이 접근법은 재조합 백신의 급속한 발달을 위해 HVT 게놈에 다른 바이러스 성 항원들을 소개하는 효율적인 방법을 제공합니다. 이 기술의 장점은 GFP 발현 카세트가 먼저 삽입에 부착되어 쉽게 시각화한 다음 Cre-LoxP 시스템에서 제거된다는 것입니다. 동일한 접근법은 다세대 재조합 백신의 개발을 위해 HVT 게놈또는 다른 조류 헤르페스 바이러스의 다른 위치에 더 많은 바이러스 유전자를 삽입하는 데 사용할 수 있습니다.
절차를 시연하는 것은 세포 선별 전문가인 케이티 모퍼트(Katy Moffat)가 될 것입니다. 나탕, 야오요 장, 광강 쿠, 내 실험실에서 과학자. 이식 전날은 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 병아리 배아 섬유아를 준비합니다.
6 개의 웰 플레이트의 각 우물에 중간의 2.5 밀리리터에 130 만 개의 세포를 종자. CEF 세포를 각각 0.5 마이크로그램씩 트랜스펙트하여 두 Cas9 가이드 RNA 플라스미드, 및 제조업체의 지침에 따라 적절한 트랜스포이션 시약을 사용하여 기증자 플라스미드의 1마이크로그램이 있다. 12시간 동안 5%의 이산화탄소로 38.5도의 세포를 배양합니다.
12시간 후 형질전환은 M199 배양 배지로 HVT 바이러스 육수를 밀리리터당 100, 000플라크 형성 단위로 희석한다. 희석된 바이러스의 130마이크로리터를 각 유전자감염 세포에 추가합니다. 감염되지 않은 세포의 우물 을 음수 대조군으로 설정하고 동일한 양의 바이러스를 추가합니다.
3일 동안 5%의 이산화탄소로 38.5도의 세포를 배양합니다. 정렬 전날 각 우물에 20, 000 세포를 시드하여 두 개의 96 개의 우물 판을 준비합니다. 3 일 감염 후 전감염및 감염된 CEF를 포함하는 6개의 우물 판을 회수합니다.
각 우물에서 배지를 흡인하고 PBS로 셀 시트를 헹구는 다. 각 우물에 0.05%의 트립신-EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 약 5 분 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 38.5도에서 세포를 배양. 그런 다음, FBS의 50 마이크로 리터로 세포를 다시 중단하고 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로이 현탁액을 전송합니다.
원심분리기는 5분 동안 200배의 중력으로. 1%FBS를 포함하는 PBS의 1밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 혈종계를 사용하여 세포를 계산하고 셀 밀도를 밀리리터당 백만 세포로 조정합니다.
다음으로, 스트레이너 캡을 통해 폴리스티렌 선별 튜브로 세포를 옮기십시오. 셀 선별기를 사용하여 GFP를 발현하는 단일 세포를 미리 시드된 96 웰 플레이트로 정렬한다. 5일 동안 5%의 이산화탄소로 분류된 세포로 플레이트를 배양합니다.
5 일 후에 형광 현미경을 사용하여 96 개의 우물 판을 확인하고 단일 GFP 양성 플라크를 포함하는 우물을 표시합니다. 트립신-EDTA 의 50 마이크로 리터와 함께 잘 각 GFP 긍정적인 3 분. 그런 다음, 50 마이크로리터의 배양 배지를 추가하여 세포를 재일시 중단하고 이 현탁액을 CEF를 사용하여 6개의 웰 플레이트 중 하나의 우물로 옮킨다.
3 일 후 동결 매체에 재조합 바이러스의 1 세대 각각의 하나의 유리병을 동결. 액체 질소에 이러한 수확 된 바이러스를 저장합니다. 바이러스의 1 차 세대의 각각에서 100, 000 세포를 수집합니다.
세포를 2, 000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 상체부를 폐기합니다. DNA 추출을 수행할 준비가 될 때까지 세포를 음의 섭씨 20도에 저장합니다. DNA 추출을 수행할 준비가 되면 50마이크로리터의 스퀴싱 버퍼를 사용하여 세포 펠릿을 해동하고 재보힙시다.
30분 동안 섭씨 65도에서 샘플을 lyse한 다음 2분 동안 섭씨 95도에서 Proteinase K.를 비활성화하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 각 DNA 샘플의 마이크로리터 1개를 사용하여 3개의 프라임 접합 프라이머로 PCR 반응을 수행합니다. 증폭 제품의 마이크로리터 2개를 젤 전기포고증용 1%아가로즈 젤 1개웰에 적재합니다. 재조합 바이러스로부터 GFP 유전자를 제거하기 위해, CEF 세포로 미리 시드된 6개의 우물 판으로 Cre 재조합식 플라스미드의 2개의 마이크로리터를 트랜스펙트하기 위해 트랜스페션 시약을 사용한다.
12 시간 후 연동 해동 액체 질소에서 재조합 바이러스의 하나의 유리병. 바이러스를 부드럽게 억제하고 50 마이크로리터를 전염된 세포의 각 우물로 부드럽게 재보종하여 동일한 양의 바이러스를 가진 음수 대조군을 설정합니다. 3일 동안 섭씨 38.5도에서 배양합니다.
72 시간 감염 후 이전에 설명 된 대로 정렬을 위한 세포를 준비. 단일 비형광 세포를 CEF로 미리 시드된 96개의 웰 플레이트로 정렬합니다. 다음으로 선택한 플라크를 트립시화하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 해당 셀을 다시 일시 중지합니다.
세포의 절반을 96개의 우물로 전달하여 2세대로 CEF와 미리 시드되었습니다. 각 클론의 나머지 셀을 5분 동안 200배 의 중력으로 원심분리합니다. 상체를 버리고 DNA 추출을 위한 50마이크로리터의 스퀴싱 버퍼로 세포를 다시 중단합니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA 템플릿의 마이크로리터 1개를 사용하여 5개의 프라임 접합 프라이머로 PCR을 수행합니다. PCR 결과에 따라 추가 통로 및 검증을 위해 재조합 HVT의 3~5개의 양성 클론을 선택합니다. 첫째, 2세대 재조합 HVT를 전시드 24웰 플레이트에 감염시다.
감염 후 48시간 동안 배양 배지를 제거하고 PBS에 4%파라포름알데히드의 500마이크로리터를 추가하여 세포를 고치게 한다. 실온에서 30분 동안 배양하세요. 다음으로, PBS로 고정을 제거하고 세포 층을 세 번 세척한다.
PBS를 제거하고 세포를 침투하기 위해 0.1% Triton X-100의 500 마이크로리터를 추가합니다. 15 분 후 PBS로 세포 층을 세 번 씻습니다. 비특이적 바인딩을 차단하기 위해 1시간 동안 차단 버퍼를 추가합니다.
이어서, 1차 항체 항체 항체 인 VP2 단클론 항체 HH7 또는 HVT 에 감염된 닭 혈청을 블로킹 버퍼에서 1~200에서 희석한다. 희석된 1차 항체 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS로 셀 층을 세 번 씻으시면 됩니다.
이차 항체 염소 안티 마우스 IgG 알렉사 568 또는 염소 안티 치킨 IgG 알렉사 488 차단 버퍼에 1 ~ 200에 희석. 희석된 이차 항체 200마이크로리터를 각 우물에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
형광 현미경을 사용하여 단백질 발현을 확인하십시오. 바이러스 팽창 전날 각 T25 플라스크로 260만 개의 CEF 세포를 시드하였다. 적어도 3개의 양성 클론을 해동하고 각 플라스크에 세포 또는 바이러스의 1개의 유리병을 추가합니다.
플라스크를 섭씨 38.5도에서 5%의 이산화탄소로 배양하여 50%의 세포병증 효과가 관찰될 때까지 배양합니다. 다음으로 배양 배지의 2밀리리터에서 세포를 수확한다. 다음 세대를 위해 CEF 세포로 미리 시드된 새로운 T25 플라스크에 50마이크로리터를 감염시다.
적어도 15 세대에 대한 재조합 바이러스를 통과 유지. PCR을 사용하여 VP2 시퀀스가 존재하기 위해 각 바이러스 생성을 분석합니다. 간접 면역 불발 성 분석을 사용하여 VP2 발현의 바이러스의 각 세대를 분석합니다.
단일 세포 분류 후 정제된 바이러스는 3개의 주요 접합 PCR에 의해 분석되며, 이는 예상되는 크기의 PCR 생성물을 나타낸다. Cre recombinase에 의해 GFP 기자의 절제 후 50% 이상의 플라크그들의 GFP 표현을 분실했습니다. GFP 절제 후 정제 플라크는 단일 셀 정렬에 의해 얻어지고 예상 된 크기의 제품을 보여주는 5 개의 주요 접합 PCR에 의해 추가로 확인된다.
단백질 발현은 VP2 특정 단일클론 항체 및 항HVT 닭 혈청을 사용하여 간접 면역 형광 분석에 의해 확인된다. 예상대로, 부모 HVT에 감염된 세포는 안티 HVT 혈청에 의해서만 염색될 수 있습니다. 재조합 HVT 감염된 세포는 VP2 유전자의 발현을 명확하게 보여준다.
재조합 바이러스를 생성하기 위해서는 바이러스와 삽입이 동일한 세포에서 만나게 될 가능성을 최대화하기 위해서는 재조합 바이러스가 발생하도록 한다. 이러한 절차에 따라 동물 실험은 재조합 백신의 면역원성 및 효능을 평가하기 위해 수행될 수 있다. 여기에 설명 된 CRISPR / Cas9 시스템 플랫폼을 사용하여 새로운 다발성 벡터 백신의 개발은 여러 가금류 질병으로부터 보호하기 위해 가금류 산업에 매우 도움이 될 것입니다.
