이 작품은 호주 연구 위원회 연방 발견 프로젝트 보조금 #1096623 의해 지원되었다.

1. 재조합 벡터 만들기
<ol><li>N-또는 C-말단이 관심의 바이러스 유전자를 라벨에 기르는 데 필요한 150bp 길이의 상동성 영역(왼쪽 및 오른쪽 팔이라고 함)을 식별합니다(그림 1b참조).</li>
	<li>선택의 제한 부위에 의해 분리된 150 bp 좌우 팔을 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 설계한다. 이 전체 시퀀스는 또한 두 번째 제한 사이트 쌍(첫 번째 쌍과 다른)에 의해 측면에 있어야 만 한 번 합성된 TDS 벡터에 통합할 수 있습니다. 서열이 원하는 삽입 부위와 프레임에 있는 제한 부위로 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 주의하십시오.</li>
	<li>합성을 위해 올리고뉴클레오티드를 설계할 때 왼쪽팔과 오른쪽 팔 사이에 제한 부위를 통합하면, 이는 선택의 형광 태그의 열린 판독 프레임을 측면으로 하는 것과 일치해야 한다(도 1b참조). TI 제한 부위를 왼쪽 팔과 형광 태그의 시작 사이에 3개의 아미노산 링커로 사용할 수 있다.</li>
	<li>PCR에 의해 형광 태그의 양쪽에 이러한 동일한 제한 사이트를 통합합니다(그림 1c참조).</li>
	<li>합성된 조각을 TDS 벡터로 복제합니다.</li>
	<li>형광 태그를 상동성의 왼쪽 및 오른팔 영역 사이의 제한 부위를 사용하여 결과 재조합 벡터로 복제합니다(그림 1d참조).</li>
</ol>2. 재조합 바이러스 생성
<ol><li>도 2에따라, 감염의 복합성(MOI)> 1에서 혈청이 없는 매체에서 백시니아 바이러스를 가진 BS-C-1 세포의 단층을 감염한다.</li>
	<li>1 시간 감염 후, 덜벡코의 수정 독수리 매체 (DMEM)와 구조 세포 (DMEM) 및 혈청없는 매체에서 3 :1의 비율로 재조합 벡터 플라스미드 및 경질 시약의 혼합물과 트랜스펙트.</li>
	<li>24 시간 후에, 태아 소 혈청 (FBS)를 포함하는 DMEM에 있는 세포를 긁어 내고 복구하고 열린 세포를 끊고 바이러스 입자를 풀어 놓기 위하여 3개의 동결 해동 주기를 능력을 발휘합니다.</li>
	<li>10% FBS DMEM 및 GPT 선택 시약 마이코페놀산(25 μg/ml) 및 크산틴(250 μg/ml)의 액체 오버레이로 플라크 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다.</li>
		<li>개별 플라크의 적절한 분리를 보장하기 위해 바이러스 입자를 포함하는 동결 해동 세포의 직렬 희석으로 100 % 컨웰릭 셀 단층층을 감염시킵니다.</li>
		<li>GPT 선택 시약을 함유한 DMEM을 함유한 액체 10% FBS오버레이- 진협산과 산틴은 각각 25μg/ml 및 250 μg/ml의 최종 농도로.</li>
	</ol></li>
	<li>24 시간 인큐베이션 후, 액체 오버레이를 제거하고 형광 현미경을 사용하여 TDS 벡터에서 바이러스로 mCherry를 통합하는 데 해당하는 확산 적색 형광을 나타내는 플라크를 찾습니다. 표적 유전자 및 선택된 형광 태그에 따라 태그된 유전자의 국소형 형광도 동일한 적색 플라크에서 관찰될 수 있다.</li>
	<li>피펫 팁으로 스크래핑을 하고 DMEM을 포함하는 5% FBS의 100 μl을 사용하여 각 재조합 바이러스에 대해 여러 플라크를 선택하고, 스크랩된 세포의 3라운드가 재조합 바이러스를 방출합니다.</li>
	<li>성장 매체에서 GPT 선택 시약으로 재조합 바이러스를 증폭시키기 위해 12웰 플레이트의 세포의 단층층에 동결 해동 바이러스를 함유한 DMEM을 추가한다. 성공적인 증폭을 긁어 24 시간 감염.</li>
	<li>붉은 형광을 나타내는 성공적으로 증폭 된 플라크의 플라크 분석, 다음과 같이 아가로즈 오버레이 및 GPT 선택이 이번에는 다음과 같이 수행하십시오.<ol>
<li>BS-C-1 세포의 단층으로 6웰 플레이트를 시드합니다.</li>
		<li>재조합 바이러스의 직렬 희석을 수행하고 FBS 무료 DMEM에서 바이러스의 희석이 증가함에 따라 우물을 감염시.</li>
		<li>1 시간 감염 후, 액체 매체를 제거하고 2.5 % FBS, 292 μg / ml L-글루타민, 100 U / ml 페니실린 및 100 μg / ml 연쇄 상감 시술을 포함하는 최소 필수 매체 (MEM)에서 0.5 % 아가로즈로 각각 잘 오버레이하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>감염 후 2-3일, GPT 선택 없이, 이번에는 다시 증폭하기 위해 빨간색과 선택한 형광태그의 색을 표시하는 플라크를 선택한다.</li>
	<li>선택 없이 아가로즈 오버레이로 다음 플라크 분석작업을 수행합니다.</li>
	<li>확산적 적색 형광을 잃어버린 플라크를 선택하지만 선택한 태그에 해당하는 국소형 형광을 유지합니다.</li>
	<li>mCherry 및 gpt 선택 유전자를 잃었지만 선택한 태그에 대응하는 국소형 형광을 유지한 재조합 바이러스의 순수한 재고를 얻기 위해 선택없이 플라크 정화를 계속합니다. 확인 주식은 플라크 분석에 의해 순수, 모든 플라크는 유사한 플라크 표현형을 가져야한다.</li>
	<li>바이러스 성 주식이 순수하도록 유전체 DNA의 PCR 검사를 사용합니다.<ol>
<li>삽입된 형광 유전자 자체를 증폭시키는 형광 유전자 삽입 부위및 프라이머를 측면에 있는 프라이머를 설계합니다. 이 프라이머의 다른 조합은 유전자 삽입을 검출하고 순도를 나타내는 PCR 앰플리턴을 생성합니다.</li>
		<li>BS-C-1 세포의 12웰 플레이트 단층의 한 우물에서 PCR을 선별하는 바이러스 성 주식을 증폭시한다.</li>
		<li>감염 후 24시간, 감염된 세포를 DMEM의 250 μl로 긁어냅니다.</li>
		<li>원심분리기 감염 세포(10분 당 18,000 x g, 4°C), 슈퍼나탄을 제거하고 500 μl TE(10m Tris-HCl 및 1mMM EDTA, pH 8)에서 세포 펠릿을 0.1%(v/v) SDS로 제거한다. 세포를 lyse 소용돌이.</li>
		<li>500 μl 페놀-클로로폼-이소아밀 아코홀을 넣고 섞어 넣습니다. 원심분리기 (4 분, 4 °C에 대한 18,000 x g). 상체를 가지고 반복합니다.</li>
		<li>1 ml 100% 에탄올(냉장) 및 50 μl 나트륨 아세테이트를 추가하여 상수에 에탄올 침전을 수행하여 혼합을 반전시합니다.</li>
		<li>하룻밤 -20 °C 또는 -80 °C에서 1 시간 동안 둡니다. 원심분리기(30분 동안 18,000xg, 4°C)는 모든 액체를 제거하고 침전된 DNA를 공기 건조시킬 수 있도록 합니다. 50 μl TE로 다시 중단합니다.</li>
		<li>게놈 DNA PCR 스크리닝을 위한 템플릿으로 이것을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 하나 이상의 태그를 들고 재조합 바이러스의 세대
<ol><li>형광 재조합 바이러스와 동일한 세포 단층을 코감염하여 프로토콜 1)에서 이중 또는 삼중 표지 바이러스를 만들거나 다른 태그로 반복 절차를 만듭니다.</li>
	<li>바이러스의 플라크 표현형 또는 PCR 스크리닝에 기초하여 바이러스를 정화하여 게놈 DNA를 분리합니다.</li>
</ol>

<ol>
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Methods. 186, 132-136 (2012).</li><li>Horsington, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A36-dependent+Actin+Filament+Nucleation+Promotes+Release+of+Vaccinia+Virus.">A36-dependent Actin Filament Nucleation Promotes Release of Vaccinia Virus.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li></ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 기술은 형광태그바이러스 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 생성을 위한 효율적이고 모듈적인 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 바이러스 게놈에 대한 유일한 변화가 태그 나 마커를 추가하여 선택 마커를 남기지 않도록합니다. 동종 재조합에 필요한 짧은 팔 길이는 직접 합성을 가능하게하여 PCR 및 복제의 몇 시간 소모적인 라운드를 제거하며, mCherry 및 신진 대사 GPT 선택의 형광은 바이러스 재조합 중간체를 분리하는 데 사용됩니다. 이러한 중급자는 선택의 제거 에 따라 태그된 유전자를 가진 바이러스 또는 다시 부모 유형으로 해결할 수 있다. 형광 및 대사 선택 모두의 사용을 포함하는 유사한 방법은 이전에 설명되었다27 이 연구에서 사용되는 방법은 호동성의 짧고 합성 된 영역을 활용하지만, 관심의 태그 유전자의 형광을 이미징하여 원하는 재조합 바이러스의 식별을 허용. 이 이 이차 선택은 플라크 분석에서 충분한 형광을 생성하는 높게 발현된 바이러스 유전자를 태그하는 것에만 적용됩니다. 대안적으로, 하나는 완전한 발현 카세트의 삽입을 상상할 수 있었다, 예를 들어 강한 바이러스 성 프로모터의 형광 단백질. 이 경우 좌우 팔은 태그되는 바이러스 유전자보다는 삽입 지점을 정의할 것이다.
실험 절차 중에 도움이 입증 된 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 위에서 설명한 2.3.3 단계의 액체 오버레이는 적색/녹색 형광 플라크의 검출 및 격리에 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 우리는 GPT 선택 시약과 아가로즈 오버레이의 조합이 재조합 바이러스의 성장을 억제하고 그러므로 전환 후 바이러스를 증폭시키는 첫번째 단계를 위한 액체 오버레이로 전환했다고 믿습니다. 또한 왼쪽 팔 재결합으로 인한 중간체가 플라크에서 관찰되는 확산 형광을 초래할 수 있으므로 농축 및 정제를 위해 국소화된 태그 색 형광을 나타내는 형광 플라크를 선택하는 것도 중요합니다. TDS 벡터내의 mCherry 마커 유전자는 또한 gfp로대체될 수 있고, 예를 들어, 형광태그로서 mCherry의 쉬운 편입 및 선택을 가능하게 한다.
위에서 설명 한 일부 기술은 재조합 vaccinia 바이러스를 만드는 설립 된 방법에서 약간 다릅니다. 예를 들어, 재조합제를 만드는 데 사용되는 바이러스의 MOI는 일반적으로 128미만이지만, 더 높은 MOI의 사용은 이 방법에 의한 재조합 vaccinia 바이러스의 생성에 충분하였다. GPT 선택 시약의 사용은 일반적으로 선택 시약(18)을가진 세포의 사전 배양을 요구하지만, 구조 단계 사후 감염 중에 그들을 추가하는 것은 여전히 원하는 재조합의 충분한 선택을 제공, 특히 형광 선택 마커의 존재로 인해 뿐만 아니라.
앞에서 언급했듯이, 이 기술의 한계 중 하나는 이차 형광 선택 단계가 플라크 분석에서 눈으로 검출할 수 있는 수준에서 고도로 발현되는 관심의 태그된 단백질에 의존한다는 것입니다. 이없이, 그것은 단지 mCherry 형광을 전시 바이러스를 정화 할 수있을 것입니다, 그 중 적어도 50 %는 원하는 재조합 바이러스를 포함 할 것, 이는 단계에서 설명 PCR과 같은 분자 전략에 의해 식별 될 수있다 2.12 위의. 또 다른 제한은 그들의 태그의 결과로 특정 단백질의 불활성화 일 수 있습니다. 형광 태그는 돌연변이를 겪거나 시간이 지남에 따라 통과와 재조합 바이러스에 의해 절제 될 수있다. 따라서, 현미경 및 PCR에 의한 재조합 바이러스 주식의 정기적인 샘플링을 권장합니다. 마지막으로, 단일 바이러스에 통합될 수 있는 형광 태그 단백질의 수에 제한이 있을 수 있다. 이 것의 한 가지 측면은 그들 모두를 동시에 시각화 하는 기능; 사용 가능한 형광 태그의 방출 스펙트럼의 중복 특성을 감안할 때, 최소한의 스펙트럼 출혈을 보장하기 위해 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 또한, GFP 및 Cerulean과 같은 밀접한 관련 태그를 사용하면 재조합 게놈의 위치에 따라 둘 사이의 재결합 가능성을 열어줍니다.
이 기술의 모듈식 특성은 다른 염색 및/또는 태그 선택과의 호환성을 기반으로 형광 태그의 간단한 대체를 가능하게 합니다. 선택 가능한 마커를 절제함으로써, TDS 방법은 다양한 형광 단백질의 직렬 첨가 또는 TDS 기반 태그의 조합을 TDS 기반 유전자 삭제에 대한 Phenotypic 분석29을허용한다. 이러한 접근법의 유용성에 대한 예로, 바이러스 코어와 WV 멤브레인에 라벨을 붙이는 이중 태그형 형광 바이러스가 생성되었다. 이 바이러스를 가진 화상 진찰 연구 결과는 바이러스 복제 도중 바이러스의 운동, 형태발생 및 포장을 공부하는 것을 이용될 수 있었습니다. 아직 특징이 없는 바시니아 바이러스 성 단백질은 또한 태그및이 기술에 의해 공부 될 수있다.
Vaccinia 바이러스는 살아있는 세포 현미경 검사법에 유리한 바이러스의 많은 특성 때문에 화상 진찰 연구 결과에서 광범위하게 이용되었습니다. 형광 태그는 바이러스 게놈으로부터 발현되어, 형질 전환의 필요성을 제거하고, 감염된 동물 또는 비트랜스펙트 세포로부터 유래된 1차 세포를 쉽게 분석할 수 있게 한다. 처음에 형광 VACV는 바이러스운동의간단한 세포간 추적을 위해 사용되었지만, 최근의 접근법은 FRET연구(31),단일 바이러스 입자에서 FRAP, 프로모터 리포터33,인포탈 이미징34,구조 연구35-37을포함하는 그들의 유틸리티를 확장하였다. 이러한 모든 기술은 재조합 형광 바이러스를 만드는이 방법과 결합 된 쉽고 가까운 도달 내에있을 수 있습니다.

Vaccinia 바이러스 (VACV)는 발상 포크스 바이러스이며 천연두의 원인제인 바리올라 바이러스와 매우 관련이 있습니다. 이들 바이러스 는 모두 원숭이포와 에크로멜리아 바이러스(mousepox)1과같은 다른 주목할 만한 병원체를 포함하는 정형외과 속의 구성원이다. 정형외과바이러스는 200개 이상의 예측된 오픈 판독 프레임2,3이상을인코딩하는 대형 이중 좌초 DNA 게놈(180-220 kb)을 갖는다. 이러한 바이러스의 복제는 성숙한 바이러스 (MV)가 만들어지는 페리 핵 바이러스 공장의 형성과 MV의 하위 집합이 포장 된 바이러스 (WV)를 생성하기 위해 두 개의 추가 멤브레인을 획득하는 트랜스 골기 네트워크 (로버츠와 스미스4에의해 검토됨)를 포함한다. 정형외과 게놈은 VACV 게놈 복제의 특징이며 바이러스 DNA 폴리머라제5에의해 매개되는 높은 수준의 유전적 재조합으로 인해 유전적 조작에 매우 순종적이다. 재조합 바이러스생성은 12bp만큼 작은 동종요법을 가진 동종 재조합 및 선형 DNA 분자에 의존하여 암시니아 바이러스 감염 세포6에서재조합을 중재하기에 충분하다. 백시니아 바이러스의 형광 라벨링은 비리온 당 많은 형광 단백질의 통합을 허용하는 정형 외과 입자의 큰 크기로 인해 매우 밝은 바이러스 입자를 얻을 수 있습니다7. Vaccinia는 외국 DNA8의 큰 단편을 운반할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 또한, 경질 캡시드 대칭의 부족은 내인성 loci9로부터바이러스 성 단백질 유전자 융합을 표현할 때 유연성의 정도를 허용할 수 있다. VACV 단백질의 형광 태깅은 세포 외 수준에서 숙주 병원체 상호 작용의 연구에 귀중한 것으로 입증되었으며, 특히 바이러스 항목10,수송11-13및 형태 발생, 특히 포장 된 virions7의분야에서.
재조합 바이러스는 감쇠된 성장 표현형14,15,대사 선택16-18,또는 마커 유전자의 발현에 의해 선택될 수 있다(예를들어 X-gal19 또는 형광 단백질13,20). 여기서 우리는 형광및 신진 대사 선택의 강력한 조합을 사용하여 형광 바이러스의 선택을 설명합니다. 포크너와 모스(1990)21에의해 개발된 일시적인 지배적 선택(TDS) 벡터는 원하는 형광 태그 유전자와 함께 마커를 통합할 수 있게 한다. 대사 선택이 제거되면, 선택 유전자를 소비하는 이차 재결합 이벤트가 발생할 수 있지만 형광 태그 바이러스 단백질을 그대로 둡니다. 그림 2 아래는 실험 절차에 대한 개요를 제공합니다. 본 연구에서 활용된 선발 유전자는 mCherry 및 대장균 구아닌 인지질전달제(gpt) 유전자이며, 둘 다 합성 초기/후기 바이러스 프로모터로부터 발현되어 Cordeiro 외에서 이전에사용하였다. 22 또한, 관심의 태그 융합 단백질의 형광이 있다. 대사 선택이 제거되면 선택 가능한마커(mCherry 및 gpt)가절제되어 태그된 유전자의 형광만 남기고 올바른 재조합 바이러스의 식별을 허용합니다. 선택 마커의 절제는 여러 형광 태그를 결합 할 수있는 가능성을 제공, 우리가 동시에 여러 바이러스 단백질을 표시 할 수있는 능력과 바이러스를 만들 수 있도록. 이전 연구는 백시니아 바이러스 감염 세포 로 전염선형 및 원형 DNA 분자의 백시니아 재조합에 대한 최소한의 상동성 요구 사항을 결정했다6. 우리는 박시니아 바이러스 게놈에 의한 통합을 통해 gpt-mCherry TDS 벡터에 있는 측면 무기의 다양한 상동성 길이의 재조합 효율성을 결정하고 싶었습니다. TDS 벡터에서 100 bp의 상동성 영역이 상동성 재조합에 의해 VACV 게놈으로 재조합 된 DNA의 삽입을 표적으로 하고 중재하기에 충분하다는 것을 결정하였다(도4). 작은 homology 길이 는 또한 재조합을 가능하게 할 것이지만, 100 bp homology 길이는 신진 대사와 형광 선택으로 쉽게 확인할 수 있는 충분한 재조합 바이러스를 제공했습니다. 이 크기의 DNA 단편은 상대적으로 저렴한 비용으로 상업적으로 합성될 수 있으며 재조합 바이러스의 생성을 위한 다중 벡터의 생산을 크게 용이하게 한다. 우리는 편성 영역의 올리고 뉴클레오티드 서열의 합성 비용을 유지하면서 더 큰 재조합 주파수를 제공하기 위해 150 bp로 상동성 길이를 증가하기로 결정했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="596">
	<colgroup>
		<col /> 
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Mycophenolic acid</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M3536-50MG</td>
			<td style="width:167px;">Dissolve in 0.1N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Xanthine</td>
			<td style="width:95px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">X0626-5G</td>
			<td>Dissolve in 0.1N NaoH</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FuGENE HD transfection reagent</td>
			<td style="width:95px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002</td>
			<td style="width:95px;">Olympus, Chroma</td>
			<td style="width:119px;">BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methodology for the efficient generation of fluorescently tagged vaccinia virus proteins

형광 단백질을 가진 바이러스성 단백질의 태깅은 바이러스 호스트 상호 작용의 우리의 이해를 발전시키기 위하여 필수적인 접근이 입증되었습니다. 천연두 박멸에 사용되는 살아있는 백신인 Vaccinia 바이러스(VACV)는 큰 비리온 크기와 게놈 수준에서 설계할 수 있는 용이성으로 인해 형광형 세포 현미경 검사법을 특히 준수할 수 있습니다. 우리는 여기에 재조합 바이러스를 생성하기위한 최적화 된 프로토콜을보고합니다. 진공 복제 중 대상 동종 재조합에 대한 최소한의 요구 사항이 결정되어 구성 생성을 단순화할 수 있습니다. 이를 통해 형광 기자및 대사 선택과 함께 일시적인 지배적 선택(TDS)의 동맹을 통해 형광성 라벨 바이러스 단백질에 대한 신속하고 모듈적인 접근법을 제공할 수 있었습니다. 형광 재조합 바이러스의 생성을 간소화함으로써 바이러스 복제 중에 발생하는 바이러스 호스트 상호 작용의 여러 측면에 대한 고급 이미징 분석과 같은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 할 수 있습니다.

도 1에는 이 절차에 필요한 다양한 구문이 나열되어 있는데, 이 컨던스는합성(그림 1b 및 1c)또는 복제 단계(그림1d)에의해 생성됩니다. 도 2는 선택 과정의 각 단계에 대해 묘사된 A3-GFP 재조합 VACV의 대표적인 형광 플라크 이미지를 통해 실험 절차의 개요를 제공한다. 도 3에서,내측 바이러스 코어(23)와 외부봉투(24)의일부인 바이러스 구조 단백질 A3 및 F13을 대상으로 형광 마커로 태그된 단백질을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스가 각각 도시되어 있다. 생성된 재조합 바이러스각각에 대한 바이러스 플라크 및 감염된 세포의 관측이 묘사됩니다. 그것에 homology의 70 bp 영역으로 포함하는 VACV 게놈과 벡터의 상동성 재조합의 효율은, 시험되고 결과는 도 4에묘사된다. 100 bp homology를 포함하는 벡터와의 재결합으로 만든 바이러스 성 플라크를 식별하는 상대적 성공은 대상 유전자에 상동성의 150 bp 길이 왼쪽 및 오른쪽 팔을 합성하기로 선택한 뒤에 추론했다.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig1.jpg" width="400px"> 그림 1. TDS(일시적 지배적 선택) 재조합 벡터. (a)TDS 벡터와 gpt 및 mCherry 선택 마커. (b)상동성의 좌우 팔은 호모로지의 팔 사이와 측면에 있는 특정 제한 부위로 설계되었습니다. 이 방법에 사용되는 좌우 팔 사이의 제한 부위는 NotI와 BamHI였으며, NotI 사이트는 유전자와 형광 태그 사이의 링커로도 사용되고 있었다. (c)이 방법과 호환되는 형광 태그는 해당 제한 부위에 의해 측면에 있습니다. 일부 태그는 GFP (녹색 형광 단백질), RFP (적색 형광 단백질), Cerulean (ECFP에 개선, 시안 형광 단백질, 사이트 지향 돌연변이 발생25에의해) 및 미니 SOG, 조명에 EM에 의해 resolv able 제품을 만드는 GFP에서 설계된 형광 단백질26. (d)최종 TDS 재조합 벡터의 생성에 관여하는 복제 단계. 좌우 측면 팔을 포함하는 합성된 올리고뉴클레오티드는 먼저 TDS 벡터로 복제된다. 이렇게 하면 좌우 팔 사이에 통합된 제한 사이트로 복제하여 선택한 태그가 안팎으로 셔틀링될 수 있는 재조합 벡터를 제공합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig2.jpg" width="500px"> 그림 2. 재조합 vaccinia 바이러스를 만드는 실험 절차의 개요. 유전 및 세포 수준에서 발생하는 이벤트는 A3-GFP 라벨형 광등 백신 바이러스의 생성 다음 단계를 요약 대표 플라크 이미지와 함께 묘사된다. (a)박시니아 바이러스에 감염된 세포는 TDS 재조합 벡터에 감염된다. (B)이 그림에서는 왼손 재조합의 결과만 묘사되고 그 예는 GFP를 선택의 형광태그로 사용한다. 오른손 재조합은 태그가 중간 단계, 즉 단계 C에서 전체 표적 유전자에 융합될 것을 제외하고는 전체 TDS 플라스미드가 유사한 방식으로 게놈으로 통합되는 결과를 낳을 것이다. 플라크 분석은 재조합 혼합과 함께 세포 단층상에서 수행되고 GPT 선택을 실시한다. (C)각각 mCherry 및 GFP 발현에 해당하는 적색 및 녹색 형광을 모두 나타내는 플라크를 골라 증폭한다. 선택이 제거되면, gpt 및 mCherry 유전자(D)의손실에 대응하는 적색 형광의 손실이 있을 것이며 독점적으로 녹색 형광을 나타내는 플라크를 골고 증폭(E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig3.jpg" width="500px"> 그림 3. TDS 재조합 시스템의 대표적인 결과. 이미지는 8시간 후 해당 재조합 바이러스에 감염된 단일 세포의 이미지와 함께 48시간(a, c, e및 스케일 바 100 μm) 후 재조합 VACV 감염 세포의 전체 플라크를 묘사한다(b,b, f;스케일 바 10 μm). 비리온-국소화 단백질에 대응하는 유전자는 바이러스 입자를 시각화하기 위해 선택되었다. A3는 백시니아 비리온(a, b)및 F13(c, d)의핵심 단백질은 바이러스 봉투 단백질이다. 형광 라벨A3및 F13(e, f)를모두 가진이중 태그 바이러스도 도시된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig4.jpg" width="500px"> 그림 4. 재조합 벡터와 VACV 게놈 사이의 재조합 효율성의 정량적 분석. BS-C-1 단층은 VACV에 감염되었고 VACV 게놈에 500bp, 100 bp 또는 70 bp의 상동성 영역을 포함하는 3개의 재조합 벡터로 1시간 후 감염을 감염하였다. 각 벡터에는 또한 gpt 및 mCherry 선택 유전자를 포함하는 TDS 카세트를 포함하였다. 세포는 감염 후 24시간 회수되었고, 형성된 재조합 바이러스를 방출하기 위해 용인되었다. 플라크 어설션은 GPT 선발 매체와 함께 세포 리세이트에서 수행되었고, mCherry 형광을 보여주는 플라크는 성공적인 재조합으로 계산되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51151/51151fig5.jpg" width="500px"> 그림 5. 여러 복제 부위를 보여주는 gpt-mCherry TDS 벡터의 지도. 벡터는 이전에 설명된22및 벡터 맵은 장 랩 그룹(SCU)에서 EZ 플라스미드 맵 v1.9의 도움으로 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51151/51151fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

methodology-for-efficient-generation-fluorescently-tagged-vaccinia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K 조회수.  University of Sydney. 과도 우세 선택 방법을 이용하여 동시에 형광 태그단백질을 발현하는 재조합 암시니아 바이러스의 생성을 위한 신속하고 모듈식 프로토콜이 여기에 설명되어 있다.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

연구

면역학 및 감염병학

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement of this phenomenon, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment of cell death. Because of this, it is difficult to determine whether reported increases in immune cell apoptosis can be contributed to the actual effect of exercise on the system, or are a reflection of the time and processing necessary to eventually obtain this measurement. In this article we demonstrate a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis. Unlike other techniques, whole blood is added to an antibody panel immediately upon obtaining a sample. Following the incubation period, red blood cells are lysed and samples are ready to be analyzed. The use of a finger-stick sampling procedure reduces the volume of blood required, and minimizes the discomfort to subjects.

Exercise is capable of inducing apoptosis in immune cells. There are various measurement limitations, particularly relating to the amount of time required to isolate and treat a blood sample prior to the assessment. Demonstrated is a rapid and minimally invasive procedure for the analysis of exercise-induced lymphocyte apoptosis.

운동 유발성 Apoptosis 림프구의 결정을위한 손가락 - 스틱 혈액 샘플링 방법론

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal titers. Studies of serum bactericidal titers in response to childhood vaccines have enabled us to develop and validate cut-off levels for protective immune responses and such cut-offs are in routine use. No such assays have been taken forward into the routine assessment of vaccines that induce primarily cell-mediated immunity in the form of effector T cell responses, such as TB vaccines. In the animal model, the performance of a given vaccine candidate is routinely evaluated in standardized bactericidal assays, and all current novel TB-vaccine candidates have been subjected to this step in their evaluation prior to phase 1 human trials. The assessment of immunogenicity and therefore likelihood of protective efficacy of novel anti-TB vaccines should ideally undergo a similar step-wise evaluation in the human models now, including measurements in bactericidal assays.
Bactericidal assays in the context of tuberculosis vaccine research are already well established in the animal models, where they are applied to screen potentially promising vaccine candidates. Reduction of bacterial load in various organs functions as the main read-out of immunogenicity. However, no such assays have been incorporated into clinical trials for novel anti-TB vaccines to date.
Although there is still uncertainty about the exact mechanisms that lead to killing of mycobacteria inside human macrophages, the interaction of macrophages and T cells with mycobacteria is clearly required. The assay described in this paper represents a novel generation of bactericidal assays that enables studies of such key cellular components with all other cellular and humoral factors present in whole blood without making assumptions about their relative individual contribution. The assay described by our group uses small volumes of whole blood and has already been employed in studies of adults and children in TB-endemic settings. We have shown immunogenicity of the BCG vaccine, increased growth of mycobacteria in HIV-positive patients, as well as the effect of anti-retroviral therapy and Vitamin D on mycobacterial survival in vitro. Here we summarise the methodology, and present our reproducibility data using this relatively simple, low-cost and field-friendly model.
Note: Definitions/Abbreviations
BCG lux = M. bovis BCG, Montreal strain, transformed with shuttle plasmid pSMT1 carrying the luxAB genes from Vibrio harveyi, under the control of the mycobacterial GroEL (hsp60) promoter. 
CFU = Colony Forming Unit (a measure of mycobacterial viability).

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

We describe an alternative approach to the enumeration of mycobacteria in vitro, which uses reporter-gene tagged mycobacteria instead of colony-forming units (CFU). &#x201C;Survival&#x201D; of organisms as well as host response-markers are measured simultaneously, providing a low-cost, versatile and functional system for studies of host/pathogen interactions in the context of tuberculosis.

Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

배큘로 바이러스 발현 시스템을 사용하여 소설 H7N9 인플루엔자 바이러스의 기능 재조합 적혈구 응집소와 뉴 라미니다 아제 단백질의 발현

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

간단하고 효율적인 접근 방법은 돌연변이 백시 니아 바이러스 벡터를 구축하기

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...