저자는 가치있는 토론과 조언을 H. 올리바 레스와 D. Ruge에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NSF SBIR 상 (BioSentinel 주식에 IIP-1127245)와 국방부 계약 (BioSentinel 주식에 W81XWH-07-2-0045)에 의해 부분적으로 지원되었다.

FM 독촉, TM 광장, F. Zeytin의, 및 WC 터커 BioSentinel 주식 BioSentinel의 직원 또는 소유자입니다 현재 생산이 보고서에서 제시 한 시약을 상용화했다.

이 프로토콜은 본트 / 복잡한 매트릭스에서 복잡한, holotoxin, 또는 클로 스트 리듐 속의 세균 배양액을 정량화하기위한 절차에 대해 설명합니다. 분석 감도 혈청 및 분석법에 걸쳐 달라질 수 있지만, 각각 매트릭스 세이 56, 60와 다른 BONT 혈청 형 (예 BONT / B, E 및 F)을 테스트 할 때 프로토콜은, 그러나, 동일하다. 이 프로토콜은 가능한 샘플의 모든 유형을 고려하지 않고, 몇몇 수정은 특정한 샘플 조성 및 원하는 애플리케이션에 따라 요구 될 수있다. 행렬은 식품 샘플 (예 : 식품 도전 테스트) 또는 제약 부형제 버퍼 (예 : 본트 기반 약물 제품 테스트)를 포함 할 수 있습니다. 단지 비 식품 (예를 들어, 동물 조직 또는 환경) 액체와 고체 시료는 식품 샘플로 취급되어야한다. 이 프로토콜은 200 μL / 잘 샘플 볼륨을 사용하지만, 적은 50 μL / 잘 배 Bindin의 볼륨에 해당하는 조정으로 테스트 할 수 있습니다G 버퍼. 50 μL보다 작은 샘플을 테스트하기 전에 ≥ 50 μL에 GPB 또는 PBS로 희석해야한다. 식품의 높은 변수 자연 식품 본트 검출 및 정량을위한 특별한 도전을 나타냅니다. 샘플의 pH, 점도, 이온 강도, 입자상 물질의 존재는 잠재적으로 식품 매트릭스 내 독소의 활성에 영향을주고, 독소가 정확 체외 부량 식품으로부터 분리 될 것을 필요로 할 수있다. 많은 음식이나 독소 제제도 제거 또는 만 BONT 특정 단백질 분해 효소의 활성을 측정하도록 단백질 기반의 기자를 사용하는 경우 비활성화해야합니다 내인성 단백질 분해 효소가 포함되어 있습니다. 이러한 제약 부형제 버퍼로도 간단하고, 잘 정의 된 버퍼 행렬, 정량화 35,56-59,61 전에 제거해야 본트 활동을 방해 화합물을 포함 할 수 있습니다. 면역은 빠르고, 높은 혈청 형 특정 BONT 푸리을 제공합니다문법을 없애는 방법하지만 &quot;실제&quot;음식, 환경, 의약품 샘플에서 발견되는 낮은 독소 농도를 분리하기 위해 선호도가 높은 항체가 필요합니다. 기술 된 프로토콜은 BONT / A 코어 holotoxin 56 독소 중쇄 수용체 도메인 향하는 안티 BONT / A 항체로 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 독소를 정화한다. 클로스 트리 디움 종 그러나 자연적으로 연관 코어 holotoxin 이루어진 독소 복합체를 생산할 낮잠 62 ~ 64과. 낮잠은 위장관에서 단백 분해 효소의 공격으로부터 독소를 보호하고 소장 상피 세포 63,65 통해 독소 전송을 촉진하기 위하여 믿어진다. 넵스 코어 holotoxin (데이터는 도시하지 않음)에 IP-A 비드 안티 BONT / A 항체의 결합을 억제한다. 이 억제는 본트 / A holotoxin 및 낮잠에 해리 복잡하고 수 있도록 효과적인 독소의 원인, 6.25 ~ 이상으로 샘플의 pH를 증가시켜 안심IP-A에 결합하는 것은 66를 구슬로 장식한다. 이러한 이유로, 6.5 이상으로 시료의 pH를 조절하는 것은 상기 분석 (도 5b)의 성공에 매우 중요하다. 프로토콜에 사용되는 배 바인딩 버퍼는 표준 분석 조건으로 pH를 올릴 수 있도록 완충제가 들어 있습니다. 그러나, 많은 산성 식품은 결합 완충액의 완충 능력을 압도 할 수있다. 추가적인 10X 중화 버퍼는 크게 시료 완충 능력을 증가시키고 식품 행렬의 대부분을 중화한다. 분석을위한 또 다른 중요한 매개 변수는 샘플 이온 강도입니다. 원심 분리하여 샘플의 설명은 다음과 같은 면역 효과 비드 세척 및 복구를 위해 필요합니다. 신선한 토마토와 테스트 샘플을 간단하게 처리하고 원심 분리했을 때 더 본트 / 복구가 보이지 않았다 것으로 나타났다. 우리는 본트 / A는 원심 분리 동안 펠렛의 원인이되는 토마토의 육체에 연결하고 결석이 될 수 있다는 것을 가정시험 뜨는. 우리는 발견 BONT 개선 독소 복구 (그림 5B)의 결과로 매트릭스 사이의 pH가 제한된 상호 작용을 중화, 더 크게, 이온 강도를 증가 시키거나. BONT 복구에 필요한 것은 아니지만, 그것은 더 높은 염 농도는 또한 면역 침전의 엄격 성을 증가시키고 이하 비특이적 단백질 복구 결과, 특히 저염 식품에서 것을 증명하지 않지만, 예상된다. 샘플 pH와 프로토콜의 이온 강도의 조정은 10X 중화 완충액의 첨가에 의해 수행되고 음식의 광범위와 호환되어야한다. 배 중화 버퍼가 높은 완충 능력을 가지고 있지만, 일부 높은 산성 식품은 추가 pH 조정이 필요할 수 있습니다. 버퍼 또한 다음 샘플의 pH 시험은별로 분석 성능이 관찰되는 경우에 권장 및 샘플 볼륨이 허용됩니다. 추가로 pH 조정 해제의 첨가를 통해 달성 될 수있다1 M HEPES pH가 8 몰 볼륨, 필요한 경우. 가난한 결과는 주어진 재료로 볼 경우, 10 배 중화 버퍼가 1 M HEPES pH를 8로 대체 할 수 있으며 10 배 중화 버퍼에 의해 도입 된 추가 염화나트륨은 염도가 음식을하지만 모두를 위해 허용해야한다. PBS에 1.2 M까지의 NaCl 농도에서 설명 된 프로토콜을 테스트 할 때 유의 한 차이가 관찰되지 않았다. 이 프로토콜은 샘플의 대부분에 적용될 수 있지만, 산도, 이온 강도, 및 / 또는 프로테아제 콘텐츠의 극단에서 식품 분석으로 좋은 결과를 얻을 수없는 경우가 있습니다. 어떤 음식도별로 구슬 복구의 결과로, GPB의 추가 다음 너무 점성이 남아있을 수 있습니다. 이러한 PBS와 같은 간단한 버퍼와 샘플의 희석 결과를 향상시킬 수 있습니다. 세척의 수를 증가 시키거나 (증가 염화나트륨 농도) 엄격 씻어 EDTA없는 단백질 분해 효소 억제제의 농도가 증가하면 결과를 향상시킬 수있는 경우 비특이적 인 단백질 분해 효소 오 염이온이 관찰된다. 자동 판 세척을 사용하는 경우 악기의 청결도도 매우 중요합니다. 다른 실험실 분석에서 단백질 분해 효소 (예를 들어, 트립신)와 배관 및 분사 노즐의 오염은 분석 중에 단백질 분해 효소의 의도 도입으로 이어질 수 있습니다. 제조업체의 사용 설명서에 따라 와셔의 철저한 청소는 분석을 실행하기 전에하는 것이 좋습니다. BoTest 매트릭스 분석은 복잡한 매트릭스에서 본트 검출과 정량에 대한 최초의 상용화, 활동 기반의 분석이다. 표준 마우스 생물학적 검정에 비해, 분석은 덜 비싸고, 빠르고, 특수한 설비 또는 동물 용 (56)과 관련된 윤리적 문제에 대한 필요없이 높은 스루풋 테스팅을 허용한다. 다른 생체 본트 검출 방법이 설명되어 있지만, 복잡한 샘플 매트릭스와 호환되도록 표시되지 않은, 전문 장비를 필요로하거나, 상업적으로 이용하실 수 없습니다르 35,42-44,46-55. 분석은 기존의 효소 결합 immunosorbant 분석 (ELISA) 기술은 독소의 질량을보고있는 반면, 독소 엔도 활동을 측정 활동 기반의 분석이다. 활동 기반 ELISA 분석법이 전술되었지만 이러한 분석법은 식품 행렬 작동하고 샘플 행렬 (41)로부터의 정화 독소를 포괄하지 입증되지 않았다. 매트릭스 화합물은 종종 본트 활동 35,56-59을 방해하기 때문에 독소가 샘플에서 정제되지 않은 경우 복잡한 시료의 독성의 중요한 과소가 발생할 수 있습니다. 프로토콜은 마스터되면 변형이 샘플 볼륨을 높이고 샘플 감도를 증가시키기 위해 이루어질 수있다. 예를 들어, 비즈 독소의 결합은 원심 분리에 의해 수집 전에 큰 벌크 샘플 (예를 들면 10 ㎖ 이상)에서 수행 될 수있다. 이러한 비드를 96 - 웰 플레이트에 첨가하고 설명 다음 정량 할 수있다D 프로토콜입니다. 하나의 로그보다 큰 감도의 증가는 증가 샘플 크기 (56) 관찰되었다. 따라서, 상기 설명한 프로토콜은 미량이라도 마우스 생물학적 검정에 의해 탐지되지 수도 시료에 함유 BONT의 양을 검출하기 위해 큰 양의 샘플과 함께 사용될 수있다.

보툴리눔 신경 독소 (BoNTs가) 1-3 NG 추정 정맥 인간의 치사량 알려진 치명적인 물질이다 / 1,2 kg. BONT 일곱 구조상 유사한 혈청 형은, 각 셀이 아연 엔도 펩 티다 제 3-5 인코딩 세포질 및 경쇄으로, 흡수 및 전좌 바인딩에 대해 책임 중쇄 도메인으로 구성된 존재 G 통해 레이블. 본트의 절묘한 독성이 부분에서의 결과, 신경 근육 접합부 6에서 운동 뉴런에 자사의 특정 바인딩 및 항목. 일단 뉴런 내부 경쇄 엔도 펩 티다 제는 특별히 클리브 수용성 N-에틸 말레이 미드 구분 인자 부속 단백질 수용체 (SNARE) 소포 융합에 필요한 단백질 중 하나 이상은, 신경 전달 물질 방출을 억제 및 이완성 마비 7-14 선도. 일반적으로 질병 &quot;보툴리누스 중독,&quot;본트에 의해 다이어프램과 늑간 근육의 마비로 알려진 궁극적으로 결과조기 진단과 치료를하지 않는 한 호흡 부전과 죽음이 수신됩니다. 인간의 인성 보툴리누스 중독은 가장 일반적으로 BONT 혈청 형 A, B, E와 관련, 일반적으로 F (BONT / A, BONT / B 등)은 오염 된 음식 (15, 16)의 섭취에서 발생되고 있지만, 상처 보툴리누스 중독의 몇 가지 경우 정맥 주사 마약 사용자 (17, 18) 사이에보고되었다. 미국의 경우, 하나의 세 미만의 어린이가 클로 스트 리듐 포자의 섭취로 인한 유아 보툴리누스 중독 보툴리누스 중독 19-21의 가장 일반적인 형태입니다. 그러나, 부적절한 가정 통조림 및 가공 식품으로 인한 식품 매개 본트의 발생은 미국과 해외 모두에서보고되었다. 2,000에서 2,009 사이 사이에, 인성 보툴리누스 중독의 적어도 3백38가지 경우는 여섯 사망 22 일을 포함하여 전 세계적으로보고되었다. 신속하고 민감하게 인성 보툴리누스 중독의 발생을 감지 할 수있는 능력은 조기 진단에 도움이 할 수있는 중요한 표시이다 (23, 24). 또한, 비용 효과적이고 일상적인 식품 검사 수있는 검출 방법 개선 식량 안보로 이어질 것입니다. 본트의 신경 세포 특이 긴 생물학적 반감기는 또한 강력한 치료합니다. 미국에서는 본트 기반 약물은 화장품 조건 미간 라인, 자궁 경부 디스 토니아, 편두통, 과민성 방광, 사시 등의 신경 근육 관련 질환의 치료를 위해 식품 의약품 안전청에 의해 승인됩니다. 다수의 &quot;오프 라벨&quot;응용 프로그램은 심각한 근육 장애 25-28를위한 고용량 치료를 포함하여 설명되어 있습니다. 과다 복용은 잠재적으로 유해한 부작용의 위험에 환자를두고있는 동안 underdosing이 효과 치료로 이어질 수 있으므로 정확한 독소 정량화, 올바른 투약 중요합니다. 불행하게도, 표준화 된 역가 시험 프로토콜은 본트 기반 약물의 produ 사이의 단위 정의 불평등의 결과로, 제조 업체간에 공유되지 않습니다CTS 29-31. 본트의 표준 시험 BONT 함유 시료를 생쥐에 복강 주사와 죽음의 숫자가 1-7 일 이상 16,32,33 기록되는 마우스 생물 검정입니다. 마우스 생물 검정 5-10 PG BONT / A (34)의 검출 한계 (LOD)에 매우 민감하지만, 동물의 사용에 윤리적 인 문제, 높은 교육 인력의 비용과 동물 시설, 긴 분석 시간 및 부족을 유지 표준화 된 프로토콜은 표준화, 동물성 본트 테스트 및 정량 방법 35-39을 개발하기 위해 호출 결과. 최근, 여러 가지 대체 본트 정량 방법은 마우스 및 인근 마우스 생물 검정 감도 40-49을 제공하는 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광, 질량 분석기, 면역 학적 방법을 사용하고 동물을 사용하지 않고 마우스 생물 검정보다 훨씬 짧은 분석 시간을 제공합니다. 질량 분석은 면역 techniq와 함께 접근 방법단말은 감지하고 BONT 음식과 다른 복잡한 시료에 포함 된 계량 표시했다 있지만, 인사 교육 요구 사항 및 특수 장비의 제한이 분석 50-55. 대부분의 다른 대체 시험 법은 복잡한 샘플 테스트에 쉽게 적용 할 수 없습니다 또는 일상 본트 테스트에 필요한 처리량이 부족합니다. BONT의 극단적 역가 맞게 감도 시험 관내 분석 방법을 개발하고자 할 때 식품 샘플의 점도, 산도, 염 함량, 및 매트릭스 성분의 높은 변수 특성은 특히 어려운 도전을 제시한다. 또한, 이러한 BONT 기반 의약품의 재 부상으로 인한 것과도 간단하고 상대적으로 양성 버퍼 시스템은 크게 체외 BONT 힘 56에 영향을 소금, 알부민, 설탕 안정제 (즉, 부형제)가 포함되어 있습니다. 독소 정화는 샘플 56-59의 간단한 그러나 모두의 정확한 작동 테스트를 위해 필요합니다. BoTest 매트릭스 분석은 신속하고 높은 처리량을 위해 설계되었으며, 일반적으로 연구소 56, 60에있는 장비를 사용하여 매우 복잡한 시료에서 본트의 일관성을 정량화 하였다. 이러한 분석은 공유 결합하여 샘플로 본트를 격리시키는 한 후 세척하여 매트릭스 화합물을 방해 제거하는 혈청 형 특정 안티 본트 항체에 링크 된 성체의 구슬​​을 사용합니다. 세탁 후, 바인딩 본트의 단백질 분해 활성은 다음 본트 혈청 형이 시험과 호환 기자를 사용하여 최적화 된 반응 버퍼에 계량입니다. 이 기자는 N-말단 시안 형광 단백질 (CFP) 부분과 구성 본트 기판, SNAP25 잔류 141-206 또는 시냅 잔류 33-94로 연결 C-말단 노란색 형광 단백질 유도체 (비너스) 부분으로 구성된 형광 단백질 BoTest A / E 또는 B / D / F / G 기자, 각각 45. 본트로 기자의 분열은 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)를 사용하여 모니터링됩니다. 때 t그는 기자 CFP의 여기가 CFP 방출 흥미로운 금성 방출을 담금질, 금성 FRET 결과, 그대로입니다. 본트로 기자의 분열은 CFP 방출과 금성 방출 감소의 증가로 이어지는, FRET을 방지 할 수 있습니다. BONT 활동은 정량적 CFP 금성 배출량의 비율을 사용하여 측정 할 수있다. 3 PG 아래 LOD는 높은 처리량 96 웰 플레이트 포맷 (56)을 이용하여 식품의 넓은 범위에서 가능하다. 분석은 비드 표면에 독소의 농도를 수 있기 때문에 감도를 증가가 큰 샘플 볼륨을 사용하여 얻을 수있다. BoNTs A, B, E, 및 F에 대한 BoTest 매트릭스 분석법이 개발, 식품, 제약, 환경 시료 56, 60과 함께 시험 하였다. 여기, 우리는 (예를 들어, 제약, BONT 버퍼)와 높은 복잡성 (예 : 식품, 환경) 샘플 낮은 복잡성 본트의 검출에 대해 이러한 분석을 실행하기위한 절차를 설명합니다. 구체적인 처리 방법여러 종류의 시료는이 프로토콜에서 해결하고 설명을 생략 종류의 시료는 일반적으로 표시 방법을 조합하여 적용 할 수 위해. 프로토콜은 개발 및 테스트 BONT / A와 함께하지만, 다른 56, 60 설명한대로 각각의 분석을 사용하여 다른 본트의 혈청 형에 적응할 수 있었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">BoTest Matrix A Botulinum Neurotoxin Detection Kit</td>
			<td style="width:107px;">BioSentinel</td>
			<td style="width:104px;">A1015</td>
			<td style="width:245px;">Detection kits for BoNT/B and F are also available.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">Varioskan Flash fluorescence microplate reader</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:104px;">5250040</td>
			<td style="width:245px;">Most monochromator- or filter-based units with 434 nm excitation and 470 and 526 nm emission capability can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:192px;">96-well Magnetic Bead Separation Plate</td>
			<td style="width:107px;">V&#38;P Scientific&#160;</td>
			<td style="width:104px;">VP771H</td>
			<td style="width:245px;">Other magnetic plates may be used, but the plate should be designed to separate the beads to the side of the well.</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:192px;">Magnetic Bead-Compatible Plate Washer</td>
			<td style="width:107px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:104px;">ELx405 VSRM</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for automated plate washing.&#160; Other magnetic bead-compatible plate washers may also be used, but should be tested before use.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for samples needing centrifugation.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:192px;">MixMate plate mixer</td>
			<td style="width:107px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:104px;">22674200</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:107px;">Various</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Used at room temperature or at 25 &#176;C If temperature control is available</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">EDTA-free Protease Inhibitor Tablets</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">4693132001</td>
			<td style="width:245px;">Only required for food or environmental testing.&#160; Protease inhibitors must be EDTA-free.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:192px;">BoNT/A&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:104px;">N/A</td>
			<td style="width:245px;">Optional, only required for standardization and quantification purposes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">Black, Flat-bottomed 96-well Plates</td>
			<td style="width:107px;">NUNC</td>
			<td style="width:104px;">237105</td>
			<td style="width:245px;">Plates should not be treated</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:192px;">96-well Plate Sealing Tape</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:104px;">15036</td>
			<td style="width:245px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and quantification of botulinum neurotoxin from complex matrices using the botest matrix assays

정확한 탐지 및 복잡한 매트릭스에서 보툴리눔 신경 독소 (BONT)의 정량화는 제약, 환경, 식품 샘플 테스트를 위해 필요합니다. 정확한 역가 시험이 BONT 기반의 의약품 제조 및 환자의 안전을 위해 필요합니다 동안 식품의 신속한 본트 테스트는 발생 법의학, 환자 진단 및 식품 안전 테스트에서 필요합니다. 본트 테스트를 위해 널리 사용되는 마우스 생물 검정은 매우 민감하지만, 신속하고 일상 본트 테스트에 필요한 정밀도와 처리량이 부족하다. 또한, 동물의 생물 검정의 사용은 본트 테스트를위한 마우스 생물 검정을 대체 할 수있는 미국 및 해외 의약품 규제 당국과 동물 권리 지지자에 의해 호출 귀착되었다. 여러 생체 대체 시험 법은 간단 버퍼에서 정제 본트와 잘 작동이 개발되어 있지만, 대부분은 매우 복잡한 매트릭스의 시험에 적용 할 수 표시되지 않았습니다. 여기에서의 검출을위한 프로토콜BoTest 매트릭스 분석을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 본트가 표시됩니다. 분석은 세 부분으로 구성된다 : 첫 번째 부분은 시험을위한 시료의 준비를 포함, 두 번째 부분 행렬에서 BONT를 정화 안티 BONT 항체 - 코팅 된 상자성 비드를 사용하여 면역 침전 단계이며, 셋째 부분은 절연 BONT의 단백질 분해를 정량화 형광 기자를 사용하여 활동. 프로토콜은 액체와 고체 두 행렬을 사용하여 96 - 웰 플레이트에 높은 처리량 테스트를 위해 작성 4-26 시간의 총 분석 시간은 시료의 종류, 독소로드, 원하는 감도에 따라와 설명서를 준비 약 2 시간을 필요로합니다. 데이터는 인산염 완충 생리 식염수, 의약품, 배양액, 2 % 우유, 신선한 토마토와 본트 / A 테스트를 제시하고 분석의 성공을위한 중요한 매개 변수의 설명이 포함되어 있습니다.

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Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

isolation-quantification-botulinum-neurotoxin-from-complex-matrices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.9K 조회수.  BioSentinel Inc., Madison, WI.  BoTest 매트릭스 보툴리눔 신경 독소 (본트) 검출 분석은 빠르게 정화 및 샘플 행렬의 범위에서 본트의 양을. 여기, 우리는 고체와 액체 두 행렬에서 본트의 검출과 정량을위한 프로토콜을 제시하고 보톡스, 토마토, 우유와 분석을 보여줍니다. 

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Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

마우스 Dopaminergic 및 3 차원 콜라겐 매트릭스 Assays의 Striatal Explants의 해부와 문화

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

의미 심장한 복잡한 두뇌 지형에 대한 Wholemount Immunohistochemistry

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

배아 전뇌에서 내피 세포의 분리 및 문화

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result of chemical inputs to its synapses. However, neurons can also be excited by an imposed electric field. In particular, recent clinical applications activate neurons by creating an electric field externally. It is therefore of interest to investigate how the neuron responds to the external field and what causes the action potential. Fortunately, precise and controlled application of an external electric field is possible for embryonic neuronal cells that are excised, dissociated and grown in cultures. This allows the investigation of these questions in a highly reproducible system.
In this paper some of the techniques used for controlled application of external electric field on neuronal cultures are reviewed. The networks can be either one dimensional, i.e. patterned in linear forms or allowed to grow on the whole plane of the substrate, and thus two dimensional. Furthermore, the excitation can be created by the direct application of electric field via electrodes immersed in the fluid (bath electrodes) or by inducing the electric field using the remote creation of magnetic pulses.

Neuronal cultures are a good model for studying emerging brain stimulation techniques via their effect on single neurons or a population of neurons. Presented here are different methods for stimulation of patterned neuronal cultures by an electric field produced directly by bath electrodes or induced by a time-varying magnetic field.

전기 단일 및 두 개 차원 문화에 자기장을 사용하여 신경 세포의 외부인가 전압

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

신경 줄기 세포의 열거 클론 세이를 이용하여

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

세포외 매트릭스 단백질에 대한 세포 반응을 연구하기 위해 마이크로 패터닝을 위한 PRIMO 시스템을 사용하여 단백질의 빛 유발 분자 흡착

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...