우리는 arenavirus 역 유전학 기술과 플라스미드의 개발 및 개선을위한 JCT 및 LM-S 실험실에서 과거와 현재의 회원을 감사드립니다. 우리는 또한 기술 지원 Snezhana Dimitrova 감사합니다. JUNV NP (SA02-BG12)로 지정 단클론 항체는 BEI 자원 (NIAID의 바이오 디펜스 및 신흥 감염증 연구 자료 저장소)로부터 얻은 것입니다. BYHC는 기관 루스 L. 키르 국립 연구 봉사상에서 허가 번호 GM068411에 의해 지원되었다. EO-R은 Fullbright-Conicyt (BIO 2008)와 로체스터 백신 원정대 (2012)받는 사람이다. EO-R 현재 지원은 로체스터 대학의 교수 개발 및 다양성 사무실에서 다양성과 학문적 우수성에 대한 박사 원정대에 의해 제공됩니다. LM-S 실험실에서 연구는 NIH 보조금 RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, 인플루엔자 연구 및 감시를위한 우수의 NIAID 센터 (HHSN266200700008C)에 의해 재정 지원, 그리고바이오 디펜스 면역 모델링 (HHSN272201000055C)를위한 로체스터 센터의 대학. JCT 실험실에서 연구 보조금 RO1 AI047140, NIH에서 RO1 AI077719, 및 RO1 AI079665에 의해 지원되었다.

1. Arenavirus 구조 형질 우리의 구조 시스템은 핵 단백질 (NP)와 RNA 의존적-RNA 중합 효소 (L), RNA 복제 및 arenavirus 게놈의 유전자 발현에 필요한 바이러스 횡단 행동 요소를 인코딩 중합 효소 II의 단백질 발현 플라스미드 모두의 사용을 기반으로 한 7, 19, 및 세포 S의 RNA 중합 효소 I (POL-I) 및 L antigenome RNA 종 7을 통해 세포 내 합성을 지시 할 수있는 플라스미드. 우리의 연구에서 우리는 내가 발기인 및 쥐 종결 서열 (그림 2) 인간의 효소를 사용 pCAGGs 단백질 닭 β-액틴 프로모터 및 polyadenylanation (PA) 신호 시퀀스를 사용하여 플라스미드 표현하고, 인간의 폴-I 플라스미드를 사용 . S와 L RNA 세그먼트는 HPOL-I에 의한 전사에 따라 게놈 RNA 세그먼트의 생성을 허용 할 antigenomic 방향 HPOL-I 플라스미드에 복제됩니다. 야생 타이의 구조에 대한PE 재조합 LCMV (rLCMV)와 몰래 # 1 (rCandid # 1) pCAGGs NP 각 바이러스의 L은 각각의 인간의 폴-I S와 L RNA 세그먼트 (그림 3)와 함께 공동 형질 전환 하였다. 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 # 1 (# 1 r3Candid) 몰래의 생성은 유​​사한 프로토콜을 따랐지만 S 세그먼트는 두 개의 서로 다른 폴-I S 플라스미드, 각 인코딩 특유의 리포터 유전자로 분할되었다 : 하나, NP 개방 판독 프레임 (ORF)은 녹색 형광 단백질 (GFP) 리포터 유전자 (HPOL-I S GFP / GP)와, 다른에서, 바이러스 당 단백질 전구체 (GPC)를 ORF가 Gaussia 루시 페라 제 (Gluc) 리포터 유전자로 대체됩니다로 대체되었습니다 (HPOL-I S NP / Gluc). 프로토콜의 개략도는 그림 4에 나와 있습니다. 다음과 같은 형질 감염 프로토콜은 6 잘 플레이트 설립되었습니다. <ol><li> OptiMEM-lipofectamine과 2000 (LPF2000) 혼합 : OptiMEM 매체 250 μl를 준비하고, 따라의 바이러스 구조, 10 - 형질 당 LPF2000 12 μg (1 ㎍ / ㎕의) (표 1). DNA의 μg 당 2.5 μg LPF2000의 비율이 권장됩니다. RT에서 10 분 - 5 알을 품다. 한편, 별도의 microcentrifuge 관 (단계 1.2)에서 플라스미드의 transfection 혼합물을 준비합니다. </li><li> 플라스미드 DNA의 형질 전환 혼합물 : 각 바이러스 구조에 대한 권장 금액 (표 1 참조)를 사용 microcentrifuge 관에서 플라스미드 형질 칵테일을 준비합니다. OptiMEM 50 μL의 최종 볼륨을 가져와. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물 : 플라스미드 DNA의 형질 혼합물 (단계 1.2)에 OptiMEM-LPF2000 혼합물 (단계 1.1) 250 μl를 추가합니다. RT에서 30 분 - 20이 혼합물을 품어. 한편 준비하고 형질 반응 당 1 × 10 6 베로 세포를 계산합니다. 베로 세포 현탁액에 형질 전환됩니다. </li><li> 베로 세포의 준비 : 베로 CELLS 100 밀리미터 접시에서 배양된다. 시작하기 전에 37 ° C.에 1X PBS, DMEM 10 % FBS 1 % PS 미디어, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 혼합물을 가지고 <ol><li> 1X PBS의 10 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML로 세포를 Trypsinize 세포 분리 (약 5 분) 때까지 기다립니다. 부드러운 어쩌면 완전히 요리에서 세포를 분리하는 데 필요한 탭핑. </li><li> 조심스럽게 15 ML의 원심 분리기 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을. </li><li> 원심 분리기에서 1,000 rpm으로 5 분 동안 세포를 원심 분리기. </li><li> DMEM 10 % FBS 1 % PS 10ml에 세포를 resuspend을하고 혈구를 사용하여 셀을 계산 1 × 10 6 세포 / ㎖로 농도를 조정합니다. 1 × 10 형질 당 6 베로 세포가 최상의 결과를 생산 - 그것은 0.5 관찰되었다. </li></ol></li><li> LPF2000/DNA 세포를 혼합 : 20 후 - 30 분 실온 배양 (단계 1.3)로 베로 세포를 1 ㎖ (1 × 10 6) (단계 1.4)을 추가상온에서 5 분 OptiMEM-LPF2000-DNA 플라스미드 혼합물을 품어. </li><li> 6 잘 접시에 씨앗 LPF2000/DNA-cell 믹스 : 6 잘 플레이트의 우물에 DNA-LPF2000 - 베로 혼합물 (단계 1.5)를 추가합니다. 부드럽게 6 잘 플레이트를 흔들 37 배양기에서 형질 부화 하룻밤하자 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 형질 매체 변경 : 약 16-24 시간의 포스트 형질을, 형질 미디어를 제거 감염 매체 2 ML을 추가하고 추가로 48 시간 동안 형질 전환 세포를 품어. </li><li> 세포 통로 : 감염 미디어에서 배양 48 시간 후 조직 배양 상층 액 (TCS)를 제거하고 100mm 접시에 형질 전환 세포를 전달합니다. 형질 세포가 바이러스 입자를 생성하기 위해 추가 배양이 필요하기 때문에 TCS는 거의 전염성 바이러스를 포함하지 않습니다. 세포의 통과를 위해 : <ol><li> 1X PBS 2 ML로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 세포에게 승 Trypsinize<html> i 번째 0.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 ML과 세포가 분리 될 때까지 기다립니다. </li><li> 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 DMEM 10 % FBS 1 % PS 1 ML에있는 세포를 resuspend을. </li><li> 5,000 rpm에서 5 분, 4 ° C의 microcentrifuge에 대한 세포를 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 감염 미디어 1 ML에있는 세포를 resuspend을하고 100mm 접시에 세포를 전송합니다. 8 ml의 바이러스를 농축 세포의 건조 등을 방지하기 위해 충분한 볼륨으로, 전염성 미디어, 접시에 전체 볼륨을 가져와. </li></ol></li><li> 부드럽게 37 100 밀리미터 접시를 흔들어 인큐베이터 베로 세포 배양을 계속 ° C와 5 % 72 시간 동안 CO 2. </li><li> TCS의 컬렉션을 : 72 시간 배양 후, 15 ML의 원심 분리기 튜브 TCS를 수집합니다. 원심 분리기에서 2,500 rpm으로 5 분 동안 원심 분리하여 세포 파편을 제거합니다. 전염성 arenavirus는 TCS에서 발견되기 때문에 세포 파편 펠릿에서 제거하고 -80 TCS를 저장 ° C. </li></ol>재조합 Arenavirus 구조 르 &quot;&gt; 2. 확인 rLCMV 및 rCandid # 1의 성공적인 구조의 발견은 초점을 형성 단위 (FFU) 면역 분석 (IFA)를 통해 얻을 수 있습니다. 야생 형 바이러스 구조를 위해 우리는 바이러스 NP에 대한 특정 항체를 사용합니다. r3LCMV 및 r3Candid 중 1 따라서 형광 현미경 (GFP) 및 / 또는 발광 (Gluc)에 의한 항체의 필요없이 바이러스 탐지 및 적정 수 있도록 두 기자 유전자 (GFP 및 Gluc) 인코딩합니다. <ol><li> 야생형 재조합 arenavirus 구조 확인 : 적정 전날, PBS로 두 번 베로 세포를 씻어 trypsinize 80에 도달하는 96 - 웰 플레이트를 준비 - 90 % 합류 다음날 (4 × 10 4 세포 /도). 부드럽게 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 손으로 판을 흔들어. 문화 세포 하룻밤, 37 ° C 배양기 5 % CO 2. 감염을 진행하기 전에, 단층을 확인하기 위해 현미경으로 세포를 확인 <ol><li> 순차적으로 희석 (10 배 희석) 바이러스가 포함 TCS는 OptiMEM에서 100 밀리미터 접시 (단계 1.10)에 형질 전환 세포에서 발견. </li><li> 시드 베로 세포에서 용지를 제거 1X PBS의 50 μL로 두 번 세척하고, 순차적으로 희석 바이러스 (단계 2.1) 50 μL와 세포를 감염. 37 1.5 시간 동안 세포를 감염 ° C와 5 % CO 2. </li><li> 감염 후, 바이러스 접종을 제거 100 감염 미디어 μL / 잘을 추가하고 16를위한 세포를 배양 - 18 시간. 바이러스 다시 감염 바이러스 역가의 과다 추정 될 수있는, 18 시간 배양 한 후 발생할 수 있습니다. </li><li> 16시 - 18 시간 게시물 감염, 각 우물에서 TCS를 제거하고 RT에서 15 분, 1X PBS에 희석 4 % 포름 알데히드로 세포를 고정합니다. </li><li> 다음으로, 고정 용액을 제거하고 세포를 permeabilize로 0.1 % 트리톤 X-100 실내 온도에서 10 분 동안, 1X PBS에 희석. </li><li> permeabilization 솔루션을 대기음 후, 세포에게 3 회 위스콘신 세척일 1X PBS. </li><li> RT에서 1 시간 1X PBS (차단 솔루션)에서 2.5 % 알부민 소 혈청 (BSA)로 세포를 차단합니다. 또한, 세포는 4 ° C에서 하룻밤 차단 항체 배양 다음날을 계속 할 수 있습니다. </li><li> 한편 일차 항체를 준비합니다. 솔루션을 차단에 LCMV와 몰래 # 1 특정 기본 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 / 차단 솔루션 항체를 원심 분리기. BEI 자원 (1:500 희석)에서 단클론 항-LCMV NP 항체 클론 1.1.3 (1시 반 희석) 16 단클론 항-JUNV NP 항체 SA02-BG12는 rLCMV의 탐지 및 rCandid # 1 사용할 수 있습니다 각각. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 차단 솔루션을 기음과 세포 일차 항체의 50 μl를 추가하고 37 1 시간 동안 품어 ° C. </li><li> 이 시간에 솔루션을 차단에 차 항체를 희석 한 후 3,500 rpm에서 15 분 동안 항체 / 차단 솔루션을 원심 분리기. 폴리기본 단클론 항체의 검출을위한 클론 토끼 항 마우스 IgG의 FITC 차 항체는 그림 5에서 관찰 된 이미지를 얻기 위해 사용되었다. </li><li> 1 시간 배양 한 후, 일차 항체를 대기음 1X PBS로 3 회 세척하고 37 ℃에서 30 분 동안 차 항체를 추가 ° C. </li><li> 30 분 부화 후, 차 항체를 대기음하고 1X PBS로 3 회 세척한다. 세포는 두 ML (FFU / ㎖) 당 단위를 형성 초점을 계산하여 바이러스 구조 및 적정의 성공을 결정하는 형광 현미경을 사용하여 현재 관찰 할 준비가 된 것입니다. </li></ol></li><li> r3LCMV 및 # 1 r3Candid 바이러스의 구조 :이 바이러스는 두 기자 유전자를 표현하기 때문에, 그들의 GFP 식 또는 TCS의 Gluc 표현을 감지하는 형광 현미경으로 모니터링 할 수 있습니다 구출. 구조는 TCS의 Gluc의 발현에 의해 확인 할 수 있습니다. trisegmented 바이러스를 적정하기 위해, 우리는 2.1.4 단계 2.1를 수행하지만 세포가 B 할 필요가 없습니다전자 때문에 GFP 발현을 성공적으로 바이러스 구조를 결정하는 고정. 바이러스의 적정은 FFU / ㎖를 계산하여 결정됩니다. Gluc 표현, TCS에서 Gluc 식으로 성공적인 바이러스 성 구조를 확인하려면 Gluc 분석 키트 (Biolux Gaussia 루시 페라 제 분석 키트, 뉴 잉글랜드 Biolabs 사)를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 이를 위해 : <ol><li> 96 - 웰 하얀 접시 (평면 바닥의 microtiter 접시, 피셔 과학)에 피펫 TCS의 100 μl를. </li><li> luminometer (LumiCount, 팩커드 생명 과학)을 설정합니다. </li><li> 각 샘플에 100 μL Gluc 분석 실험 용액 (제조업체가 권장)와 luminometer로 Gluc 리포터 유전자 발현을 측정 - 50를 추가합니다. 대조군으로, 야생형 바이러스에 감염된 세포에서 TCS의 Gluc 발현을 측정 하였다. </li></ol></li></ol> 3. 조직 배양 상층 액의 통과 바이러스 구조가 형질 전환 효율에 따라 달라집니다. 베로 세포가 표시되어다른 세포 라인 14보다 낮은 형질 전환 효율을 가지고 있습니다. TCS의 바이러스 역가가 낮은 경우, 바이러스를 증폭하는 72 시간 동안 0.01 (LCMV) 또는 0.1 (# 1 몰래)의 감염의 다중성 (MOI)에서 신선한 베로 세포를 감염.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 생성은 arenavirus 생물학의 여러 가지 측면의 조사를 위해 널리 사용되는 방법이되고있다. 여기에 우리가 arenavirus를 수행하여 현재 시스템에 중요한 개선을 문서화하는 것은 다른 전염성 질병에 대한 arenaviruses 백신 벡터에 대한 FDA의 승인 백신 후보의 잠재적 인 발생을 허용, 베로 세포에서 구출. 관련 실험 절...

Arenaviruses는 Arenaviridae 제품군에 속하는 bisegmented, 음의 가닥 RNA 게놈 3 싸여 바이러스입니다. arenavirus 게놈은 두 개의 분리 된 바이러스 세그먼트 3에서 ambisense 패션 개의 단백질을 인코딩합니다. 대형 (L) 부분은 RNA 의존 RNA 중합 효소 (L) 및 바이러스 신진의 주요 원동력 역할을하는 작은 링 (정말 흥미로운 새로운 유전자) 손가락 단백질 (Z) 인코딩합니다. 소 (S) 부분은 바이러스 핵 단백질 (NP)와 표면 당단백 (GP) (그림 1)를 인코딩합니다. Arenaviridae 가족의 몇몇 일원은 인간 3 치명적인 출혈열 (HF)에 대한 책임이 있습니다. 원칙적으로 문제의 입원 환자 8, 9에서 높은 사망률을 일으키는 것으로 알려져 있습니다 라사 바이러스 (LASV)와 후닌 바이러스 (JUNV가) 있습니다. 이 바이러스는 각각 서부 아프리카와 농촌 아르헨티나에 발병하지만은,증가 여행 10에 의한 비 발병 지역에 LASV 및 JUNV의 수입 증가 우려가 있습니다. 일반적으로 인간의 심각한 질병과 관련이없는 있지만 또한, 프로토 타입 arenavirus 림프 구성 맥락 수막염 바이러스 (LCMV)는 면역 환자 6, 15 치명적인 감염 사례가되었습니다로 무시 병원균으로 간주하고 선천적 결함과 자연 유산에 대한 책임이 있습니다 임신 2, 십삼인치 현재이 없습니다 미국 arenaviruses 및 치료에 대한 백신은 부분적으로 만 효과가 종종 상당한 부작용과 관련된 클레오 아날로그 리바비린으로 제한됩니다 FDA 승인.에게 플라스미드 기반의 역 유전학 4 재조합 arenaviruses 7, 19 세대의 도입은 크게 arenavirus 연구 분야를 전진했다. 현재, 설치류 세포 (예 : BHK-21 등) GENER에 사용되는S와 L 세그먼트의 초기 전사를 지시 종의 특정 쥐 RNA 중합 효소 I (POL-I) 발기인에 의한 재조합 arenaviruses의 ATION. BHK-21 세포에서 그러나 바이러스 구조는 잠재적 인 백신 시드 후보로 재조합 arenaviruses의 생성에 대한 승인 방법 없습니다. 여기에서 우리는 프로토 타입 올드 월드 (OW) LCMV와 새로운 세계 (NW) 베로 세포에서 JUNV 몰래 # 1 균주의 효율적인 구조에 대한 인간의 POL-I 프로모터의 사용을 문서화합니다. 유사한 방법론을 사용하여, 우리는 재조합 trisegmented LCMV (r3LCMV)와 몰래 # 1 (r3Candid # 1) 두 개의 서로 다른 S RNA 세그먼트 5로 인코딩 된 두 개의 추가 외부 유전자를 포함 arenaviruses를 생성합니다. 이 새로운 시스템은 높은 재현성과 간단한 프로토콜을 따르고 있지만, 바로 잠재적 인 백신 또는 백신 벡터 씨와 같은 재조합 arenaviruses의 생성에 구현 될 수뿐만 아니라.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Material and methods</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
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 Cell lines 
Vero E6 (African green monkey kidney epithelial cells) are maintained in a 37 &deg;C incubator with 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cells are available from the American Type Culture Collection (ATCC, catalogue number CRL-1586). 
 
Plasmids 
All plasmids, with the exception of hpol-I L, can be grown at 37 &deg;C, for 16-18 hr. We recommend that cultures of the hpol-I L be grown at 30 &deg;C for 24 hr. Plasmids are prepared using a plasmid maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) following the manufacturer's recommendations and stored at -20 &deg;C. The concentration of the purified DNA plasmid is determined by spectrophotometry at 260 nm, with purity being estimated using the 260:280 nm ratio. Preparations with 1.8-2.0 260:280 nm ratios are considered appropriate for virus rescue purposes. Additionally, plasmid concentration and purity should be confirmed with agarose gel electrophoresis. 
 
Viruses 
The described protocol for rescuing rLCMV (Armstrong 53b) and rCandid#1 can be executed under biosafety level (BSL) 2 conditions. Contaminated material, including TCS and cells should be sterilized before disposal. Rescue of other arenavirus may require higher BSL facilities so proper safety/security measures must be followed. 
 
Tissue culture media and solutions 
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), 50 ml of Fetal Bovine Serum (FBS), and 5 ml of 100X Penicillin/Streptomycin (PS). Store at 4 &deg;C. This media will be used for maintenance of Vero cells. 
 
Infectious Media: 2-to-1 mixture of OptiMEM and DMEM 10 %FBS 1 %PS. Store at 4 &deg;C. This media will be used during viral infections. 
 
10X Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 liter. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 
1X PBS: Dilute 10X PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 
2.5 % BSA: 2.5 g of BSA in 97.5 ml of 1X PBS. Store at 4 &deg;C. This is used as a blocking solution for IFA.
</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

generation of recombinant arenavirus for vaccine development in fda-approved vero cells

arenavirus 역 유전학의 개발 및 구현 arenavirus 필드 4에있는 중요한 돌파구를 나타냅니다. 자신의 게놈 소정의 돌연변이와 재조합 전염성 arenaviruses를 생성하는 기능과 함께 셀 기반 arenavirus의 minigenome 시스템의 사용은 arenavirus 라이프 사이클의 다른 단계 바이러스 성 결정 요인의 기여에 대한 조사뿐만 아니라, 바이러스 호스트를 촉진했다 상호 작용과 arenavirus 병인 1, 3, 11의 메커니즘. 또한, trisegmented arenaviruses의 개발은 따라서 arenavirus 기반의 백신 벡터 애플리케이션 5의 가능성을 열어, 그 밖의 외국 유전자를 표현하는 arenavirus 게놈의 사용을 허용하고있다. 마찬가지로, 표현 리포터 유전자 할 수있는 단일 사이클 전염성 arenaviruses의 개발 highl 관련된 연구의 안전을 개선하기 위해 새로운 실험 도구를 제공합니다Y 병원성 인간 arenaviruses 16. 플라스미드 기반의 역 유전학 기술을 사용하여 재조합 arenaviruses의 세대는 지금까지 식품 의약품 안전청의 개발 (FDA) 허가 백신 또는 백신 벡터에 대한 몇 가지 장벽을 포즈 7,19 설치류 세포주의 사용에 의존하고있다. 이 장애물을 극복하기 위해, 우리는 FDA의 승인을 베로 세포에서 재조합 arenaviruses의 효율적인 세대는 여기에 대해 설명합니다.

재조합 야생형 arenavirus의 성공적인 구조는 IFA (그림 5)를 사용하여 바이러스 항원의 존재에 의해 확인됩니다. 재조합 trisegmented 바이러스의 경우, 성공적인 바이러스 성 구조는 형광 현미경 (그림 6A)에서 GFP 발현을 관찰하여 평가 될 수있다. 성공적인 구조는 더욱 Gluc 표현 (그림 6B)를 평가하여 확인됩니다. 야생 유형과 trisegmented arenavirus의 성공적인 구조를 보?...

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Generation of Recombinant Arenavirus for Vaccine Development in FDA-Approved Vero Cells

복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한 FDA 승인 세포주 (베로)의 유전학 기술을 역으로 수행합니다.

FDA 승인 베로 세포 백신 개발을위한 재조합 Arenavirus의 생성

The development and implementation of arenavirus reverse genetics represents a significant breakthrough in the arenavirus field  4. The use of cell-based ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K 조회수.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. 복제 cDNA를 같은 유전자를 역 참조 방식에서 재조합 arenaviruses의 구조는 연구자 arenavirus의 생물학의 다양한 측면, 특정 바이러스 유전자 산물의 역할뿐만 아니라, 서로 다른 특정 도메인 및 잔류의 기여를 조사 할 수 있습니다 . 마찬가지로, 인간의 병원성 arenaviruses을 방지하기 위해 효과적이고 안전한 백신의 생성에 새로운 가능성을 제공하는 백신 개발을위한...

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

플라스미드 DNA의 재조합 독감 바이러스의 생성

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

흑색종과 편평상피암 줄기세포를 이용한 새로운 수지상 세포 백신의 생성

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

웨스트 나일 바이러스 돌연변이 균주의 감염에에서 MyD88 매개 세포 면역 반응의 생체 외 분석

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

정렬 된 불멸화 된 B 세포로부터 재조합 인간 IgG 단일 클론 항체의 생성

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. While virus-cell attachment can be measured through the use of virions labeled with biotin, radioactive isotopes, or fluorescent dyes, these approaches typically require high multiplicities of infection (MOI) to enable detection of bound virus. We describe a quantitative (q)RT-PCR-based assay that measures Junin virus strain Candid 1 attachment via quantitation of virion-packaged viral genomic RNA. This assay has several advantages including its extreme sensitivity and ability to measure attachment over a large dynamic range of MOIs without the need to purify or label input virus. Importantly, this approach can be easily tailored for use with other viruses through the use of virus-specific qRT-PCR reagents. Further, this assay can be modified to permit measurement of particle endocytosis and genome uncoating. In conclusion, we describe a simple, yet robust assay for highly sensitive measurement of arenavirus-cell attachment.

The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral particles to host cells. We report a quantitative (q)RT-PCR-based assay for ultrasensitive detection and quantitation of arenavirus attachment events.

Arenavirus 셀 첨부 파일의 측정을위한 고감도 분석

Arenaviruses are a family of enveloped RNA viruses that cause severe human disease. The first step in the arenavirus life cycle is attachment of viral ...

Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, both to decipher viral replication mechanisms and to study antivirals or provide development platform for vaccines. The construction and manipulation of a reverse genetic system for a negative-strand RNA virus such as a respiratory syncytial virus (RSV), however, remains delicate and requires special know-how. The RSV genome is a single-strand, negative-sense RNA of about 15 kb that serves as a template for both viral RNA replication and transcription. Our reverse genetics system uses a cDNA copy of the human RSV long strain genome (HRSV). This cDNA, as well as cDNAs encoding viral proteins of the polymerase complex (L, P, N, and M2-1), are placed in individual expression vectors under T7 polymerase control sequences. The transfection of these elements in BSR-T7/5 cells, which stably express T7 polymerase, allows the cytoplasmic replication and transcription of the recombinant RSV, giving rise to genetically modified virions. A new RSV, which is present at the cell surface and in the culture supernatant of BSRT7/5, is gathered to infect human HEp-2 cells for viral amplification. Two or three rounds of amplification are needed to obtain viral stocks containing 1 x 106 to 1 x 107 plaque-forming units (PFU)/mL. Methods for the optimal harvesting, freezing, and titration of viral stocks are described here in detail. We illustrate the protocol presented here by creating two recombinant viruses respectively expressing free green fluorescent protein (GFP) (RSV-GFP) or viral M2-1 fused to GFP (RSV-M2-1-GFP). We show how to use RSV-GFP to quantify RSV replication and the RSV-M2-1-GFP to visualize viral structures, as well as viral protein dynamics in live cells, by using video microscopy techniques.

We describe a method for generating and amplifying genetically modified respiratory syncytial viruses (RSVs) and an optimized plaque assay for RSVs. We illustrate this protocol by creating two recombinant viruses that respectively allow quantification of RSV replication and live analysis of RSV inclusion bodies and inclusion bodies-associated granules dynamics.

생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

The use of recombinant viruses has become crucial in basic or applied virology. Reverse genetics has been proven to be an extremely powerful technology, ...

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

Subunit vaccines offer advantages over more traditional inactivated or attenuated whole-cell-derived vaccines in safety, stability, and standard manufacturing. To achieve an effective protein-based subunit vaccine, the protein antigen often needs to adopt a native-like conformation. This is particularly important for pathogen-surface antigens that are membrane-bound proteins. Cell-free methods have been successfully used to produce correctly folded functional membrane protein through the co-translation of nanolipoprotein particles (NLPs), commonly known as nanodiscs. 
This strategy can be used to produce subunit vaccines consisting of membrane proteins in a lipid-bound environment. However, cell-free protein production is often limited to small scale (&lt;1 mL). The amount of protein produced in small-scale production runs is usually sufficient for biochemical and biophysical studies. However, the cell-free process needs to be scaled up, optimized, and carefully tested to obtain enough protein for vaccine studies in animal models. Other processes involved in vaccine production, such as purification, adjuvant addition, and lyophilization, need to be optimized in parallel. This paper reports the development of a scaled-up protocol to express, purify, and formulate a membrane-bound protein subunit vaccine. 
Scaled-up cell-free reactions require optimization of plasmid concentrations and ratios when using multiple plasmid expression vectors, lipid selection, and adjuvant addition for high-level production of formulated nanolipoprotein particles. The method is demonstrated here with the expression of a chlamydial major outer membrane protein (MOMP) but may be widely applied to other membrane protein antigens. Antigen effectiveness can be evaluated in vivo through immunization studies to measure antibody production, as demonstrated here.

Cell-Free Scaled Production and Adjuvant Addition to a Recombinant Major Outer Membrane Protein from Chlamydia muridarum for Vaccine Development

This protocol describes using commercial, cell-free protein expression kits to produce membrane proteins supported in nanodisc that can be used as antigens in subunit vaccines.