우리는 그들의 전문적인 물고기 케어 멜리사 그리핀과 제나 Rozacky 감사합니다. PDM 감사 EGN 지원, 관용과 인내를 작성. 이 작품은 JKE에 NIH / NIDCR R01DE020884에 의해 지원되었다.

1. 축산 및 돌연변이 대립 유전자 <ol><li> (21) 기술로 제브라 피쉬를 올리고 번식. </li><li> 본 연구에서 사용 된 제브라 피쉬의 돌연변이 대립 유전자는 16 b1059 smad5 B1100 (22)와, SMO의 b577 23 PDGFRA했다. 이 zebrafish의 변종에 대한 소스는 ZIRC 있습니다. </li></ol> 2. 솔루션 및 도구의 준비 참고 : 모든 솔루션과 구현이 사전에 향후 사용을 위해 저장 될 수있다. <ol><li> 이전 21 설명한 바와 같이 배아 미디어 (EM)을 확인합니다. </li><li> 4g / L MS-222 (Tricaine)을 확인합니다. 450 ㎖의 멸균 물에 4g의 나트륨 인산염 (Na 2 HPO 4)을 녹입니다. 솔루션에 2g MS-222를 추가합니다. 7.0-7.2 내에서의 pH를 조정합니다. 500 ml의 총 부피에 멸균 물을 추가합니다. </li><li> 선택 사항 : 4g / L 정향 오일을 확인합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 0.2 g의 순수한 정향 오일의 무게를. 50 ㎖의 총 부피에 EM을 추가합니다. 4 ℃에서 보관 </li><li> 3 % methylcellulo을그 자체. 종기에 EM + 0.1 M HEPES 50 ㎖를 가져옵니다. 열에서 제거. 용액이 균질 할 때까지 1.5 g의 메틸 저어. 4 ℃에서 보관 </li><li> 0.2 % 아가로 오스를 확인합니다. 50 ㎖의 EM 0.1 g 아가로 오스를 추가합니다. 전자 레인지 나 핫 플레이트에 종기에 EM을 가져오고 아가로 오스가 용해되어 있는지 확인합니다. 4 ° C에서의 microcentrifuge 튜브 및 저장소에 500 μL의 볼륨으로 나누어지는 주의 : 필요에 따라 볼륨이 조절 될 수있다. </li><li> 모세관 부지깽이를 확인합니다. 0.9 mm의 ID 모세관 내부의 최고 접착제 한 방울을 넣습니다. 라인 약 3 ~ 4 MM은 튜브의 끝을지나 확장되도록 모세관 내부 6파운드 테스트 모노 필라멘트 낚시 줄의 4-5 cm 길이를 삽입합니다. </li><li> 표본 당 두 개의 다리를 커버 슬립을 확인합니다. 중간 자유를 떠나 24 X 60-1 커버 유리의 각 끝에 슈퍼 접착제 22 X 22-1 커버 유리. 오래된 일 미만의 배아를위한 싱글 (​​끝 당 1 작은 커버 유리를) 확인 1 ~ 4 D는 태아를 위해 (끝마다 서로의 상단에 2 개의 작은 커버 유리) 두 배배아 오일 또는 그 이상 오래 AYS, 또는 트리플 (끝마다 서로의 상단에 3 작은 커버 유리). </li><li> 고진공 그리스와 10 ML의 주사기를 채우십시오. 참고 : 진공 그리스는 오랜 기간 동안 표본의 탈수를 방지하기 위해 밀봉 역할을, 그리고 더 많은 휘발성 실란트에 비해 독성에 대한 낮은 가능성이있다. </li></ol> 3. 공 초점 현미경에 대한 설치 제브라 피쉬 배아 (그림 1 참조) <ol><li> 마취 매체를 준비합니다. 완전히 액체까지 20 초 간격으로 레인지 작동으로 0.2 % 아가로 오스 나누어지는 용융. 0.2 % 아가로 오스의 195 μL에 0.2 % 아가로 오스, 4 G / L 정향 오일의 5 μL의 192 μL로 MS-222의 8 μl를 섞는다. 42 ° C에서 가열 블록에 유지합니다. 참고 : MS-222에 긴 노출이 배아 제브라 피쉬 (24)에서와 정향의 기름보다 강한 발달 지연의 원인이됩니다. </li><li> 필요한 경우 수동으로 부화 형질 전환 배아 직전에 분석을 분석 할 dechorionate. 집게를 사용하여, 천천히 TE배아가 해제 될 때까지 개방 융모막 아칸소. </li><li> 제브라 피쉬 배아를 마취. MS-222 배아 매체의 ML 24의 4 G / L 주식의 1 ML을 추가합니다. 또한, 물고기, 물 (24) 24 ㎖를 4 G / L 정향 오일의 390 μl를 추가합니다. 참고 : 정향 오일의 역할은 천천히 그렇게 시간 경과 현미경 전에 적어도 15 ~ 20 분을이 단계를 수행합니다. </li><li> 위로 향하는 다리를 커버 슬립의 중심 공간 주위에 진공 그리스의 구슬을 놓습니다. 천천히 및 교량 및 커버 슬립의 가장자리 안쪽에 인접 부드럽고 연속 구슬 만들기, 주사기 밖으로 진공 그리스를 밀어 넣습니다. </li><li> 나무 주걱을 사용하여 다리를 커버 슬립의 중간에 4 % 메틸 셀룰로오스의 원을 확산. </li><li> 이미지에 표시 할 배아를 전송합니다. 배아가 마취되면 유리 피펫에를 그립니다. 배아는 펫에서 액체의 바닥에 가라 앉을 수 있도록 수직으로 펫을 잡고. 아가로 오스 용액에 피펫을 이동하고 배아 드롭 할 수아가로 오스에. 액체를 추방하지 마십시오. </li><li> 표본을 놓습니다. 피펫에 약간의 아가로 오스 솔루션과 배아를 그립니다. 메틸 위에 아가로 오스 솔루션의 드롭에 배아를 추방. 메틸에 아래쪽으로 배아를 밀어 이미징 원하는대로 배아 방향을 모세관 포커를 사용합니다. </li><li> 시료를 밀봉. <ol><li> 아래로 향하도록 장착 된 하나의 상단에 하나의 다리를 커버 슬립을 놓습니다. 다리가 모두 커버 슬립에 직접 연락 아가로 오스 드롭 씰을 만들 때까지 끼워 커버 슬립의 양쪽에 일정한 압력을 적용합니다. 배아가 제대로 지향되어 있는지 확인합니다. </li><li> 진공 그리스 구슬에 균열과 틈새를 부드럽게하는 유리를 따라 나무 주걱을 문질러. 가장자리에서 여분의 기름을 닦아. </li></ol></li></ol> 4. 형질 전환 제브라 피쉬 배아의 시간 경과 공 촛점 이미징 (이 프로토콜은 혈구 LSM 710 공 초점 현미경 우리에게 최적화되어 있습니다ZEN 이미징 소프트웨어를 보내고, 다른 시스템에 사용하기 위해 수정할 수 있습니다.) <ol><li> 장비를 활성화합니다. 공 초점 현미경을하고 있으며, 외부의 레이저 장치의 전원을 켭니다. 공 초점 현미경에 연결된 컴퓨터의 전원을 켜십시오. 열기 공 촛점 이미징 소프트웨어 및 이미지 수집 컨트롤을 활성화하기 위해 &quot;시작 시스템&quot;을 선택합니다. </li><li> 가열 단계를 준비​​합니다. 공 초점 현미경의 준비 플랫폼을 낮추고 위치 밖으로 대물 렌즈를 이동합니다. 전자 가열 단계로 기본 단계를 교체합니다. 가열 단계에 대한 컨트롤러의 전원을 켜고 29.5 ° C의 온도를 설정 </li><li> 보기의 분야에서 시료를 배치합니다. 무대에 탑재 된 표본을 놓습니다. 위치로 20X 대물 렌즈를 이동하고 준비 플랫폼을 올립니다. 가시 광선 에미 터를 활성화하고 접안 렌즈를 통해보고. 시야에서 태아의 머리를 가운데. </li><li> 실험 설정을 정의합니다. <ol><li> 선택하여 형광 채널을 활성화감지 할 수있는 형광 파장은 각 채널의 색상 룩업 테이블 (LUT)을 선택합니다. 필요한 경우, 필요한 레이저 (RFP에 대한 예를 들어, 561 nm의)에 설정하는 소프트웨어에서 수동 제어를 사용합니다. 각각의 형광 채널에 대해, 10.0 레이저 강도와 600 ~ 700 사이의 광전자 증 배관 전압 (HV 또는 이득)을 설정합니다. 4 평균 비트와 16 비트의 비트 심도를 설정합니다. </li><li> Z-스택과 시간 시리즈 모듈을 활성화합니다. 5 ㎛ 이하 Z-해상도 핀홀을 설정하고 제안 된 최적의 거리 Z-간격을 설정합니다. 주 : 일반적으로 5 μm의 Z-Z 해상도는 각 스택에 대한 이미지가 충분히 빠르게 수집 할 수 있도록하는 개별 세포를 확인하는 동안 특정 시점에서 배아의 &quot;스냅 샷&quot;. 평균화를 낮추면 이미지 당 시간의 양을 감소시킨다. </li><li> 이미지 사이의 원하는 시간 간격 (일반적으로 10 ~ 20 분) 및 실험의 전체 길이를 정의. </li></ol></li><li> 위치 설정정보. <ol><li> 라이브 모드로 카메라의 전원을 켜십시오. 초점을 조정하고 필요한 경우 형광을 볼 레이저 강도를 증가시킨다. 원하는 경우, 넓은보기에 대해 0.6 디지털 줌을 설정합니다. </li><li> 관심의 모든 구조를 볼 수 있습니다 있도록 무대를 배치하고 전방 가지 등쪽과에 대한 시야의 여지가있다. 형광의 상한과 하한을 통해 배아 초점. 첫 번째와 마지막 Z-스택 슬라이스 위치 이러한 제한을 넘어 적어도 100 μm의 이상을 설정합니다. </li></ol></li><li> 형광 강도를 최적화합니다. <ol><li> 표시를 범위로 표시 LUT를 설정합니다. 형광 구조는 이제 흰색 표시해야하고, 시야의 나머지 (무 검출) 파란색 또는 검정색이어야한다. </li><li> 단지 포화 곳 아래 수준으로 HV / 이득을 증가 (빨강) 픽셀이 나타납니다. 필요한 경우, 그래서 배경의 대부분이 (파란색) 검출되지 오프셋 조정합니다. 참고 : 작은 구멍 직경 증가 레이저 강도를 이미지 데프 모두 개선inition 있지만, 레이저의 강도는 조직 생활을 유지하기 위해 낮게 유지해야합니다. 증가 HV / 이득과 작은 구멍 직경 (&lt;5 μm의)는 일반적으로 증가 레이저 강도에 바람직하다. </li><li> 충분히 넓은 4 세트의 평균을, 적시에 이미지를 수집하기 위해 작은 구멍 직경을 유지합니다. Z-간격은 항상 핀홀 직경 제시된 최적의 거리로 설정되어야한다. 다른 설정으로 짧은 검사 (평균 = 1)을 수행하고, 원하는 해상도를 달성 최소 레이저 강도를 사용합니다. </li></ol></li><li> 원하는 시간에 대한 실험을 실행합니다. 그 후, 가열 단계에서 배아를 제거하고 천천히 커버 슬립을 분리합니다. 30mm 페트리 접시에 EM의 커버 슬립과 배아 잠수함. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 커버 슬립 떨어져 배아를 씻어 페트리 접시에서 coverslip을 제거합니다. 지속적으로 개발하는 28.5 ° C의 배양기에 배아를 놓습니다. </li><li> 성장을 비교. 실험의 끝에, 개별 ZS 걸릴유사 실험의 시작 부분에 시편에 개최하지만, 한 아가로 오스 장착 형제 배아의 압정 이미지는 28.5 ° C 배양기에서 EM에 제기되었다. </li><li> 필요에 따라 인두 아치를 측정한다. 측정은 일부 촛점 스위트 소프트웨어에서 수행 될 수있다. 여기에서 찾을 측정은 각각의 프레임. LSM 파일을 가져 오기 및 Z-투영하여 Fiji25를 사용하여 수행 하였다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

시간 경과 공 초점 현미경 개발의 분석을위한 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 신경 능선 세포 레이블 유전자 변형을 사용하여 중요한 신호 전달 경로에 대한 돌연변이 있습니다 제브라 피쉬에서 인두 아치 형태 형성을 연구하는 방법의 유용성을 보여줍니다. 조직 수준뿐만 아니라 시간 경과 분석도 휴대 규모 28에서 분석에 적용, 분석한다. 대부분의 널리 사용되는 제브라 피쉬의 방법?...

두개 안면 형태 형성은 여러 세포 유형 간의 상호 협조를 필요로 복잡한 다단계 과정이다. 두개 안면 골격의 대부분은 신경 능선 세포에서 파생되는 많은 인두 아치 1이라는 일시적인 구조로 지느러미 신경 튜브에서 마이그레이션해야합니다. 많은 조직과 같이, 두개 안면 골격 형태 형성의 발달은 특정 시점에서 배아의 정적 이미지에 의해 이해 될 수있는 것보다 더 복잡하다. 그것은 시간이 많이 걸리는 수행 할 수 있지만, 생체 시간 경과 현미경은 배아의 세포와 조직에서 연속보기를 제공합니다. 시간 경과 시리즈의 각 이미지는 다른 사람에게 컨텍스트를 준다, 그리고 현상이 발생하는 이유를 추론보다는 그 시간에 발생하는 것을 추론을 향한 구도자 이동하는 데 도움이됩니다. 생체 내 이미징에 따라서에 실험적인 접근을위한 강력한 설명 도구입니다형태 형성을 안내 경로를 해체. 제브라 다니오의 rerio는 척추 동물의 배아 발달의 인기 유전 모델이며, 특히 형태 형성의 생체 내 이미징에 적합합니다. 현대, 형질 전환 게놈 수정을위한 편리한 방법은 빠르게 제브라 피쉬 연구원에 사용할 수있는 도구의 수를 진행하고 있습니다. 이 도구는 유전자 조작과 현미경 이미 강력한 방법을 향상시킬 수 있습니다. 거의 모든 원하는 유전 적 맥락에서 거의 모든 조직의 생체 내 이미징은 환상보다 현실에 더 가깝다. 인두 아치의 형태 형성 운동은 신경 능선과 인접한 상피, 외배엽 모두 내배엽 사이의 상호 작용을 신호에 의해 유도된다. 두개 안면 골격 요소의 형태 형성을 구동하는 데 필요한 상피 세포에 의해 표현 된 다양한 신호 분자가있다. 이러한 신호 분자 중, 소닉 더 헤지 호그 (쉬) 매우 중요 F입니다또는 두개 안면 개발 2-8. 쉿은 구강 외배엽 및 인두 내배엽 2,6,9,10 모두에 의해 표현된다. 내배엽에서 쉬의 표정은 아치 (10), 아치 (10) 내의 신경 문장의 패턴, 그리고 두개 안면 골격 (11)의 성장의 형태 형성의 움직임을 조절한다. BMP 신호는 두개 안면 개발 (12)에 대한 매우 중요합니다 및 인두 아치의 형태 형성을 변경할 수 있습니다. BMP 신호는 인두 아치 13, 14 내 문장의 지느러미 / 복부 패턴을 조절한다. 제브라 피쉬의 smad5의 중단은 심각한 구개 결함과 중간 선 (15)에 적절하게 융합하는 메켈의 연골의 오류가 발생합니다. 또한 돌연변이는 또한 2 차, 3 차 및 중앙선에 15 융합 때때로 제 4 인두 아치 요소 복측 연골 성분의 감소 및 융합을 표시. 이러한 융합은 강력하게 된 BMP 신호 전달이 인두 요소의 형태 형성을 지시하는 것이 좋습니다. PDGF 신호는 두개 안면 발전을 위해 필요하지만, 인두 아치 형태 형성에 알 수없는 역할을 가지고 있습니다. 마우스와 제브라 피쉬 PDGFRA 돌연변이는 모두 깊은 midfacial clefting 16-18있다. 적어도 제브라 피쉬이 midfacial clefting 적절한 신경 능선 세포의 이동 (16)의 실패에 기인한다. 신경 능선 세포들은 인두 아치를 입력 한 후 PDGFRA을 표현하기 위해 계속합니다. 또한, PDGF 리간드는 얼굴 상피 세포에 의해 표현되고, 인두 아치 16,19,20에서, 따라서 PDGF 신호는 마이그레이션 다음 인두 아치의 형태 형성에 중요한 역할을 할 수있다. 그러나, PDGFRA 돌연변이의 인두 아치 수행되지 않은의 형태 형성의 분석. 여기, 우리는 pharyngul의 생체 공 초점 현미경에 보여단 형질 전환 제브라 피쉬와이 기간 내에 인두 아치의 형태 형성을 설명합니다. 우리는 더 BMP, PDGF, 그리고 쉬의 신호 전달 경로를 방해 돌연변이에 의해 영향을받는 조직의 행동을 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="837">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">6 lb. test monofilament line</td>
			<td style="width:189px;">Cortland Line Company</td>
			<td style="width:185px;">SLB16</td>
			<td style="width:220px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Agarose I</td>
			<td style="width:189px;">Amresco</td>
			<td style="width:185px;">0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Argon laser</td>
			<td style="width:189px;">LASOS Lasertechnik GmbH</td>
			<td style="width:185px;">LGN 3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Capillary tubing, 100 mm, 0.9 mm ID</td>
			<td style="width:189px;">FHC</td>
			<td style="width:185px;">30-31-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Clove oil</td>
			<td style="width:189px;">Hilltech Canada, Inc.</td>
			<td style="width:185px;">HB-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:189px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:185px;">2021846-0807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Isotemp dry-bath incubator</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">2050FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Laser scanning microscope</td>
			<td style="width:189px;">Carl Zeiss AG</td>
			<td style="width:185px;">LSM 710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium sulfate hexahydrate</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 22x22-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Microscope cover glass, 24x60-1</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">12-545-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:189px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">M-11624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:189px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TempController 2000-2</td>
			<td style="width:189px;">PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tricaine-S</td>
			<td style="width:189px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:185px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing craniofacial morphogenesis in zebrafish using 4d confocal microscopy

시간 경과 영상은 형태 형성의 과정을 직접 관찰 할 수있는 기술, 또는 모양의 세대입니다. 때문에 광학적 선명도와 유전자 조작에 복종 할 의무에, 제브라 피쉬 배아는 살아있는 배아에서 형태 형성의 시간 경과 분석을 수행 할 수있는 인기 모델 생물이되고있다. 라이브 제브라 피쉬 배아의 공 촛점 이미징은 그 조직이 지속적으로 같은 유전자 또는 주입 염료로, 형광 마커로 표시되어 있어야합니다. 프로세스는 배아 마취 건강한 발달이 정상적으로 진행되는 방식으로 제 위치에 유지되는 것을 요구한다. 이미징을위한 매개 변수에는 다음과 같은 세 가지 차원의 성장을 고려하여 개발의 빠른 스냅 샷을 가져 오는 동안 개별 셀 해결의 요구에 균형을 설정해야합니다. 우리의 결과는 형광 표지 된 제브라 피쉬 배아의 생체 촬상있는 장기를 수행하고있는 다양한 조직 행동을 검출하는 능력을 입증두개 안면 기형을 일으키는 원인이되는 뇌 신경 능선. 마취 및 장착으로 인한 개발 지연을 최소화하고, 배아는 프로세스에 의해 무사히입니다. 시간 경과 이미징 배아는 개발 이후 지점에서 액체 배지로 돌아 왔고, 이후 몇 군데 또는 고정 할 수 있습니다. 형질 전환 제브라 피쉬 라인과 잘 특성화 운명 매핑 및 이식 기술, 영상의 증가 풍부한 원하는 조직이 가능합니다. 따라서, 생체 내 이미징의 시간 경과가 돌연변이 및 미세 주입 배아의 분석을 포함하여 제브라 피쉬의 유전 적 방법으로 강력하게 결합한다.

주동이의 방향 (동영상 1)에서 이동하는 동안 야생 형 배아에서 신경 능선 인구 다음, 인두 아치 전방 / 후방 및 지느러미 / 복부 축을 따라 연장. 30시간 포스트 수정 (HPF)에서, 제 인두 아치의 전방 / 후방의 길이는 1.8-1.9 배 지느러미 / 복부 높이 사이입니다. 지느러미 / 복부 신장 빠른 36.5 HPF까지 전방 / 후방 연장보다 꾸준히 진행된다. 여기에서, 지느러미 / 복부 높이의 고원 약 104 μm?...

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Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K 조회수.  The University of Texas at Austin.  시간 경과 공 촛점 이미징은 배아 발달의 특성에 유용한 강력한 기술이다. 여기에서, 우리는 방법을 설명하고 두개 안면 야생 형에서 형태 형성뿐만 아니라 PDGFRA, smad5 및 SMO 돌연변이 배아를 특징. 

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

연구

생물학

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Craniofacial Mesenchyme의 Electroporation

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial for homeostatic control of physiological processes that include: protein, DNA and RNA synthesis, vesicular trafficking, cell growth and cell division. Alterations in cellular pH homeostasis can lead to detrimental functional changes and promote progression of various diseases2. Various methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of pH in the cytoplasm and in organelles. Here, we describe in detail a rapid and accurate method for the simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH by using confocal microscopy on living cells3. This goal is achieved with the use of two pH-sensing ratiometric dyes that possess selective cellular compartment partitioning. For instance, SNARF-1 is compartmentalized inside the cytoplasm whereas HPTS is compartmentalized inside endosomal/lysosomal organelles. Although HPTS is commonly used as a cytoplasmic pH indicator, this dye can specifically label vesicles along the endosomal-lysosomal pathway after being taken up by pinocytosis3,4. Using these pH-sensing probes, it is possible to simultaneously measure pH within the endocytic and cytoplasmic compartments. The optimal excitation wavelength of HPTS varies depending on the pH while for SNARF-1, it is the optimal emission wavelength that varies. Following loading with SNARF-1 and HPTS, cells are cultured in different pH-calibrated solutions to construct a pH standard curve for each probe. Cell imaging by confocal microscopy allows elimination of artifacts and background noise. Because of the spectral properties of HPTS, this probe is better suited for measurement of the mildly acidic endosomal compartment or to demonstrate alkalinization of the endosomal/lysosomal organelles. This method simplifies data analysis, improves accuracy of pH measurements and can be used to address fundamental questions related to pH modulation during cell responses to external challenges.

Several methods are available for measuring intracellular pH but very few of these allow simultaneous measurement of cytoplasmic and organellar pH. Here, we describe in detail a rapid and accurate methodology to simultaneously measure cytoplasmic and vesicular pH by ratiometric imaging of living cells.

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

효모의 4D 현미경 검사법

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are strategically interposed in the path of the lymphatic vessels, allowing intimate contact of tissue antigens with all resident immune cells in the LN. Thus, understanding the cellular composition, distribution, location and interaction using ex vivo whole LN imaging will add to the knowledge on how the body coordinates local and systemic immune responses. This protocol shows an ex vivo imaging strategy following an in vivo administration of fluorescent-labeled antibodies that allows a very reproducible and easy-to-perform methodology by using conventional confocal microscopes and stock reagents. Through subcutaneous injection of antibodies, it is possible to label different cell populations in draining LNs without affecting tissue structures that can be potentially damaged by a conventional immunofluorescence microscopy technique.

This protocol describes a technique to image different cell populations in draining lymph nodes without alterations in the organ structure.

전 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 림프절 구조 및 세포 국소화 시각화

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &amp;#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...