Funding was provided by the Joint Science and Technology Office &#8211; Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).

플레이트 20,000 차별화 된 마우스 ES 세포 (MES) / 웰 96 웰 폴리 D 라이신 코팅 된 플레이트에 5-7 일 운동 신경 터미널 차별화 미디어에서 유지한다. 본트 / A 1. 복합 관리 및 중독 CDC / NIH 가이드 라인을 준수하기 위해 BSL2 인클로저에 다음과 같은 모든 작업을 수행합니다. <ol><li> 폴리 프로필렌 96 웰 플레이트에 100 % DMSO의 각 라이브러리 화합물의 10 mM의 재고 솔루션을 준비합니다. 원하는 검사 농도보다 10 배입니다 중간 희석 판을 준비하기 위해 10 mM의 주식을 사용합니다. 96 웰 플레이트에 10 mM의 주식을 분배 100 μM의 중간 판을 준비하고 문화 미디어를 사용하여 100 μM의에 희석. 셀 (11)에 미디어의 90 μL에 화합물의 10 μl를 분배. 10 μM의 최종 농도에서 시험 화합물 0.5 %를 초과하지 않는 DMSO의 최종 비율을 확인. </li><li> 모든 스터드를 수행바이오 안전성 수준이 조건에서 살아있는 세포 활성 독소를 활용 이거 야. 신선한 터미널 차별화 미디어의 80 μL은 12 채널 매뉴얼 피펫을 이용하여 96 웰 플레이트에서 기존 미디어를 교체합니다. 흡입을 수행하고 주위 공기에 용지없이 세포의 노출을 방지하기 위해 행함으로써 단계를 분배. </li><li> (2 회) 종래 흡인 혼합하여 12 채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 10 배 화합물 10 ㎕를 첨가하여 독소의 애플리케이션 화합물과 세포를 전처리. 각 96 웰 플레이트를 들어, 높은 신호와 낮은 신호 제어를 제공하기 위해 미디어에 희석 10 배 DMSO 6 우물의 두 열을 취급합니다. 본트의 처리없이 열은 전체 길이 SNAP-25 (높은 신호 제어)의 최고 수준을 나타낸다. 낮은 신호 제어와 같은 (어떤 화합물없이) 혼자 본트와 다른 열을 처리합니다. (BACS 항체와 SNAP-25의 검출 본트 절단의 효율성을 관찰하기 위해 그림 2의 컨트롤을 사용하여). </li><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 및 6 % CO 2의 화합물과 세포를 부화. </li><li> 인산염에 1 ㎎ / ㎖ 상용 소스에서 보툴리눔 신경 독소 A를 준비 터미널 차별화 미디어 희석하여 최종 10 배 근무하는 식염수 (PBS)를 버퍼. </li><li> 멀티 채널 피펫 (그림 2)를 사용하여 치료 및 낮은 신호 컨트롤에 대해 지정된 우물에 10 배 본트 / A 주식의 10 μl를 추가하여 중독을 시작합니다. 형 미디어와 높은 제어로 지정된 우물을 취급합니다. </li><li> 20 분 이상 물에 0.825 % 차아 염소산 용액에서 침수로써의 연구 기간 동안 본트 / A와 접촉하는 모든 플라스틱 구조물 및 기타 일회용 오염을 제거. 바이오 안전성 캐비닛의 모든 절차를 수행하고 이전과 같은 MICROCHEM 솔루션으로 5 % 세제 살균제 청소기로 실험 전후에 작업 지역의 오염을 제거. </li><li> 독소 사용 incub을 나타 내기 위해 명확하게 번호판을 레이블먹었다 플레이트 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C에서 4 시간과 6 % CO 2는 1nm / L가 본트 / A로 처리 하였다. 독소는 실험실에서 사용 중임을 동료들에게 알려 적절한 간판을 표시합니다. </li><li> 정지 본트 / 메탄올 고정하여 단백질 분해 절단. 멀티 채널 피펫 각 우물에서 독소 및 화합물을 포함하는 미디어를 제거하고 10 % 표백제 용액에 버린다. 각 웰에 직접 얼음 냉 메탄올 (100 μL)를 추가합니다. </li><li> 정착이 발생할 수 있도록, 실온 (RT)에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 고정 후, 안전하게 바이오 안전성 레벨 1 프로토콜을 폐기 시약 (중화 간주)을 처리하고 그에 따라 폐기하십시오. </li><li> 메탄올을 취소하고 세포를 씻어 면역 염색하기 전에 그들을 재수하는 PBS 100 μl를 사용합니다. 두 개의 추가 PBS 세척을 수행합니다. </li><li> 최종 세척 한 후, 분석 할 때까지 4 ° C에서 마이크로 접착 필름 및 저장소와 우물, 인감 플레이트에 PBS를 둡니다. 4 ° C의 FO에서 보관 판며칠 r에. </li></ol> 2. 면역 염색 면역 염색 과정은 상당한 intraplate과 interplate 변화의 잠재적 인 도입으로 이어질 수 반복 시약 분배 / 대기음주기와 폭 넓은 플레이트 세척을 포함하는 노동 집약적, 다단계 작업입니다. 반자동 방식은 실험실 요원의 시간을 절약 분석 처리량을 증가시키고, 면역 염색 변동성을 최소화하기 위해 적용된다. <ol><li> 이 프로토콜에 대한 모듈러 갑판의 다른 위치 (재료 및 장비를 참조)로 실험 실용을 이동 로봇 그리퍼 아암 250 μL 및 집적 볼륨을 전송할 수있는 96- 웰 헤드를 갖춘 자동화 된 워크 스테이션을 사용한다. <ol><li> 모듈 형 데크 실험 실용의 다른 유형을 개최하고 한 번에 최대 11 항목에 지원할 수있는 설계되었습니다. 자동 마이크로 처리기가 유지하기 위해 이중 잡지 마이크로 플레이트 스태커를 구비하고,사이클 당 50 판까지 조작 할 수 있습니다. </li><li> 자동화 된 워크 스테이션은 불임과 안전을 제공하기 위해 실험실 자동화 장비를 위해 설계된 클래스 II 생물 안전 캐비닛의 내부에 있습니다. 필요에 따라 인간의 개입없이 시약 액세스 할 수 있도록도 3에 도시 된 바와 같이 자동 면역 염색을 위해, 갑판 배치된다. </li></ol></li><li> 액체 처리 동작에 필요한 갑판 플레이트 잡지 및 전송로 고정 된 세포를 포함하는 사전로드 플레이트. 아래로 10 μL로 우물에서 PBS를 대기음 250 μL 팁 장착 (96) 피펫 헤드를 사용합니다. 투과성으로 완충액 (0.1 % 트리톤 X-100)으로 세포 내 표적에 결합하는 항체를 용이하게 세포막을 Permeabilize 하시려면. 웰을 실온 (RT)에서 15 분 배양 용 마이크로 플레이트 스태커의 제 2 저장 잡지 판을 반환하기 전에 각으로 투과성으로 완충액 (100 μL)를 분주한다. </li><li> 투과성으로 버퍼와 PE를 제거PBS (2 회)와 rform 플레이트의 세척은 이전 단계 1.13에 설명. </li><li> 마지막 세척 단계 후, PBS 완충액 및 RT에서 1 시간 인큐베이션 판 잡지에 반환하기 전에 모든 마이크로 플레이트에 PBS에 1 % 말 혈청, 0.1 % 트윈 20을 함유하는 블로킹 완충액 100 ㎕를 분배 제거. </li><li> 면역 염색에 대한 두 가지 기본 항체를 사용하여 토끼 폴리 클로 날 항 - 마우스 BACS 항체를, 전체 길이 SNAP-25와 마우스 단일 클론 항 III 튜 불린 항체의 검출 뉴런 (재료 및 장비를 참조)의 검출. 인큐베이션 60 분 후, 블로킹 완충액 제거하고 모든 플레이트에 블로킹 완충액에 4ug / ㎖ BACS 항체 및 III-tubulin의 0.5 ㎍ / ml의 50 μl를 분배. </li><li> RT는 0.05 % 트윈 (PBST)을 포함하는 PBS 100 ㎕로 3 회 차 항체를 제거하고 세척에서 1 시간 동안 품어. </li><li> 알렉사 F 태그 -III의 tubulin 및 안티 - 토끼 IgG를 시각화하는 알렉사 플 루어 647 표지 항 마우스 IgG를을 사용하여luor 568 BACS 항체를 시각화합니다. 버퍼를 차단에 2 ㎍ / ㎖의 희석 등 모두 항체를 준비하고 각 우물에 혼합물의 50 μl를 분배. 참고 : 면역 염색으로 선택 이차 항체는 높은 함량 이미 저의 검출기 내에서 서로 다른 채널을 사용하여 서로 다른 파장에서 그들의 방출되는 형광 빛을 감지 할 수 있도록 서로 다른 형광 물질로 표시되어 있습니다. </li><li> 실온에서 1 시간 동안 품어. 이차 항체를 대기음 PBST 100 ㎕로 3 회 씻는다. </li><li> 최종 세척 후, 핵 탐지를위한 DNA를 얼룩 PBS 포함 훽스트 (Hoechst) 염료 (32 μM) 100 μL를 추가합니다. </li><li> photobleaching에에서 형광을 보호하기 위해 빛 투과성 필름 판을 밀봉합니다. 플레이트는 4 저장할 수 있습니다 &#160; 신호의 상당한 손실없이 주 동안 C를 °. </li></ol> 3. 영상 참고 : 높은 콘텐츠 이미징 sys 인을 사용하여 이미지 수집을 수행TEM (재료 및 장비를 참조하십시오). <ol><li> 고 함량 이미 저 정의의 사양 : <ol><li> 선택 플레이트 형, 레이아웃, 필드의 수, 목적 : 그레이 너 U 분명, 20 배의 물을 각각 96 웰 형식, 16,. </li><li> 선택 채널 : 핵 여기 EX : 채널 4와 같은 405 nm의; 세포질 EX : 채널 2와 같은 644 nm의; 항원 특이 항체 채널 EX : 561 채널 3과 나노 각 레이저의 설정 여기 전원, 2 노출로 설정 실험, 644 nm에서 하나 여기, 405 nm의 561 nm에서 두 음원 정보와 노출 2 노출 1. BIN2으로 비닝 (binning)을 선택합니다. </li><li> SNAP-25 채널과 최소한의 강도에 대한 낮은 제어 우물로 최대 강도와 노출 최적화를 위해 높은 제어 우물을 사용합니다. </li><li> 각 채널의 강도가 포화 레벨 (2,000-2,500 상대 단위)의 약 절반이되도록, 노출을 조정한다. </li><li> 델타 보정 스크립트를 사용하여 셀 마스크 채널에 최적의 Z 평면을 식별합니다. 참조 인터넷면역 염색 및 이미징 후 결과를 gure 5. 이미지 분석 소프트웨어가 상주하는 서버에 데이터를 내 보냅니다. </li></ol></li></ol> 4. 이미지 분석 (그림 6) 주 : 다음 단계는 콜럼버스 소프트웨어 알고리즘의 응용 프로그램을 설명합니다. <ol><li> 기본 객체 (핵) 세그먼트에 대한 적절한 알고리즘을 선택합니다. 필요한 경우, 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 콜럼버스 소프트웨어는 4 핵 검출 방법을 제공한다. 시각적으로 분할 핵을 검사하여 정확하게 세그먼트 핵 (F igure의 6A 방법 M에서 선택한 경우)하는 방법을 선택합니다. </li><li> 필요한 경우, 세그먼트에 신경 돌기를 신경 돌기 알고리즘 (CSIRO 신경 돌기 분석 2) 선택 배경을 제거하기 위해 배경 임계 값 및 대비 매개 변수를 조정합니다. 신경 돌기를 감지하는 데 사용 매개 변수도 6b를 참조하십시오. </li><li> 신경 돌기 지역 (신경 돌기 세그먼트) BAS를 확인ED β-III 튜 불린 채널 마스크 (그림 6C)와 같은 (알렉사 밀가루 640)의 -3 픽셀 확장을 사용하여 보조 객체 (신경 돌기)에. </li><li> 신경 돌기 영역 및 β-III 튜 불린 채널 (그림 6D 및 6E)에 대한 신호 채널 (SNAP-25 (알렉사 밀가루 568)의 ​​강도를 계산합니다. </li><li> 이러한 신경 돌기의 길이, SNAP-25의 평균 강도, β-III의 튜 불린, 핵 번호, 신경 돌기 세그먼트 번호 등 (그림 6 층) 등의 수출에 원하는 매개 변수를 선택합니다. </li><li> 이미지 획득을위한 고 함량 이미 저에 로봇과 부하를 사용하여 플레이트 스태커에서 전송 접시. </li></ol> 5. 데이터 분석 : 설계된 분석의 견고성을 평가하기 위해, 플레이트 기반 실험으로부터 다음과 같은 파라미터를 계산한다. <ol><li> 배경에 신호 (S) (B) : 낮은 신호 제어의 S는 / B = 의미 /) 높은 신호 제어의 강도를 의미 강도 </li> &lt;액체 취급에 변동을 결정하는, CV = (표준 편차 (SD) 시료 / 평균) * 100 (%) : 리&gt; 신호와 배경의 변동 (CV)의 계수 (특정 신호의 균일 성을 측정) 시약 등 </li><li> 잡음 신호 : S는 = - 낮은 제어 / SD을 (신호의 강도를 의미하는 낮은 신호 제어의 강도를 의미) <ol><li> 하나의 96- 웰 플레이트의 절반 및 나머지 절반의 모의 중독 중독과 Z &#39;팩터를 계산한다. Z &#39;= 1 - 3 * (높은 신호 제어 + 낮은 신호 제어의 SD의 SD가) / (높은 신호 제어의 의미 - 낮은 신호 제어의 평균). 스크리닝 데이터의 추가 분석을 위해, 플레이트에 기초 기본 원료 일부 파라미터 비교 판 사이 실험의 다른 일 사이 있도록 정상화. </li></ol></li><li> 쪼개짐 % = 100 % * (MEA : 전체 길이 SNAP-25 특이 적 항체에 의해 검출 (BACS)와 연관된 신호의 감소를 반영하는 분열의 퍼센트,높은 신호 제어 n 개의 강도 - 시료의 강도) / 고 신호 제어의 강도를 의미한다. </li><li> 분열의 억제 백분율 : 억제 % = 100 % * - / (- 낮은 신호 제어의 강도를 의미하는 높은 신호 제어의 강도를 의미) (샘플의 강도는 낮은 신호 제어의 강도를 의미한다). </li></ol>

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Krishna P Kota is an employee of Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, that produces instruments and software used in this manuscript. The content of this publication does not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Department of Health and Human Services, the U.S. Department of Defense, the U.S. Department of the Army, or the institutions and companies affiliated with the authors.

보툴리눔 신경 독소와 무기화의 상대적 용이성의 높은 효능 미국 질병 통제 예방 센터에 의해 분류 (가장 높은 우선 순위) biothreat 에이전트로서의 분류 가져왔다. 불행하게도 FDA는 독소는 운동 신경에 의해 내면화 된 후 본트 중독에 대응하기 위해 치료제를 승인하지 있습니다. 본트 중독에서 신경 세포의 회복을 촉진 모든 druggable 메커니즘이 생물학적 위협에 대한 군사 및 공공 모두를 보호하기 ...

박테리아 클로 스트 리듐 보툴리눔은 보툴리눔 신경 독소, 1 인간에게 알려진 가장 강력한 생물 독소 중 하나를 생성합니다. 7 별개의 본트 혈청 형 (본트 / AG)이 있습니다. 본트는 / A-담즙으로 인해 SNARE 복잡한 단백질 분해 2,3에 신경 근육 접합부에서 마비를 유도한다. SNARE 단백질 분해는 신경 전달 물질 소포 - 막 융합을 방지하고, 따라서 블록은 신경 전달 물질을 세포 외 유출 (4). 특정 SNARE 목표 중독 과정에 참여 본트 특정 혈청 형에 의존한다. 본트 / A 및 본트 / E 클리브 SNAP-25 본트 / C의 절단 모두 SNAP-25과 신택 5 반면. 또한 소포 관련 막 단백질 (VAMP)라고 나머지 혈청 형 절단하고 시냅 토브 레빈은 (. 본트 / A는 그것이 자연적으로 발생하는 보툴리누스 중독의 높은 비율에 대한 책임으로 분석 개발을위한 선택과 작은 분자의 작용 6. 개발의 가장 긴 기간을 가지고 있었다 본트 / A에 대한 치료제는 주요 목표이다우리의 약물 발견 및 프로그램은, 8-10은 활성 부위의 단백질 분해 효소 억제제 (7)를 식별하는 기존의 목표 기반의 방법을 이용했다. 그러나, 다수의 혈청 형과 노광 후 효능에 대해 넓은 스펙트럼의 활성을 갖는 활성 부위 억제제의 생성 가능성이 문제가 될 것이다. 따라서 우리는 본트 매개 운동 신경 중독을 차단할 수있는 작은 분자를 식별하는 기능을 엔드 포인트로 본트 SNAP-25의 절단을 사용하는 혁신적인 표현형 신약 개발 접근 방식을 구현했습니다. SNAP-25은 생체 내에서 마비와 치사의 예측이다 SNAP-25의 저하와 같은 신경 전달 물질의 방출이 필요합니다. 예를 들어, 세포 기반 스크리닝은 독소를 불 활성화 또는 표적 세포 내 독소 경로의 억제에 대한 책임 세포 요소의 새로운 변조기의 발견으로 이어질 수 있습니다. 표현형 분석 발달에 중요한 요인은 생리적으로 중요한 생물학적 모델의 선택이다. W전자 등은 SNAP-25 11 - 13의 발현을 포함한 일차 운동 신경 세포의 면역 학적 특성을 요점을 되풀이 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 유래 운동 신경을 설명했다. 중요한 것은, 이러한 셀룰러 시스템은 본트 / A 중독에 매우 민감하고 독소 11, 12의 농도 증가에 대한 응답으로 SNAP-25의 용량 의존적 분열을 보여줍니다. 차별화 운동 뉴런은 고 스루풋 플레이트 기반 분석 충분 셀룰러 분석법 어레이의 설계를 허용 양이 생산된다. 표현형 분석은 본트 / 마우스 운동 신경 문화의 중독시 내생 적으로 표현 된 전체 길이 SNAP-25의 분열을 정량화하는 두 가지 항체를 이용한 면역 형광 방법입니다. 단지 전체 길이 SNAP-25를 인식 카복실 말단 본트 / A 분열에 민감한 (BACS) 항체는 SNAP-25의 본트 / A 매개 단백질 분해의 평가를 할 수 있습니다마우스 모터의 발현은 10 뉴런. HCI 분석의 개략도는도 1에 도시된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:180px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:280px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Botulinum neurotoxin A&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Metabiologics</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;">No catalog number</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microtitre plates</td>
			<td style="width:180px;">Greiner&#160;</td>
			<td style="width:119px;">655946</td>
			<td style="width:280px;">Poly-D-Lysine 96-well plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BACs antibody</td>
			<td style="width:180px;">Lampire Biological</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microchem</td>
			<td style="width:180px;">National&#160;</td>
			<td style="width:119px;">0255</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Methanol</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A412-20</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:180px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28908</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Horse serum</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">16050</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">AJMDT01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Opera</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td>OP-QEHS-01</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">9002-93-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BIII tubulin antibody</td>
			<td style="width:180px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:119px;">BAM1195</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween 20</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P1379-1L</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342dye&#160;</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">3570</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antimouse IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A21236</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Anti rabbit IgG</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A10042</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Columbus Image analysis software</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 2.4</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Spotfire</td>
			<td style="width:180px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">Ver 5.5</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clorox bleach</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">18-861-284</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PlateStack</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high content imaging assay for identification of botulinum neurotoxin inhibitors

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.

높고 낮은 컨트롤의 데이터는 3 표준 편차 (그림 7A)를 초과하는 두 중간 값의 차이가 별개의 두 집단을 만들었습니다. 선별 과정의 목적은 샘플 모집단 (도 7b, (ⅰ)) 내의 정규 분포를 가정하여, 가까이 양성 대조군 인구 값 샘플 모집단 내의 화합물을 찾는 것이다. 평균 이상 3 표준 편차이다 데이터 포인트는 소음에서 통계적으로 다른 생각과 활성 &quot;히트&quot;로 분류된?...

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A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

보툴리눔 신경독 억제제의 식별을 위해 높은 콘텐츠 이미징 분석

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.5K 조회수.  Perkin Elmer Inc.. Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.

비디오: A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

An Organotypic Slice Assay for High-Resolution Time-Lapse Imaging of Neuronal Migration in the Postnatal Brain

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as well as differentiation and integration of new neurons into existing neural circuits. For postnatal neurogenesis in the olfactory bulbs, these events are segregated within three anatomically distinct domains: proliferation largely occurs in the subependymal zone (SEZ) of the lateral ventricles, migrating neuroblasts traverse through the rostral migratory stream (RMS), and new neurons differentiate and integrate within the olfactory bulbs (OB). The three domains serve as ideal platforms to study the cellular, molecular, and physiological mechanisms that regulate each of the biological events distinctly. This paper describes an organotypic slice assay optimized for postnatal brain tissue, in which the extracellular conditions closely mimic the in vivo environment for migrating neuroblasts. We show that our assay provides for uniform, oriented, and speedy movement of neuroblasts within the RMS. This assay will be highly suitable for the study of cell autonomous and non-autonomous regulation of neuronal migration by utilizing cross-transplantation approaches from mice on different genetic backgrounds.

This protocol describes an organotypic slice assay optimized for the postnatal brain and high-resolution time-lapse imaging of neuroblast migration in the rostral migratory stream.

출생 후의 두뇌에의 연결을 마이 그 레이션의 고해상도 시간 경과 이미징을위한 Organotypic 슬라이스 분석

Neurogenesis in the postnatal brain depends on maintenance of three biological events: proliferation of progenitor cells, migration of neuroblasts, as ...

연구

신경과학

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Isolation and Quantification of Botulinum Neurotoxin From Complex Matrices Using the BoTest Matrix Assays

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample testing. Rapid BoNT testing of foodstuffs is needed during outbreak forensics, patient diagnosis, and food safety testing while accurate potency testing is required for BoNT-based drug product manufacturing and patient safety. The widely used mouse bioassay for BoNT testing is highly sensitive but lacks the precision and throughput needed for rapid and routine BoNT testing. Furthermore, the bioassay&#39;s use of animals has resulted in calls by drug product regulatory authorities and animal-rights proponents in the US and abroad to replace the mouse bioassay for BoNT testing. Several in vitro replacement assays have been developed that work well with purified BoNT in simple buffers, but most have not been shown to be applicable to testing in highly complex matrices. Here, a protocol for the detection of BoNT in complex matrices using the BoTest Matrix assays is presented. The assay consists of three parts: The first part involves preparation of the samples for testing, the second part is an immunoprecipitation step using anti-BoNT antibody-coated paramagnetic beads to purify BoNT from the matrix, and the third part quantifies the isolated BoNT&#39;s proteolytic activity using a fluorogenic reporter. The protocol is written for high throughput testing in 96-well plates using both liquid and solid matrices and requires about 2 hr of manual preparation with total assay times of 4-26 hr depending on the sample type, toxin load, and desired sensitivity. Data are presented for BoNT/A testing with phosphate-buffered saline, a drug product, culture supernatant, 2% milk, and fresh tomatoes and includes discussion of critical parameters for assay success.

The BoTest Matrix botulinum neurotoxin (BoNT) detection assays rapidly purify and quantify BoNT from a range of sample matrices.&#160;Here, we present a protocol for the detection and quantification of BoNT from both solid and liquid matrices and demonstrate the assay with BOTOX, tomatoes, and milk.

BoTest 매트릭스 분석 실험을 사용하여 복잡한 매트릭스에서 분리 및 보툴리눔 신경 독소의 정량화

Accurate detection and quantification of botulinum neurotoxin (BoNT) in complex matrices is required for pharmaceutical, environmental, and food sample ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has been heavily studied. While many imaging studies treat the hippocampus as a single unitary neuroanatomical structure, it is, in fact, composed of several subfields that have a complex three-dimensional geometry. As such, it is known that these subfields perform specialized functions and are differentially affected through the course of different disease states. Magnetic resonance (MR) imaging can be used as a powerful tool to interrogate the morphology of the hippocampus and its subfields. Many groups use advanced imaging software and hardware (&#62;3T) to image the subfields; however this type of technology may not be readily available in most research and clinical imaging centers. To address this need, this manuscript provides a detailed step-by-step protocol for segmenting the full anterior-posterior length of the hippocampus and its subfields: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus (DG), strata radiatum/lacunosum/moleculare (SR/SL/SM), and subiculum. This protocol has been applied to five subjects (3F, 2M; age 29-57, avg. 37). Protocol reliability is assessed by resegmenting either the right or left hippocampus of each subject and computing the overlap using the Dice&#39;s kappa metric. Mean Dice&#39;s kappa (range) across the five subjects are: whole hippocampus, 0.91 (0.90-0.92); CA1, 0.78 (0.77-0.79); CA2/CA3, 0.64 (0.56-0.73); CA4/dentate gyrus, 0.83 (0.81-0.85); strata radiatum/lacunosum/moleculare, 0.71 (0.68-0.73); and subiculum 0.75 (0.72-0.78). The segmentation protocol presented here provides other laboratories with a reliable method to study the hippocampus and hippocampal subfields in vivo using commonly available MR tools.

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

The goal of this manuscript is to study the hippocampus and hippocampal subfields using MRI. The manuscript describes a protocol for segmenting the hippocampus and five hippocampal substructures: cornu ammonis (CA) 1, CA2/CA3, CA4/dentate gyrus, strata radiatum/lacunosum/moleculare, and subiculum.

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

비 침습적 실질, 혈관 및 대사 고주파 초음파 및 광 음향 쥐 뇌 심부 이미징

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of structural MRI in vivo is ultimately limited by physiological noise, including pulsation, respiration and head movement. Although imaging hardware continues to improve, it is still difficult to resolve structures on the millimeter scale. For example, the primary visual sensory pathways synapse at the lateral geniculate nucleus (LGN), a visual relay and control nucleus in the thalamus that normally is organized into six interleaved monocular layers. Neuroimaging studies have not been able to reliably distinguish these layers due their small size that are less than 1 mm thick.
The resolving limit of structural MRI, in a postmortem brain was tested using multiple images averaged over a long duration (~24 h). The purpose was to test whether it was possible to resolve the individual layers of the LGN in the absence of physiological noise. A proton density (PD)1 weighted pulse sequence was used with varying resolution and other parameters to determine the minimum number of images necessary to be registered and averaged to reliably distinguish the LGN and other subcortical regions. The results were also compared to images acquired in living human brains. In vivo subjects were scanned in order to determine the additional effects of physiological noise on the minimum number of PD scans needed to differentiate subcortical structures, useful in clinical applications.

High-resolution Structural Magnetic Resonance Imaging of the Human Subcortex In Vivo and Postmortem

Here we present a protocol to determine the minimum number images that needed to be registered and averaged to resolve subcortical structures and test whether the individual layers of the LGN could be resolved in the absence of physiological noise.

인간 Subcortex의 고해상도 구조 자기 공명 영상<I&gt; 생체</I&gt; 및 사후

The focus of this study was to test the resolution limits of structural MRI of a postmortem brain compared to living human brains. The resolution of ...

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other neurological diseases at an increasing speed. However, little is known about the molecular mechanisms that underlie these disorders. The genetic, molecular, and behavioral toolbox of Drosophila melanogaster makes this model organism particularly useful to characterize new disease genes and mechanisms in a high-throughput manner. Nevertheless, high-throughput screens require efficient and reliable assays that, ideally, are cost-effective and allow for the automatized quantification of traits relevant to these disorders. The island assay is a cost-effective and easily set-up method to evaluate Drosophila locomotor behavior. In this assay, flies are thrown onto a platform from a fixed height. This induces an innate motor response that enables the flies to escape from the platform within seconds. At present, quantitative analyses of filmed island assays are done manually, which is a laborious undertaking, particularly when performing large screens.
This manuscript describes the &#34;Drosophila Island Assay&#34; and &#34;Island Assay Analysis&#34; algorithms for&#160;high-throughput, automated data processing and quantification of island assay data. In the setup, a simple webcam connected to a laptop collects an image series of the platform while the assay is performed. The &#34;Drosophila Island Assay&#34; algorithm developed for the open-source software Fiji processes these image series and quantifies, for each experimental condition, the number of flies on the platform over time. The &#34;Island Assay Analysis&#34; script, compatible with the free software R, was developed to automatically process the obtained data and to calculate whether treatments/genotypes are statistically different. This greatly improves the efficiency of the island assay and makes it a powerful readout for basic locomotion and flight behavior. It can thus be applied to large screens investigating fly locomotor ability, Drosophila models of movement disorders, and drug efficacy.

High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay

The island assay is a relatively new, cost-effective assay that can be used to evaluate the basic locomotor behavior of Drosophila melanogaster. This manuscript describes algorithms for automatic data processing and objective quantification of island assay data, making this assay a sensitive, high-throughput readout for large genetic or pharmacological screens.

Drosophila 섬 분석 결과에서 운전 행동의 높은 처리량 분석

Advances in next-generation sequencing technologies contribute to the identification of (candidate) disease genes for movement disorders and other ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.