Name: measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

1. 샘플 준비 <ol><li> (; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1,118w) UAS-GCaMP5G (19) 파리에 GAL4 3,22 드라이버 라인을 교차. 십자가가 25 ° C에서 성장 할 수 있습니다. 참고 : 생성은 형광 신호 강도를 향상하는 데 도움이 할 수있는 GAL4 또는 UAS-GCaMP 유전자의 여러 복사본으로 날아갑니다. Gr68a-GAL4 드라이버의 제어하에 발현 될 때 UAS-GCaMP 트랜스 (UAS-GCaMP3)의 이전 버전들은 매우 약한 형광 강도를 나타내었다. <ol><li> 수집 섹스 새로 eclosed 성인 파리로 구분하고 25 ° C에서 올립니다. 참고 : GCaMP5G의 개화의 기준 레벨이 14~28일 세 사이 파리에 최적입니다. 섹스에 의해 파리를 분리하면 신경 반응에 영향을 미칠 수있는 사회적 상호 작용의 가능성을 배제. </li></ol></li><li> CO 2의 온화한 기류 하에서 비행을 마취. </li><li> f를를 부착LY 먼저 0.17 mm의 커버 슬립의 중심 매니큐어의 작은 방울을 배치하여 유리 커버 슬립에 관한 것이다. 부드럽게 명확한 매니큐어의 드롭 옆에 비행을 배치하고 전체 드롭이 즉시 적용되어 있는지 확인합니다. </li><li> 8 배의 배율로 사용되는 해부 실체 현미경 아래 단계 1.5 및 1.6를 수행합니다. </li><li> 파리의 앞다리를 확장 젖은 붓을 사용합니다. 첫 번째와 다섯 번째 눈꺼풀 세그먼트 (그림 2A)를 통해 테이프의 두 개의 얇은 스트립을 배치하여 위치에 앞다리를 고정합니다. 이 영상 (그림 2B)에 대한 눈꺼풀 부분을 T2-T4를 노출합니다. </li><li> 프로보 시스에 이미지 뉴런 위해, labellum (그림 2C, D)를 노출하는 코의 연단을 통해 테이프의 얇은 스트립을 배치합니다. </li><li> 커버 슬립 표면 위로 흐르는에서 솔루션을 방지하기 위해 PAP 펜으로 비행 주위에 소수성 장벽을 그립니다. 설치 후 30 분 이내에 측정을합니다. </li></ol> 자극 2. 준비해결책 <ol><li> 친 유성 리간드를 희석 PBST 용액 (예 : 본 연구에서 사용 CH503 등) : 137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.8 mM의 KH 2 PO 4, 0.1 % 트리톤 X-100 (V / V ); pH가 7.4. <ol><li> PBST를 사용하여 리간드를 1 ㎎ / ㎖의 스톡 용액을 만든다. PBST를 사용하여 모액의 모든 연속 희석액을 준비한다. 주 : 관심있는 리간드의 용해도에 따라 다양한 용매는 리간드를 용해 필요할 수있다. 다양한 용매 CH503의 용해도는하기 표 1에 기재되어있다. 다른 용매는 달리 PBST 형광의 증가를 생성하지 않았다. </li></ol></li></ol> 미각 신경 및 이미지 획득 3. 자극 <ol><li> 10 μL의 피펫을 사용하여 눈꺼풀 세그먼트에 PBST 10 μl를 배치합니다. 참고 :이 단계는 다리를 습하게하고 표류에서 눈꺼풀 세그먼트를 방지 할 수 있습니다. </li><li> SU의 카메라를 지닌 광학 시스템을 사용fficient 속도와 감도가 높은 시간 해상도에서 좋은 형광 신호를 달성했다. 참고 :이 연구에서 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경과 sCMOS 카메라 (자료 목록 참조)를 사용했다. </li><li> 특정 눈꺼풀 세그먼트와 신경 세포를 선택하는 이미징합니다. 세 가지 사전 자극 공 촛점 Z - 스택을 획득. <ol><li> 이상적으로, 사용 취득 설정이 여전히 셀 전체 볼륨을 캡처하는 동안 최대 시간 해상도를 허용하기에 충분히 빠르다. 예를 획득 설정은 다음과 같습니다 매 2 초를 캡처 × 2 2, 6 × 0.5 μm의 2 광학 부분을, 비닝 200 밀리 초 노출. 주 : 고정화 다리는 GCaMP 신호를 식별 할 수있는 표백으로 30 초 간격으로 최대 10 분 동안 성공적으로 묘화하고있다. 긴 녹화 시간의 경우, 다리가 커버 슬립의 위치에 아주 단단히 고정되어 있는지 확인합니다. </li><li> 높은 신호대 전체 IMA 동안 최소 광표백로 달성을위한 레이저 출력을 최적화정권 카. 여기에 설명 된 실험을 위해, 영상 30 %의 전송에 다리와 코에 Gr68a 및 ppk23의 미각 신경 세포를 모두 491 nm의 다이오드 레이저 (100 mW의)를 사용합니다. 여전히 충분한 공간 해상도를 달성하면서 짧은 노출 시간을 허용하는 2 × 2 비닝 (binning)을 사용합니다. 주 : 레이저 출력 설정은 1.2 내지 4.5 배 증가의 범위에서 형광 변화의 검출을 허용하도록 최적화되었다. </li></ol></li><li> 피펫 눈꺼풀 세그먼트 상에 자극 용액 10 μL. 제어 실험을 위해, PBST의 또 다른 10 μl를 추가합니다. 즉시 117 이후 자극 이미지를 수집. 참고 취득한 후 자극 매수의 형광의 최대 변화에 도달 한 시간의 양 (약 2 분)에 기초한다. <ol><li> 중요한 단계 :이 앞다리 위치에서 이동하게하기 때문에 준비에 솔루션을 피펫 팅하는 동안, 피펫 팁으로 비행을 터치하지 않습니다. 참고 : 또는 사용정확하게 눈꺼풀 부분에 자극 가까이를 포함하는 유리 모세관을 배치하는 미세 조작기는 이미지화된다. 제조자의 지시에 따라 세포 마이크로 인젝션 디스펜서를 이용하여 자극의 볼륨 조절을 제공한다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 처리 및 분석 : 응답의 정량화 <ol><li> 피지 (사용 공 촛점 Z - 스택의 일련의 열기 <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 또는 ImageJ에 ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) (24) 이미지 분석 및 처리 소프트웨어를. </li><li> 120의 시점마다 여섯 Z 슬라이스의 합계 강도 투영을 만든다. <ol><li> &quot;이미지&quot;에서 &quot;스택&quot;옵션을 선택합니다. 또한, &quot;Z 투사&quot;옵션을 선택하고 정지 슬라이스로 시작 슬라이스 및 &quot;4&quot;로 &quot;1&quot;을 입력합니다. 프로젝션 타입의 경우, R을 선택20; 합 조각 모든 시간 프레임을 &quot;풀다운 메뉴에서, 그리고 선택&quot; &quot;. </li></ol></li><li> 셀 몸이나 신경 돌기 주위에 경계를 그립니다 자유 선택 도구를 사용하여 관심 (ROI)의 영역을 정의합니다. 은 &quot;분석&quot;레이블을 클릭하고 &quot;도구&quot;에서 &quot;투자 수익 (ROI) 관리자&quot;옵션을 선택합니다. </li><li> 은 &quot;분석&quot;메뉴 아래의 &quot;설정 측정&quot;옵션을 선택하고 통합 밀도, 지역의 상자를 선택하여 투자 수익 (ROI)의 형광을 정량화 평균과 최대 회색 값과 레이블입니다. 그 후, 투자 수익 (ROI) 관리자 메뉴에서 &quot;추가&quot;옵션을 선택하고, 또한 &quot;멀티 측정&quot;옵션을 선택합니다. 참고 :이 선택한 각 매개 변수에 대한 값을 팝업 상자를 생성합니다. </li><li> 화소의 중에 포화 도달 했으므로되도록하여 최대 계조 값을 확인 (예를 들어, 16 비트의 카메라 65535). 참고 : 실험을 위해 t에 표시그의 종이, 응답은 ΔF / F의 최대 증가가 관찰되었다 위치에 따라 세포 기관 또는 신경 돌기에서 어느 측정 하였다. </li><li> 다음과 같은 시점 t에서 형광 (ΔF / F)의 최대 상대적인 변화를 계산이다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> 각 F (셀) 값에서 빼기 배경 형광. 배경 형광을 정량화하기 위해, 감지 뉴런없는 앞다리 (또는 코)의 영역에서 동등한 크기와 모양의 ROI의 통합 밀도를 측정한다. </li><li> 포스트 자극 형광 F (셀) t 정량화 자극 후의 시각 &quot;t&quot;에서 전지 본체 또는 프로세스의 ROI의 집적 밀도를 측정한다. </li><li> 예비 자극 형광을 정량하기 위해, F (셀) t = 0, 동일한 방법으로 상기 전지 본체 또는 프로세스의 사전 자극 이미지를 분석포스트 자극 신호. F (셀) t = 0을 결정하기 위해 3 이미지의 평균 집적 밀도를 사용합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that there are no competing financial interests.

우리는 여기에 2 개의 다른 감각 기관에 초파리 주변 신경 세포의 라이브 칼슘 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다. 칼슘 2 +는 CH503은 용량 의존적 양적했다 페로몬 리간드에 의해 유도 Gr68a - 뉴런에서 GCaMP 형광 반응을 -evoked. 이 같은 phasic와 토닉 응답 등의 다른 신경 응답 패턴을 식별하는 것이 가능했다. phasic 반응을 나타내는 신경 연속 자극에 빠른 적응?...

동물들은 생존과 재생에 필수적인 의사 결정을 중재하는 후각과 미각 정보에 의존합니다. 감지 신경계에 의해 처리하는 방법을 화학 감각 단서 이해하는 감각 수용체 (들) 및 해당 화학 리간드의 확인이 필요합니다. 초파리는 휘발성 및 비 휘발성 화합물의 엄청난 다양성을 감지하고 생리를 연구하기에 좋은 모델입니다 메커니즘은 chemosensation을 기본. 후각 기관은 휘발성 분자를 감​​지하는 동안, 미각 기관은 낮은 휘발성 화합물을 검출하는 전문으로하고 있습니다. 여기서는 직접 저 휘발성 친 리간드 초파리 melanogaster의 맛 기관에서 신경 반응을 측정하는 방법을 제시한다. 파리의 미각 기관은 앞다리, 코, 날개 등이 있습니다. S 응답 sensilla 알려진 모발 형 구조는 미각 기관의 표면에 분포ugars, 쓴 맛, 소금, 물, 페로몬 8. sensilla 맛 강모으로 형태 학적으로 분류 된 맛은 9 쐐기. 긴 (L 형)으로 분류 된 labellum에 약 31 맛 강모, 짧은 (S 형) 및 중간 (i 형) 모폴로지가 있습니다. 설탕에 생리 학적 반응하는 &#39;L&#39;과 &#39;의&#39;sensilla 집 4 감각 뉴런 (S 셀), 저염합니다 (L1 세포), 높은 소금과 쓴맛 화합물 (2 계층 셀) 및 물 (승 전지) (10) 11. 다른 응답 동안 높은 소금 (12)에 낮은 소금과 설탕에 모두 응답 하나의 &#39;난&#39;sensilla 집이 감각 뉴런,. 남성의 약 41 맛 sensilla와 앞다리에 각각 분산 여성 26 sensilla이 있습니다. 둘 다 남성과 여성의 경우, midleg 21 sensilla 및 뒷다리 (13)에 대해 22 sensilla있다. 다리에 맛 sensilla로 둘러싸인 미각 신경 세포도 다 있습니다L1, L2, W 및 S 타입으로 lassified. 단일 뉴런에서 전기적 활성도를 측정하기위한 하나의 표준 방법은 이온 흐름을 기록하는 세포 또는 세포의 전극을 사용한다. 전극 측정은 신경 기능은 초파리 종, 나방, 신경 라벨링에 대한 광범위한 유전 적 도구가 부족 꿀벌로 비 모델 생물에서 공부 할 수 있습니다. 전기 생리 학적 방법을 일상적으로이 방법을 적용 4,13,14 sensilla 초파리 맛의 활동을 측정하는 데 사용되었지만 그러나, 여러 기술적 과제를 제시한다. 먼저, 칫솔모가 형태학 및 공간적 위치에 기초하여 식별되어야 맛. 식별되면, 전기 생리 학적 측정은 sensilla의 작은 크기에 의해 방해 될 수 의한 위치로 액세스 가능성을 제한 및 맛 화학적 자극 제어 된 양을 적용하는데 어려움이 모. 또한 sensilla의 자극은 하나 이상의 신호를 생성 할 수있다신경 세포 유형 15. 둘째, 전기 신호의 검출은 전자 기기로부터의 기계적인 진동과 노이즈로 인한 배경 잡음에 의해 혼동 될 수있다. 잘못 사용되는 경우 14 번째, 날카롭게 전극의 사용은 플라이 제조를 손상 할 수있다. 마지막으로, 전기 생리학 장비를 조립하는 자극 전달, 신호 기록 및 데이터 분석을위한 특수한 전자 부품을 필요로하고 비용이 많이들 수있다. D.에서 melanogaster의 유전자 인코딩 툴의 가용성은 뉴런의 작은 집단의 반응을 조사 할 수 있도록 영상 기술의 발달을 촉진 하였다. 하나의 이러한 접근은 CaLexA 기자 (16)의 사용이다. 이 방법에서는 LEXA-VP16 전사 인자 및 칼슘 민감성 NFAT 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 융합된다. 단백질 포스파타제 칼시 뉴린의 칼슘 활성화 차례, facilita에서 NFAT의 탈 인산화를 촉진하고핵으로의 수입을 TES. 핵 내부에서 LEXA 도메인 따라서 기능적으로 활성화 된 뉴런의 지속적인 식별을 허용, 녹색 형광 단백질 (GFP) 기자의 발현을 지시하는 LexAop-DNA 결합 모티프에 결합한다. 이 접근법은 취기 (16)에 라이브 파리 노광 다음 더듬이 로브 특정 후각 사구체의 응답을 측정하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 최근 IR52c 미각 수용체 신경의 생리적 반응은 CaLexA 7을 사용하여 실시간 파리에서 측정 하였다. 최대 6 주 GFP의 전사를 향상시키기위한 그러나,이 연구를 위해,이 나이에 파리에 필요했다. 항 GFP 항체로 면역 염색하면 CaLexA 신호를 강화하는데 사용될 수 있지만,이 방법에 따라서, 라이브 세포 이미징을위한 가능성을 배제 조직의 고정을 필요로한다. 유 전적으로 인코딩 된 칼슘 표시기 단백질 GCaMP는 광범위의 숫자에 신경 반응을 연구하는 데 사용되었습니다종 17. 단백질 GCaMP은 신경 자극하기 전에 낮은 강도와​​ 형광. 자극의 적용은 칼슘의 유입의 결과로 신경 세포의 활동 전위를 트리거합니다. 칼슘 결합 GCaMP, 그것은 밝게 강도 (그림 1)과 형광 원인, 구조적 변화를 겪는다. 최근에 개발 된 단일 뉴런 칼슘 촬상 방법은 앞다리 특정 Gr61a의 미각 신경 (18)에 대한 리간드로서 포도당을 식별하는 데 사용 하였다. 본 연구에서는 Gr61a의 미각 뉴런 GCaMP 발현 형질 전환 초파리 해부 앞다리는 촬상 전에 아가의 층으로 덮었다. 그러나, 해부 조직의 사용에 따라서 측정 시간 및 검출 감도를 제한 GCaMP 발현의 최종 런을 일으킬 수있다. 또한, 아가로 인해 높은 형광 배경 레벨 및 광 산란 특성에 감도를 제한 할 수 있습니다. 티ㅇ 이러한 단점들을 해결, 우리는 앞다리와 코 그대로​​ 동​​물의 미각 신경 세포의 생리적 반응을 기록하는 GCaMP 매개 칼슘 이미징의 사용을 설명합니다. 우리는 초파리 지질 페로몬 유 전적으로 인코딩 GCaMP5G 19 발현 생리 Gr68a의 반응과 ppk23 뉴런 (3 R, (11) Z 19 Z) -3- 아세 톡시 11,19-octacosadien -1- 올 (CH503) 20 표시 21. 신경 반응은 페로몬 자극 동안 GCaMP5G 형광 신호의 증가를 정량함으로써 측정된다. 이 프로토콜에서, 신경 세포에서 신경 개별 활성화 패턴을 구별하기에 충분한 120 초 총 지속 기간 동안 영상화된다.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

포유 동물과는 달리, 이러한 초파리와 같은 곤충은 여러 맛 기관이있다. 다리, 코, 날개 초파리의 산란관의 화학 감각 뉴런 미각 수용체 1,2, 이온 채널 3-6, 휘발성 및 비 휘발성 감각 큐의 검출에 참여하는 이온 성 수용체 (7)를 표현한다. 이 신경 세포는 직접 식품, 유해 물질 및 페로몬 등 tastants 문의 따라서 이러한 공급, 달걀 누워와 결합 많은 복잡한 행동에 영향을 미친다. 전극 기록 칼슘 촬상 널리 이러한 tastants 의해 유발 된 신경 세포 반응을 정량화하는 곤충에 사용되어왔다. 그러나, 전기 생리학은 세포 유형, 크기 및 위치에 따라 기술적으로 어려울 수있는 하나의 맛 sensillum 특화된 장비 및 구하는 측정을 필요로한다. 또한, 초파리에서 단일 신경 세포 해상도는 맛 sensilla 허우 때문에 달성하기가 어려울 수 있습니다화학 감각 신경 세포의 자체 이상의 유형입니다. 여기에 설명 된 실시간 칼슘 이미징 법 라이브 파리 단일 미각 뉴런의 반응을 측정 할 수있다. 이 방법은 수성 용매에 대한 낮은 용해도를 지질 페로몬 및 기타 리간드 유형의 연결 반응을 영상화에 특히 적합하다.

GCaMP 칼슘 표시기는 유 전적으로 Gr68a-GAL4 또는 ppk23-GAL4 드라이버를 사용하여 표현 하였다. 앞다리 신경 세포와 비 신경 지원 세포의 고유 한 인구는 각 드라이버 (그림 3A-C)에 의해 표시된다. 친 유성 페로몬 CH503 리간드에 특이 적 반응 Gr68a-GAL4 관찰하고 ppk23-GAL4 세포 GCaMP (도 3D)을 표현. 상대적인 GCaMP5G 신호 (ΔF / F)의 형광 강도의 변화는 CH...

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Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K 조회수.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

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Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

칼슘 지표로 로딩 Drosophila 신경 터미널

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

연구

생물학

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

의 냄새-evoked 응답의 칼슘 이미징 Drosophila Antennal 엽

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

초파리 멜라노가스터에서 학습 유발 시냅스 가소성의 생체 내 광학 칼슘 이미징

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

생체 내 성체 초파리에서 미각 유도 신경 반응의 칼슘 이미징

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

생체 내 Drosophila melanogaster에서 Synaptically Localized Calcium Sensors를 사용한 칼슘 이미징

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
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Drosophila melanogaster (fruit fly)

Adult

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

Source: Shankar, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53392">Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Drosophila의 감각 뉴런에서 생리적 반응 감지

1. Sample Preparation

	Cross the Gal4 driver line to UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster flies (w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Allow the cross to grow ...

의 생리적 반응을 측정

요약

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