 조수, 10의 여기 증폭, 여기 펄스 시간, 0.01-0.015 초, 전면 트랩 플레이트 전압 1.5 V, 다시 트랩 플레이트 전압 1.6 V 및 분석기 입구 전압, -4 FTICR 운전 파라미터들의 세트가 결정되고 나면 V., ESI 질량 스펙트럼을 획득하고 &quot;ES 튜닝 혼합&quot;용액에서 표준 화합물의 레퍼런스 질량을 사용하여 기기를 교정. </li><li> 조정에 MALDI 작업을위한 장비는, 1 μM 각각의 농도 매트릭스 용액에 혼합 테르페나딘과 레 세르 핀 표준 용액의 몇 가지 1 μL 씩 분주 녹여 직접 Tissu은 중 하나에이 솔루션을 발견전자 섹션 ITO 코팅 된 슬라이드에 장착 된 (즉, 테스트 조직과). 조직 슬라이드 어댑터 (즉, 특별 MALDI 대상)에 ITO 코팅 된 슬라이드를 놓고 이중 ESI / MALDI 이온 소스에 든 측면에서 어댑터를로드 할 수 있습니다. 각 질량 스캔 MALDI 신호 축적 등을위한 레이저 출력과 레이저 샷의 개수에 대한 적절한 MALDI 동작 파라미터를 최적화 전형적인 MALDI 동작 파라미터는 : 레이저 샷, 50, 및 300 V.의 MALDI 플레이트 전압 </li><li> 조정 후, 교정, 및 MALDI-MSI 실험을위한 계측기 최적화 이미징 소프트웨어 내에 기록 된 광학 상으로 묘화 될 수있는 조직 절편의 실제 위치를 정렬. 3 점 삼각 측량 방법을 이용하여 이러한 정렬을 위해 이전에 ITO 코팅 된 슬라이드면의 반대측 (단계 1.9)에 넣어왔다 세 &quot;정정 유체&quot;부호를 사용한다. </li><li> 동시 ESI와 MAL를 수행DI 작업을 각각의 질량 스펙트럼은 인수 후 내부 질량 교정을위한 &quot;ES 조정 믹스&quot;솔루션의 기준 질량 피크를 포함하도록. 이 MALDI MS 동안 가장 정확한 질량 측정 될 것입니다. 이를 위해, 제 ESI calibrant의 신호가 내부 질량 교정 여전히 높게 유지하면서 MALDI 스펙트럼 신호를 지배 할 때까지 모세관 전압을 감소시킴으로써 ESI 신호를 감쇠. </li><li> 다음으로, 레이저 조사에 대한 자동화 된 래스터 링 방법을 설정합니다. 몇 군데 조직의 영역을 정의하고 적절한 레이저 래스터 단계의 크기를 설정합니다. 작은 래스터 스텝 사이즈는 더 높은 해상도의 조직 이미지를 제공한다는 점에 유의하지만, 상당히 긴 질량 스펙트럼 획득 시간 등의 데이터 저장 공간을 필요로한다. 이미지 픽셀의 수를 설정하는 레이저 래스터 스텝 사이즈 및 조직의 크기에 의존한다. 1cm 2 티슈 크기가 일반적인 소 렌즈, 조직 이미지는 일반적으로 주 구성되어있다. </EM&gt; 5,000 픽셀 200 ㎛의 레이저 래스터 단계 크기가 FTICR 기기에 사용되는 경우. 이 실험 기간 동안 점진적으로 인해 신호 감쇠에 위치 기반 편견을 방지로, &quot;임의의 장소&quot;분석을 사용합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 <ol><li> 초기 비교를 위해 내부 보정을 사용하여 MALDI 질량 스펙트럼을 측정하고 MS / MS에 대한 피크를 선택합니다. 드 동위 원소 및 사용자 정의 VBA 스크립트 (38)를 사용하여, 전술 한 바와 같이 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크를 선택합니다. </li><li> 내보내기 모노 이소 토픽 (monoisotopic) 피크 목록 및 METLIN 39 및 / 또는 라이브러리 항목 질량 매칭 HMDB 40 대사 체 데이터베이스에 입력 측정 된 M / Z 값을 결과. ± 1 ppm으로 허용 질량 오류로 데이터베이스를 검색하는 동안 (M + H) +, (M + NA) + 및 (M + K) + 이온을 고려한다. </li><li> IMAG을 사용하여 전체 조직 절편을 가로 질러 검출 된 지질 엔티티 모두를위한 이미지를 생성 MALDI피크 꼭대기에서 1 ppm으로의 질량 필터 폭 전자 분석 소프트웨어. </li><li> 이미지가 데이터베이스 항목과 일치하는 모든 M / Z 값에 대해 생성되고 나면, 나중에 조사 할 수있는 독특한 분포 패턴을 찾아뿐만 아니라 다른 모든 피크에 대한 이미지를 생성합니다. </li></ol> 5. 군데 지질의 신원 확인 <ol><li> MALDI-MS/MS 의해 FTICR 악기 (인지질 예 : 184.073)를 사용하여 검출 될 수있는 특성 단편 이온이 높은 풍부한 지질의 신원을 확인한다. 직접 조직에 충돌 유발 분해 (CID)를 사용하여 MALDI-MS/MS을 수행합니다. </li><li> 직접 MALDI-MS/MS에 의해 확인 될 수없는 그 지질 종 들어, Q-TOF 질량 분석기 (34)에 결합 UPLC 시스템을 사용한다. <ol><li> 수동으로 관심의 종류가 지역화 된 영역에서 조직의 ~ 10 ㎎을 함유 분주 해부. 2에 이러한 조직 분량 씩 배치ML의 원심 분리기 튜브. </li><li> 두 5mm 스테인리스 금속 공 믹서 밀을 사용하여, 물 250 ㎕를 각 조직 나누어지는 균질화. </li><li> 클로로포름 - 메탄올 용액 (1:3 V / V), 및 소용돌이 관의 1 ML을 추가합니다. 다음에, 10 분 동안 12,000 XG에서 마이크로 원심 튜브를 사용하여 원심 분리. </li><li> 상층 액을 수집하고 회전 속도 진공 농축기에서 그들을 건조. </li><li> 물 : 30:70 이소프로판올 100 μL의 잔류 물을 녹인다. 기울기 용리를 사용하여 분리를위한 UPLC 컬럼에 10 ㎕의 분취 량을 주입한다. </li><li> 이전에 34 게시 된 온라인 지질 LC-MS/MS에 대한 크로마토 그래피 조건을 사용합니다. </li><li> 생성 추출한 이온 전류 (XIC)의 이론 질량 주위 ± 50 ppm으로 윈도우로, 이론적 m / z 값을 이용하여 크로마토 그램. </li><li> 그 지질에 대한 본격적인 화합물을 사용할 수있는 경우, 대응의 사람들과 확실한 화합물의 머무름 시간과 일치조직 샘플에서 XIC 피크를하는 번. 화합물이 동일한 경우, 체류 시간 및 MS / MS 스펙트럼은 일치한다. </li></ol></li><li> 본격적인 화합물을 사용할 수없는 경우, 같은 METLIN 또는 HMDB 등의 대사 체 데이터베이스에서 표준 MS / MS 스펙트럼과 일치하도록 감지 지질의 조각 패턴을 사용합니다. 지질에 대한 가능한 구조를 결정하기 위해 새로이 질량 스펙트럼 해석을 사용합니다. </li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

성공적인 MALDI MSI에 대한 가장 중요한 고려 사항은 : 1) 티슈 제조 2) 매트릭스 보유 3) 매트릭스 애플리케이션, 4) 데이터 해석 및 분석. 시료와 매트릭스를 적절하게 제조 될 때, MS 데이터 수집이 자동화된다. 이러한 유형의 실험에서 데이터 분석은 매우 노동 집약적이다. 적절한 조직 준비는 성공적인 MALDI MSI 실험을 위해 매우 중요합니다. 조직의 소스 및 취급은 최종 분석에 ?...

질량 분석 이미징 (MSI)는 조직 절편 1,2의 표면 상에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정하기위한 분석 기술이다. 펩타이드 및 단백질의 분석을위한 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) MSI는 년 넘게 사용 된 샘플 준비, 검출 감도, 공간 해상도, 재현성 및 데이터 처리 3,4 방법에서 큰 개선이 있었다. 조직 학적으로 스테인드 섹션과 MSI 실험에서 정보를 결합하여, 병리학 pathophysiologically 흥미로운 기능 5와 특정 화합물의 분포의 상관 관계를 할 수 있습니다. 외인성 약물 6,7과 그 대사 산물 8-10 등의 작은 분자의 분포 패턴은 MALDI-MS 조직 영상 (11)에 의해 심문을하고 있습니다. 지질은 아마도 가장 널리 연구 된 CLA 있습니다MS 12 ~ 17 및 MS / MS 18 모드에서 모두 MALDI 이미징 화합물의 SS. 작은 분자 이미징 MALDI MSI의 사용은 여러 가지 요인에 의해 제한되었다 : 1) MALDI 매트릭스 자체가 풍부한 이온 신호를 생성 작은 ​​분자 (일반적으로 m / z &lt;500)이다. 이러한 풍부한 신호는 작은 분자 분석의 이온화를 억제하고 자신의 검출 (19, 20)을 방해 할 수 있습니다. 무용제 매트릭스 코팅 21, 매트릭스 승화 (22)와, MALDI MS 23 프리 코트 행렬은, 다른 사람의 사이에서, 작은 분자의 MSI를 개선하기 위해 개발되었다. 저 분자량 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 새로운 행렬은 작은 분자 MSI에 큰 관심입니다. 이러한 행렬은 행렬 감소 신호에 따라 증가 분석 신호를 제공한다. 양이온 모드에서, 2,5 - 디 히드 록시 벤조산 (DHB) 및 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (CHCA)는 MSI 24이 일반적으로 사용 MALDI MS 매트릭스 아르 </SUP&gt;. 분석 물의 공간 지역화를 유지하도록 적합 행렬은 작은 결정을 형성하는 것이다. DHB 그러므로 승화를 이용한 행렬이 부분적으로이 문제를 극복하기 위해 개발되었으며, 인지질 22,25 민감한 이미징이 매트릭스의 사용을 허용 한 적용, 큰 결정체를 형성하는 경향이있다. 9-Aminoacridine는 포지티브 이온 모드 (26)와 음이온 모드에서 26-29 뉴클레오티드 및 인지질에 대한 양성 자성 분석 물의 MSI 사용되고있다. 메틸 아민은 지질 (30)의 효율적인 MALDI 검출을 제공하는 것으로 확인되었으며, 마우스의 뇌 영상 (31) 강글리오사이드 사용되어왔다. 푸리에의 초고 해상도 이온 사이클로트론 공명 (FTICR를) 변환 질량 분석기는 다소 매트릭스 신호 (32) 분석 신호를 해결하여이 문제를 완화 할 수 있습니다. FTICR-MS를 사용하는 또 다른 장점은 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도는 현상 감소는 것이다또한 이러한 간섭의 27을 감소 ED 33. 디 트라 놀의 사용 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 -이 dihydroanthracen -9 - 일) 티슈 이미징 MALDI 매트릭스 (34)는 이전에보고 된 바와 같이. 이 현재 연구에서, 상세한 프로토콜은 양이온 모드에서, 소 렌즈 조직 섹션의 표면에 내인성 지질 MSI 대한 DT의 사용을 위해 제공된다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

질량 분석 이미징 (MSI)을 중심으로 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 기반의 분석 기술을 이용하여, 조직 절편 표면에 화합물의 공간 지역화 및 분포 패턴을 결정한다. 저 분자량 (MW)의 화합물의 분석을 향상시킬 수있는 작은 분자 MSI 새로운 매트릭스가 필요하다. MALDI 배경 신호를 감소시키면서 이들 행렬들은 증가 된 피 분석 물 신호를 제공한다. 또, 푸리에 변환과 같은 초고 해상도 악기의 사용은 이온 사이클로트론 공명 (FTICR) 질량 분석기를, 변환 매트릭스 신호로부터 피 분석 물 신호를 분해하는 기능을 가지고 있으며, 이는 부분적 배경 MALDI 유래와 관련된 많은 문제점을 극복 할 수있다 행렬. FTICR MS에 의한 준 안정 매트릭스 클러스터의 강도의 감소는 또한 다른 악기에 매트릭스 피크와 관련된 간섭을 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 고해상도아직도 화학 물질 식별에 대한 신뢰를 제공하는 동안 그들은 동시에 많은 화합물의 분포 패턴을 생성 할 수 있습니다와 같은 FTICR 질량 분석기 등의 장비는 유리하다. 디 트라 놀 (DT는, 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 조직 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다. 이 연구에서 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 포유 동물 조직 섹션의 표면에서 내인성 지질의 MALDI 이미징에 대한 DT의 사용에 대한 프로토콜은 초고 해상도 하이브리드 극에 FTICR 계기가 제공되었습니다.

<html> ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 단면과 해동이 장착 된 조직 샘플을 볼 수 찢지 말고 그대로 있어야한다. 많은 조직의 경우, ITO 코팅 된 유리 슬라이드에 직접 장착 조직 해동이 허용됩니다. 직접 장착 해동이 (그림 1a)를 사용하는 경우 이러한 소 렌즈와 같은 일부 특정 조직의 경우 조직의 광범위한 찢어 종종 볼 수 있습니다. 에탄올 또는 포름산과 ITO 유리 슬라이드의 프리 코팅 <stro...

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Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K 조회수.  University of Victoria.  디 트라 놀 (DT; 1,8 - 디 히드 록시 -9,10 - 온라인 dihydroanthracen -9 - 일) 이전에 작은 분자의 티슈 이미징 MALDI 매트릭스로서보고되었다;에서 내인성 지질의 MALDI 이미징 DT의 사용을위한 프로토콜 초고 해상도 극 - FTICR 악기에 긍정적 인 이온 MALDI-MS에 의한 조직 섹션의 표면은 여기에 제공됩니다. 

비디오: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

아크릴 아미드 기반 Hydrogels을 사용하여 세포 기능에 매트릭스 강성의 영향을 공부

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

자기 공명 영상을 사용하여 혼합 Quantifying

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

단일 및 다세포 상황에서 Invadopodia로 인한 세포 외 기질 Proteolysis의 양적 측정

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

질량 분석기 분석을위한 펩티드로 조직과 소화에서 세포 외 기질 단백질의 농축

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

개별 세포 유형의 전사 프로파일 링을위한 도구로 레이저를 이용한 이외에 Microdissection (LAM)

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

사파이어와 OPO 레이저 기반 표준 레이저 스캐닝 현미경 :에 Ti에 코 히어 런트 반 스톡스 라만 산란 (CARS) 시스템의 구현

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

세포 유래 세포 외 매트릭스의 빠른, 분리, 기능 연구에 대한 확장 방법, 및 분석

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated exocytosis is fundamental for intercellular communication and is a key mechanism for the secretion of neurotransmitters, hormones, inflammatory mediators, and other compounds, by a variety of cells. At least three distinct mechanisms are known for regulated exocytosis: full exocytosis, where a single SG fully fuses with the plasma membrane, kiss-and-run exocytosis, where a single SG transiently fuses with the plasma membrane, and compound exocytosis, where several SGs fuse with each other, prior to or after SG fusion with the plasma membrane. The type of regulated exocytosis undertaken by a cell is often dictated by the type of secretory trigger. However, in many cells, a single secretory trigger can activate multiple modes of regulated exocytosis simultaneously. Despite their abundance and importance across cell types and species, the mechanisms that determine the different modes of secretion are largely unresolved. One of the main challenges in investigating the different modes of regulated exocytosis, is the difficulty in distinguishing between them as well as exploring them separately. Here we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran as an exocytosis reporter, and live cell imaging, to differentiate between the different pathways of regulated exocytosis, focusing on compound exocytosis, based on the robustness and duration of the exocytic events.

Here we detail a method for live cell imaging of regulated exocytosis. This method utilizes FITC-dextran, which accumulates in lysosome-related organelles, as a reporter. This simple method also allows distinguishing between different modes of regulated exocytosis in cells that are difficult to manipulate genetically.

이미징 FITC-dextran 규제 Exocytosis 위한 기자로 서

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...