이 방법은 신경 전구 세포의 역학과 척추 동물 뇌 발달의 기초가되는 그들의 자손에 대한 근본적인 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 발달의 많은 시간 동안 살아있는 두뇌 내의 복제 관련 세포의 다중 클러스터를 직접 시각화하는 기능입니다. 프로토콜은 또한 제브라피시 태아의 그밖 개발 체계에 있는 복제및 전구역학을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다.
이 방법을 사용한 시각화는 신경 발달 중에 발생하는 기본 프로세스를 직접 관찰하는 데 특히 유용합니다. 마이크로 주사를 수행하기 전에 오후에, 섹스 분리 결합 탱크에 야생 유형 성인 제브라피시를 설정합니다. 다음날 아침 원고 방향에 따라 DNA 용액을 준비하고 수정 45분 이내에 이 용액의 약 4.2 나노 리터를 한 세포 제브라피시 배아에 주입한다.
E 3 배지와 섭씨 28도의 주입된 배아를 24시간 동안 유지한 다음 그룹에서 죽은 배아와 변형된 배아를 호출합니다. 최대 20개의 건강한 배아를 50밀리리터 튜브로 옮기고, 10밀리리터의 E 3를 채우고 각 튜브 위에 캡을 놓습니다. 50 밀리리터 튜브가 있는 랙을 섭씨 37도의 수조에 80~90분 동안 똑바로 세우고 욕조의 수위가 튜브의 E 3보다 높은지 확인합니다.
수조에서 튜브 랙을 제거하고 섭씨 28도 인큐베이터에 놓습니다. E 3가 식히고 배아가 온도로 재적응할 수 있도록 최대 1시간까지 허용하십시오. 그런 다음 0.2 밀리머 PTU와 E 3이 섭씨 28도 인큐베이터에서 따뜻하게 유지된 페트리 요리로 옮깁니다.
열 충격 후 2 ~ 4 시간에서, 성공적인 Brainbow 재조합을 나타내는 CFP 또는 YFP의 발현을 위한 표준 형광 해부 현미경의 밑에 배아를 검사합니다. 전체적으로 강력한 FP 발현을 가진 배아를 선택하고 PTU를 사용하여 별도의 접시로 옮깁니다. 1일, 2일 또는 3일 후에 수정을 이미지합니다.
형광 현미경의 밑에 희미한 나타나는 발현은 실제로 응초점 시간 경과 화상 진찰에서 잘 시각화될 수 있습니다. 실험의 날 전에, 이미징 챔버 및 배아 조작 도구를 준비합니다. 이미징 챔버를 준비하려면 플라스틱 링을 60mm 페트리 접시의 중앙에 조심스럽게 대접하십시오.
4 인치 나무 면봉 스틱의 끝에 나일론 낚시 라인의 작은 길이를 슈퍼 접착제로 조작기를 구성합니다. 필요한 경우 장착하기 전에 해부 현미경으로 배아를 비초합니다. 배아를 장착하려면, 이미징 챔버에서 플라스틱 링의 중심으로 물고기를 전송하고 미세 팁 전송 파이펫으로 가능한 한 많은 초과 E 세를 제거합니다.
깨끗한 이송 파이펫을 사용하여 물고기를 1% 낮은 녹인 아가로즈와 E 3로 덮어 플라스틱 링 전체를 아가로즈 층으로 채웁니다. 그런 다음 배아를 파이펫 팁으로 부드럽게 당기고 기포를 도입하지 않고 아가로즈로 돌아갑니다. 배아 조작기를 사용하여 물고기와 아가로즈가 굳어지기 전에 빠르게 방향을 지정합니다.
똑바로 현미경으로 이미징하는 경우, 가능한 한 아가로즈의 상부 표면에 가까운 배아를 배치, 그들은 바로 자신의 꼬리와 이미징 챔버의 바닥에 평행 있는지 확인. 아가로즈가 굳어질 때까지 기다린 다음 이미징 챔버를 E 3로 채우고 이미징 과정을 통해 증발을 고려하도록 가능한 한 많이 추가하십시오. 공초점 현미경에 물고기와 E 3와 이미징 챔버를 배치합니다.
그런 다음 높은 숫자 조리개와 긴 작업 거리로 목표를 선택합니다. 셀의 밀도가 높고 밝은 라벨이 있는 영역을 찾아 수집 매개 변수를 설정합니다. 이것은 Zen 소프트웨어를 사용하는 예이지만 사용 가능한 현미경 및 레이저 라인에 따라 설정이 달라집니다.
세 트랙을 준비하여 각 FP 채널을 순차적으로 이미지화합니다. 아르곤 레이저를 사용하여 514 나노미터에서 458 나노미터및 YFP에서 CFP를 자극하고 DPSS 561 나노미터 레이저를 사용하여 dTomato을 흥분시킵니다. 적절한 파장에서 세 가지 임무를 수집합니다.
이미지에 Z 스택 범위를 선택하고 10~30분 사이의 시간 간격을 선택하여 미토틱 및 석면 이벤트를 추적합니다. 마지막으로 이미징 세션의 길이를 선택하고 실험을 실행합니다. 이미징이 완료된 후, 피지와 호환되는 Zen 또는 다른 형식을 사용하는 경우 원시 데이터를 CZI 형식으로 저장한 다음 바이오 포맷 수입업체를 사용하여 이미지를 피지로 가져옵니다.
생체 내 다색 타임랩스 이미징은 개발 제브라피시 힌드뇌의 증식 심실 영역에서 세포의 Brainbow 색상 코딩 클론을 보여주기 위해 사용되었다. Brainbow 표지 된 세포는 같은 색상을 공유 하는 특정 방사형 섬유를 따라 배열. 이는 상대RGB 채널 가중치로 정량화될 수 있습니다.
이것은 이 라디오 단이 세포를 분할의 클론이고 그들의 유사한 색깔이 복제관련인 것으로 그(것)들을 확인하기 위하여 이용될 수 있었다는 것을 건의합니다. 정량적 색 분석은 딸 세포가 어머니의 세포와 같은 색깔을 표현하는 것을 보여주었습니다. 그러나 세포의 이웃 무선 클러스터는 서로 구별 될 수있다.
관련 세포의 수많은 클론은 생체 내 시간 동안 동시에 추적될 수 있어 멀티플렉스 계보 분석 및 비교를 가능하게 합니다. 2일 클론에서 색표현의 정량화는 3일 후에 다시 수정한 후 Brainbow 표현이 2~3일 동안 상대적으로 일정한 것으로 나타났다. 시간 경과 화상 진찰은 1에서 2 일 후에 비옥한 후에 간 동역학 핵 이동 및 세포 분열을 겪고 있는 수많은 세포를 밝혔습니다, 세포 주기를 공부하는 가능하게 합니다.
8.4시간의 평균 세포 주기가 제브라피시의 이전 측정과 비교할 수 있는 계산되었습니다. 더욱이, 이 화상 진찰 기술은 막 출혈 및 세포 단편화와 같은 세포 분열과 같은 세포 세포가 세포 분열과 관련되었던 고정관적인 형태학적 변화를 겪고 있는 개별 세포를 관찰하기 위하여 이용되었습니다. 이 방법은 생체 내에서 수행되기 때문에, 제브라피쉬는 이미징 챔버에서 구출되고 나중에 이미징 또는 기타 실험을 위해 유지될 수 있다.
이 기술의 사용은 우리가 신경 발달 도중 복제 관련 세포의 역할에 관하여 새로운 질문을 탐구하는 것을 허용합니다.
