이것은 일상적인 실험실 장비를 사용하여 루트 시스템 아키텍처를 측정하는 비침습적 수경 재배 방법입니다. 이 프로토콜을 사용하면 수동으로 퍼뜨려 식물의 전체 뿌리 시스템을 완전히 시각화 할 수 있습니다. RSA 분석의 주요 장점 중 하나는 원치 않는 원소 오염을 도입할 필요 없이 식물 뿌리 시스템을 연구할 수 있다는 것입니다.
이 방법은 식물 시스템의 RSA와 호르몬, 영양소 및 기후 조건을 포함한 직접적인 환경 상호 작용을 기록할 수 있습니다. 애기장대 씨앗의 표면 살균을 실온에서 증류수에 약 100개의 작은 스쿱을 담가 시작합니다. 30분 후, 탁상용 원심분리기를 사용하여 500G에서 5초 동안 종자를 잠시 원심분리합니다.
다음으로, 물을 경사 건조시키고, 튜브를 몇 초 동안 볼텍싱하기 전에 700 % 에탄올 700 마이크로 리터를 첨가하십시오. 씨앗을 다시 원심 분리하십시오. 필요한 경우 볼텍싱과 원심분리를 반복하여 70% 에탄올 처리가 3분을 초과하지 않도록 합니다.
3 분 후 즉시 씨앗을 멸균 수로 헹굽니다. 다음으로, TWEEN 20 한 방울을 함유하는 희석된 상업용 표백제를 사용하여 7분 동안 종자를 처리한다. 튜브를 빠르게 8-12회 뒤집어 씨앗을 표백제 용액과 혼합합니다.
간단한 원심 분리 후, 1 밀리리터 피펫을 사용하여 상청액을 경사 제거하고, 동일한 와동 절차에 따라 멸균 된 물로 종자를 적어도 5 회 헹굽니다. 표면 멸균 된 씨앗을 물에두고 성층화를 위해 섭씨 4도에서 2-3 일 동안 배양하십시오. 증류수로 채워진 표준 자홍색 상자 절반을 오토클레이브합니다.
오토클레이브 폴리카보네이트 시트를 직사각형의 중간 지점이 있는 4 x 8cm 직사각형으로 절단하여 두 개의 직사각형이 함께 슬롯되어 X 모양을 형성할 수 있도록 합니다. 이 설정을 사용하여 6 x 6cm 정사각형으로 자른 250마이크로미터 기공 크기의 폴리프로필렌 메쉬를 고정합니다. 층류 기류 캐비닛에서 비타민과 1.5% 자당이 포함된 멸균 하프 MS 기본 배지를 각 상자에 추가하여 폴리프로필렌 메쉬의 하단 가장자리에 도달합니다.
표면 멸균 된 씨앗을 수경 재배로 메쉬에 뿌리고 3 일 동안 재배하십시오. 3 일 후, 묘목을 500 마이크로 미터 기공 크기의 메쉬로 옮기고 이틀 동안 자랄 수 있습니다. 다음으로, 묘목을 대조 배지와 실험 배지로 옮기고 씨앗이 7 일 동안 자라게합니다.
10-20 밀리리터의 고압 증기 멸균 여과 된 수돗물을 페트리 플레이트에 첨가하십시오. 500 마이크로 미터 메쉬에서 묘목을 부드럽게 잡아 당깁니다. 둥근 아트 브러시를 사용하여 물이 채워진 접시에 식물과 같은 뿌리를 뿌리고 물에 담그십시오.
접시를 약간 기울여 물기를 제거합니다. 이 페트리 플레이트를 적절하게 스캔하거나 사진을 찍으십시오. 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 루트 시스템 아키텍처 또는 RSA 특성을 측정한 다음 분석할 파일을 엽니다.
배율을 설정한 후 직선 도구를 사용하여 배율 막대의 윤곽선을 그리는 선 선택을 만듭니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하거나, 두 번 클릭하거나, 시작 부분의 상자를 클릭하여 개요를 마칩니다. 알려진 축척 막대의 길이를 픽셀 단위로 측정하려면 분석을 클릭한 다음 도구 모음에서 측정을 클릭합니다.
픽셀 길이를 기록해 둡니다. 분석 탭에서 배율 설정 탭을 클릭하여 배율 설정 대화 상자를 엽니다. 거리 (픽셀 단위) 필드에서 픽셀 길이를 확인합니다.
그런 다음 알려진 거리 필드에 축척 막대 값을 입력하고 길이 단위를 밀리미터로 설정합니다. 확인을 클릭하여 이 특정 이미지의 눈금을 잠급니다. 세그먼트 선 도구를 사용하여 루트 길이의 윤곽선을 그리는 선을 선택합니다.
윤곽선을 완성한 후 윤곽선을 따라 작은 흑백 핸들을 클릭하고 드래그하여 선 선택을 조정합니다. ImageJ의 분석 탭에서 측정값 명령을 선택하고 루트 길이를 수량화합니다. 결과 창을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 팝업 메뉴에서 모두 복사를 선택하고, 스프레드시트로 전환하고, 데이터를 붙여넣어 측정된 데이터를 스프레드시트로 전송합니다.
RSA 특성 측정 및 계산의 경우 배축 접합부에서 루트 팁 끝 사이의 기본 루트 길이를 측정합니다. 그런 다음 1차 측근 또는 1도 LR 길이와 2차 측근 또는 2도 LR 길이를 측정합니다. 완료되면 모든 측정값을 복사하여 스프레드시트에 붙여넣습니다.
첫 번째 측면 루트 신흥 지점부터 마지막 측면 루트 신흥 지점까지 이어지는 기본 루트 또는 BZPR의 분기 영역을 측정하고 기록합니다. 마찬가지로 BZPR의 경계 내에서 발생하는 측근의 수를 기록합니다. 다음으로, 첫 번째 및 상위 차수 측근의 평균 길이를 측정합니다.
기본 측근의 전체 길이를 기본 측근의 총 수로 나누어 기본 측근의 평균 길이를 도출합니다. 그런 다음 2차 측근의 평균 길이를 측정하려면 2차 측근의 전체 길이를 2차 측근의 총 수로 나누어 2차 측근의 평균 길이를 계산합니다. 1차 측근의 수를 BZPR의 길이로 나누어 1차 측근 밀도를 측정합니다.
다음으로, 개별 측근의 분지 영역을 측정하고 2차 측근 길이의 분지 영역의 길이로 2차 측근 수를 나누어 2차 측근 밀도를 계산합니다. 완료되면 총 루트 길이 또는 TRL을 측정합니다. 이것은 1차 뿌리와 1차 및 2차 측근 길이의 집합체입니다.
이 실험에 사용된 수경재배 시스템은 무기 인산염 결핍 및 충분한 조건 하에서 명백한 대조 표현형을 반영하여 잘 작동했습니다. 다양한 RSA 형질이 수경 조건에서 대조되는 무기 인산염 체계 하에서 분석되었습니다. 무기 인산염 결핍 처리는 무기 인산염 충분 조건에 비해 더 짧고, 더 얕고, 덜 분지된 RSA를 나타내는 뿌리 표현형을 불러일으켰습니다.
일차 뿌리 길이는 무기 인산염 결핍 조건 하에서 현저하게 감쇠되었다. 1.25 밀리몰의 무기 인산염 또는 대조 배지의 존재 하에서 1차 뿌리 길이의 유의하고 빠른 증가는 수경 재배 시스템의 효율성을 나타내고 생리학적 변화를 적절하게 반영했습니다. 분지화 영역은 무기 인산염 결핍 조건 하에서 현저히 감소되었다.
일차 측근의 평균 길이는 파이 결핍 상태에서 유의하게 감소하였다. 평균 2차 측근 길이는 인산염 결핍 상태로 인해 유사하게 감소했지만 평균 1차 측근 길이보다 양이 적었습니다. 1차 및 2차 측근의 수는 대조군인 1.25밀리몰 무기 인산염 조건에 비해 인산염 결핍 조건에서 크게 감소했습니다.
1차 측근 밀도는 대조군, 1.25 밀리몰 무기 인산염 조건에 비해 인산염 결핍 조건 하에서 변화되지 않았다. 2차 측근 밀도는 큰 변화를 보이지 않았으며, 이는 RSA 가소성에 대한 통찰력을 얻기 위한 측근 밀도의 중요성을 나타냅니다. 나는 핀셋을 사용하여 메쉬에서 묘목을 부드럽게 제거했습니다.
나는 둥근 브러시, 모든 기본 뿌리를 사용하여 물이 채워진 판에 뿌리를 펼치고 똑바로 펼치고 측면 뿌리를 대칭으로 펼치고 1 차 측면 뿌리와 연결된 2 차 측면 뿌리를 펼칩니다. 유사한 방법을 사용하여 애기장대 식물 팁의 그을음 면적을 계산할 수 있습니다. 애기장대 잎을 다른 판에 뿌린 다음 무료로 제공되는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 이미지를 캡처하고 분석하여 그을음 면적을 결정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 루트 시스템 가소성에 대한 환경의 영향에 대한 질문에 답하는 데 사용할 수 있습니다.
