저자는 이러한 기술 개발을 도왔 우리 실험실의 과거와 현재 회원을 감사드립니다. 일부 자금은 재생 의료 / CIRM (RN1-00538)에 대한 캘리포니아 연구소에서 부여로 DE 제공.

1. Zebrafish의 축산, 배아의 생성 및 처리 <ol><li> 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의지도하에 및 NIH 또는 기타 규제 기관 / 지침의 동물 관리 가이드 라인에 다음과 같은 제브라 피쉬 프로토콜을 실시한다. </li><li> 특정 조직, 세포 또는 장기에 형광 단백질을 표현 제브라 피쉬 균주 Zebrafish의 국제 자원 센터 (ZIRC)에서 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Tg는 (KDR : EGPF)는이 프로토콜에서와 같이 완전한 3D 혈관 구조를 제조하는데 사용될 수 혈관 내피 세포를 06 일에서 EGFP를 표현 S843. 형질 전환 제브라 피쉬의 다른 라인은 ZIRC에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 산도, 염도, 온도, 용존 산소, 빛, 및 기타 환경 요인에 7을 모니터링 적절한 양식 시스템에서의 주택 성인 제브라 피쉬. 여기에 표시된 제브라 피쉬는 14 시간 LIG와 28.5 ° C에서 Aquaneering 주식 시스템 (샌디에고, CA)에 보관 하였다ht/10 시간 어두운주기. 성인 제브라 피쉬에게 소금물 새우와 NRD 4 / 6 물고기 음식 (소금물 새우 직접 오그 던, 유타)의 균형 잡힌 식단을 공급. </li><li> 성인 남성과 번식 연령의 여성 제브라 피쉬는 짝짓기에 성공 높이기 위해 별도로 보관해야합니다. </li><li> 함께 계란을 통해 가을에 충분히 큰 구멍이 메쉬 바닥이 결합 용기에 여성 (2-4)과 남성 (4-6)를 배치하여 달걀 누워 및 수정을 자극하지만, 너무 작은 제브라 피쉬 성인이 합격을위한 . 전에 저녁이 교배를 설정; 계란은 낮의 빛을주기 천천히 강도 (새벽)에 증가 일반적으로있는 동안, 새벽 근처에 배치됩니다. 결합 용기의 바닥 모든 15 ~ 30 분 계란을 확인합니다. </li><li> E3 버퍼 (5 ​​mM의 염화나트륨, 0.17 밀리미터의 KCl, 0.33 mM의 염화칼슘, 0.33 mM의 망초)과 메쉬 스트레이너 청소를 사용하여 계란을 수집합니다. 28 ° C 배양기에서 E3 버퍼와 상점으로 가득 100mm 배양 접시에 계란을 전송합니다. </li><li> CER을 변경 화학 물질을 연구하는ebrovascular 원하는 화학 물질의 농도를 추가 분파. 예를 들어 neovasular 분기는 24를 시작 γ-세 크레타 제 억제제를 DMSO 4 가용화 (GSI IX/DAPT/N- [N-(3,5 - Difluorophenacetyl-L-알라 닐)]-S-phenylglycinet-부틸 에스테르)로 유도 될 수있다 시간 포스트 수정 (HPF). 그 때 점 배아에서 융모막에서 여전히 많은 화학 물질은 8 통과 할 수있다. 처리 조건은 융모막의 무료 휴식 배아의 능력을 손상시킬 신경 모터 효과를 가지고 있다면, 배아는 프로 나제 (2)의 어느 겸자로 수행 될 수있다 (24) 및 HPF (48) 사이에서 디 chorionated한다. 제공되는 이미지에 표시된 태아 부드럽게 두 날카롭게 집게로 융모막을 잡아 열어 찢어 dechorionated했다. </li><li> 필요하다면 / 소망, 색소 형성은 HPF (24)에서 E3 버퍼에 0.003 % N-Phenylthiourea (PTU)를 첨가함으로써 억제 할 수있다. </li></ol> 뇌 혈관 구조체 2. 공 촛점 이미징고정 제브라 피쉬 배아에 URES <ol><li> 250 ㎎ / L의 Tricaine 메탄의 배아를 희생하고 2 침지하여이를 수정 - 4 ℃에서 하룻밤 4 % 파라 포름 알데히드 형광 태아가 들어있는 용기는 호일에 싸여되어야한다. 이미지가 될 때까지 한 번 고정, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야합니다 - EGFP 형광 강도는 약 일주일 후 작은 해결이됩니다 만, 형태는 (시야에서 볼 때) 훨씬 오래 유지됩니다. </li><li> 먼저 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 하나의 눈을 제거하여 배아를 탑재 할 준비를합니다. 눈을 연결 조직 주위에 잘라 먼저 근육을 절단하고, 마지막으로 눈을 치환하는 시신경을 절단. (참고 : 양쪽 결상 원하는 경우 제거 두 눈을.) </li><li> 눈을 제거한 후에, 3 % 메틸 셀룰로오스의 방울을 사용 커버 글라스에 배아 마운트. 제거 된 눈을 가진면이 커버 글라스에 직면하고 가능한 한 유리에 가깝게되도록 배아의 방향. 메틸로 전체 배아를 커버이미징 동안 건조를 방지하기 위해 lcellulose. </li><li> 이미지 즉시 고품질 20X 플랜 아포 목적 (개구 = 0.75 이상)을 탑재 반전 공 촛점 현미경을 사용하여 장착 배아. 이 구성은 두 개의 유리 평면 사이 배아를 협지하고, 전면 글라스에 대해 배아를 가압 필요 비 반전 현미경 것이 바람직하다. </li><li> 중간 또는 큰 조리개 설정을 사용하여 1 μm의 단위로 광 조각을 수집합니다. 2.5 μM의 확대 단계가 또한 사용될 수 있지만, 그것은 작은 물체의 공간적 순서를 결정하는 것이 더 어려울 수있다. 작은 구멍이 선명한 디테일을 생산하지만, 필요 이상 검사는 EGFP 표백도 얻을 수있는 배아로 영상의 깊이를 제한 할 수 있습니다. 공 초점 현미경은 배아를 통해 절반 방법에 대한 영상을 허용합니다. </li><li> 전체 물고기의 영상을 원하는 경우, (단계 3.2의 주 참조) 처음에 두 눈을 제거, 걸 보면 후 배아를 회전반대편 2.5 - G 한쪽 반복 2.3 단계를 반복합니다. </li></ol> 배아 Zebrafish의 Cerebrovasculature 3. 3D 재건 <ol><li> 무료, 3D 렌더링에 최적화 및 PC, Mac 및 Linux 컴퓨터와 호환되는 오픈 소스 ImageJ에의 피지 분포 3 (http://fiji.sc)를 사용합니다. </li><li> 플러그인&gt; 궤적&gt; BioFormats 가져 오기 (9)는 다음, 니콘 스택 (그림 2A)에 대한 예를 들어 name.ids를 공 초점 파일을 선택 이동하여 피지로 가져 오기 공 초점 스택. 분할 채널을 확인, 자동 설정을 확인, 그레이 스케일 : Hyperstack, 컬러 모드와보기 스택을 선택합니다. </li><li> 이러한 선택은 네 개의 개별 채널 패널을 엽니 다; EGFP에 대해 하나는 일반적으로 세 번째 다운을 필요합니다. C = 1 (그림 2A) 다음에 긴 이름을 가진 16 비트 이미지를 떠나 다른 세 개의 패널 (빨강, 파랑 및 알파)를 닫습니다. </li><li> 이미지가 스크롤을 따 사용하지만 스캔하여 임계 값을 조정B 관심 영역 또는 구조를 가지고 조각을 찾기 위해 하단에 다음 (그림 2C)&gt; 임계 값을 조정합니다&gt; 이미지로 이동합니다. </li><li> 등장 패널의 구조는 배경에 아주 잘 볼 수 있도록 왼쪽 상단 바 (블랙 레벨)를 밀어하고 (그림 2D)입니다 하단 슬라이드 (화이트 레벨)을 둡니다. B &amp; W를 선택, 어두운 배경을 선택합니다. 다른 조정이 각 조각에, 검정색 배경을 선택해야하지 않는 한 각 이미지에 대한 계산 임계 값을 선택하지 마십시오. 이 과정은 새로운 8 비트 이미지를 생성합니다. </li><li> 경고 임계 값은 취소 또는 저장 ImageJ에있는, 그래서 공 초점 스택은 변경이 필요할 때마다 다시로드해야합니다 수 없습니다. 숫자를 기록하고 원하는 결과를 얻을 때까지 다른 설정을 시도해보십시오. </li><li> 요인 1 (최상) 또는 2 (좋은)을 재 샘플링, 플러그인&gt; 3D 뷰어&gt; 임계 값을 0으로 이동, 녹색 3D 출력을 할 수있는 빨간색과 파란색 색상 상자의 선택을 취소합니다 - 그렇지 않으면 위스콘신LL 흰색 렌더링을 생성 - (자동) (그림 2E) 적용을 선택합니다. </li><li> 회전, 스핀과 마우스와 키보드 컨트롤 (그림 2F)를 사용하여 3D 이미지를 확대. </li><li> 메뉴에서 캡처 옵션을 사용하여 어느 지점에서 정지 영상을 저장합니다. 화면에 이미지 상자의 크기는 생성 된 이미지의 픽셀 사이즈를 지시하므로 고해상도 화상 메이크 오른쪽 하단 모서리를 끌어 상자가 확대를 원하는 경우. </li><li> 보기&gt; 기록 360 ℃의 회전 (그림 2G)를 선택하여 회전하는 3D 영화를 만들 수 있습니다. 단계 당 2도까지 회전 기본적으로,하지만 훨씬 작은 파일 크기를 생성합니다 예를 들어 5도에 변경 될 수 있지만, 애니메이션에 경련을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 나중에, 미디어 플레이어로 볼 수 인터넷에 업로드하거나, 파워 포인트 프레 젠 테이션에 사용하기위한 몇 가지 가능한 형식 중 하나에 파일을 저장합니다. 오픈 소스 미디어 플레이어, VLC ( <a href="http://www.videolan.org/vlc/index.html">HT</a>) :/ / www.videolan.org / VLC / index.html을 TP, 무료로 아주 잘 이러한 동영상을 처리합니다. </li></ol>

<ol>
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공개 아무것도 없다.

여기에서 설명하는 방법은 zebrafish의 개발에 혈관 시스템의 시각적 인 연구를위한 기초를 제공한다. 고정 된 샘플은 고해상도 촛점 촬상. 초파리 및 C. 위해 사용될 수있는 반면 라이브 시험편, 심박수 및 심장 박출량과 같은 생리 학적 파라미터를 평가하기 위해 사용될 수있다 엘레 전신 영상을 허용하지만, 제브라 피쉬는 척추 동물이며, 내피 세포가 늘어선 관 시스템을 포함한 척추 동물의 조직에 대한 유용한 모델을 제공합니다. 이러한 연구는 제브라 피쉬 연구 공동체에서 중요한 유전자 변형 라인과 게놈 자원을 통합 할 수 있습니다. 3D 재구성 및 배아 제브라 피쉬에서 공 촛점 이미지의 렌더링, 여기에 설명 된대로, 혈관 분기와 같은 쥐와 생쥐와 같은 큰 동물 모델을 할 수없는 혈관의 밀도에 시스템 생물학의 접근을 허용. 또한, 제브라 피쉬가 수정 환경 (E3 버퍼)에서 개발 양막 류 (amniotes)로, 어디 하나는 쉽게 C를 추가 할 수 있습니다혈관 발달에 영향을 미치는 특정 효소 나 다른 프로세스를 억제 hemicals. 화학 약품 이송의 농도 및 타이밍은 연구원 미세 조정 처리 조건을 가능하게 변경 될 수있다. 1. 수정 및 문제 해결 이 시스템에 대한 수정 사항은 조직, 기관 또는 지역 특정 패턴 (10)의 다양한 EGFP 또는 다른 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 제브라 피쉬의 라인을 통합 할 수 있습니다. 또한, zebrafish의 망막 신생 혈관의 변화의 분석은 최근 5를 발표하고있다. 이전의 배아와 성인 제브라 피쉬의 착색 문제는 규모 안료 또​​는 망막 색소를 생성하지 않는 유전자 변형 라인과 교차에 의해 보상 될 수있다. 감소 된 형광 문제는 일반적으로 부적절한 고정 조건에서 발생합니다. 1 일 동안 파라 포름 알데히드 (4 %)이 최적입니다 만 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde), 오스뮴 또는 알코올 등의 강한 고정 제는, 5 월EGFP 형광을 파괴한다. 고정 후, 배아는 4 ° C에서 PBS에 보관해야하고 항상 직사광선으로부터 보호. 이 기술의 2. 제한 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 3D 렌더링의 품질과 해상도는 생성 된 이미지의 품질에 따라 달라집니다. 이러한 배아를 통해 빛의 침투는 표준 공 초점 현미경을 사용하여 중간 시상면으로 제한됩니다. 영상의이 부분은 이전의 배아와 성인 영상의 깊이를 제한하지만, 더 진보 된 다 광자 현미경 시스템은 깊은 수심에서 이미징 할 수 있습니다. 기존의 방법에 대하여 3. 의미 이 프로토콜은 전체 동물을 통합 할 수있는 시스템 레벨에서의 혈관 망의 분석 방법을 제공한다. 이러한 데이터의 이전 표현은 종종 함께 배치 일련의 이미지에 의존하지만, 3D 렌더링 공간 상대적으로 더 나은 해상도를 제공합니다참여 tionships. 4. 미래의 응용 프로그램 이미징 및 조직 처리의 새로운 발전은 이전의 배아 또는 성인 투명 11-14을 만드는 포함 할 수있는 방법에 대한 많은 새로운 응용 프로그램을 제공 할 것입니다. 향상된 투명성이 크게 공 초점 및 다중 광자 레이저로 조직의 침투를 증가시킬 것이다. 또한, 카메라 및 광전자 증 배관 튜브의 속도로 빨리 분석의 네 번째 차원을 제공하는 실시간 물고기의 3D 렌더링을 생성하는 것이 가능할 수도 증가한다. 5. 중요한 단계 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 고정을 포함 이미징을위한 준비입니다. 영상은 사용할 수있는 최고의 숫자 구멍이 높은 품질의 목표에 고정 후 가능한 한 빨리 수행해야합니다. 해상도 사용한 촬상 시스템에 달려 있으므로 고품질의 시스템은 일반적으로 더 낫다. 3D 렌더링을 생성하면 메모리를 많이 사용메모리와 좋은 그래픽 프로세서의 다량 때문에 새로운 하이 엔드 컴퓨터를 권장합니다. 이들 방법은 신경, 근육, 동맥 또는 임의의 수의 개체군에서 GFP 또는 다른 형광 단백질을 표현 형질 전환 배아에 적용 할 수 있지만 여기에 기재된 시각 생물학 시스템은, 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬 위해 최적화 된 다른 세포. 이 시스템으로 작업의 가장 큰 장점은 고정 및 / 또는 살아있는 동물에서,이 발달 기간 동안 언제든지 전체 배아에서 무슨 일이 일어나고 있는지 연구 할 수있는 기능입니다.

제브라 피쉬는 발달 생물학을 연구 할 수있는 강력한 시스템을 제공하고, 그들의 태아의 상대적인 투명성 영상 기반 연구 1 의무이다. 제브라 피쉬는 이제 수십 년 동안 척추 동물의 개발을위한 모델로 사용되어왔다. 제브라 피쉬를 포함 Teleosts는 무척추 동물에 적당한 동체가없는 단순화 된 척추 혈관 시스템이 있습니다. 혈액이 산소를 함유 아가미를 통해 두 챔버 마음의 전방 펌핑된다. 아가미에서 피가 등쪽 대동맥에 수렴하고 더 작은 혈관에 동맥 분기, 장기 조직에 결국 도달하는 모세 혈관을 통과한다. 모세관 산소 이내에 해제되고 이산화탄소가 흡수된다. 모세 혈관의 정맥 측에 피가 더 큰 혈관에 흐르고 마침내 사이클이 반복 심장의 후방 챔버로 유입된다. 성인 제브라 피쉬는 한 번에 200 개 이상의 알을 낳기 및 ONC 수전자가 수정 된, 그들은 신속하게 2를 개발. 하루 만에 몸의 축이 아니라 융모 막 내부에 주변의 배아를 이동 계약과 근육을 포함하여, 개발되고있다. 2-7일에서 포스트 수정 (DPF)는 대부분의 신체 시스템은 눈과 식품 안쪽 또는 바깥쪽으로 밝은 빛에서 수영을 조정할 수있는 중추 신경계를 포함하여, 개발. 최대 7 DPF의 배아는 현미경과 시각화 수 있도록 충분히 작은 수 있습니다. 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 라인은 공 촛점 또는 형광 현미경으로 몇 군데 있습니다. 공 촛점 이미징은 혈관 개발의 시스템 생물학의 관점을 제공 제브라 피쉬 배아에 완전한 혈관 구조의 3 차원 렌더링을 만들 수있는 오픈 소스 소프트웨어 3와 결합 할 수 있습니다. 그것은 혈관 네트워크 4,5의 시스템 수준의 분석을 허용하는 혈관과 뇌 혈관 복잡성의 변화와 관련된 연구는이 프로토콜에서 도움이 될 것입니다. 방법과 자원의 컴파일이 제공됩니다배아 제브라 피쉬의 혈관 구조의 영상을 필요로 연구에 쉽게 채택 및 이러한 기술을 허용하는 D. 동물 모델로서 지브라 피쉬의 비용 효율은 척추 동물 발달 및 항상성 분자 경로의 혈관 신생 효과를 평가와 새로운 플랫폼을 제공하기 위해 새로운 이미징 기술들과 결합된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="889">
	<tbody>
		<tr>
			<td>N &#8211; Phenylthiourea&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, catalog #41972</td>
			<td></td>
			<td>0.2 M in E3 buffer, kept at 4oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>D-EclipseC1 on a Nikon TE-2000U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Mat-Tek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSI IX/DAPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycinet-butyl ester EMD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates&#160;</td>
			<td>Becton-Dickinson, cat# 351147</td>
			<td></td>
			<td>BD Falcon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>VWR,&#160; cat #414004-001</td>
			<td></td>
			<td>VWR disposable transfer pipets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-cellulose&#160;</td>
			<td>Alfa Aesar, cat#43146</td>
			<td></td>
			<td>3% in E3 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRD 4/6 Fish food&#160;</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Dried</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp</td>
			<td>Brine Shrimp Direct</td>
			<td></td>
			<td>Live</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten wire&#160;</td>
			<td>Small Parts # TW-016-60</td>
			<td></td>
			<td>0.016&#8221; OD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>VWR # 101107-950</td>
			<td></td>
			<td>Tricaine methanesulfonate 250 mg/L in E3 buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging and 3d reconstruction of cerebrovascular structures in embryonic zebrafish

제브라 피쉬는 생체 내에서 발생 생물학 및 병리학을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다. 작은 크기와 제브라 피쉬 배아의 상대적으로 투명성이 심장과 혈관의 개발과 같은 프로세스의 시각적 심사에 특히 유용합니다. 최근의 여러 연구에서 혈관 내피 세포에서 EGFP를 표현 형질 전환 지브라 피쉬는 화상에 사용하고, 공 초점 현미경을 사용하여, 뇌 및 망막 혈관 복잡한 네트워크를 분석한다. 설명은, 준비 치료 및 이미지 강화 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 표현하는 제브라 피쉬 배아를 한 다음 뇌 혈관 시스템의 종합적인 3D 렌더링을 생성하기 위해 제공됩니다. 프로토콜은 배아의 처리, 공 촛점 이미징 및 EGFP 형광을 유지 고정 프로토콜 (가) 있습니다. 또한, 이러한 손상 근처의 신경 조직을 제거하지 않고 눈과 같은 뇌 혈관 구조의 고품질 이미지를 구하는 방법에 대한 유용한 정보가 제공됩니다. 잠재적 인 함정공 촛점 이미징은 자유롭게 사용할 수있는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 공 초점 이미지 스택에서 3D 복원을 생성하는 데 필요한 단계와 함께 설명합니다.

혈관 구조의 3 차원 재구성은 제브라 피쉬 개발의 포괄적이고 시각적으로 흥미로운 관점을 제공합니다. 그들은 일반적으로 수행으로 1, 2는 방법을 도시한다. 그림 3은 내피 세포에서 EGFP을 표현 제브라 피쉬 배아 DPF 6 혈관 구조의 여러 각도를 보여줍니다. 단색 녹색 또는 흰색 색상으로 신호 강도를 평가하기가 어려울 수 있습니다; 의사 색상은 룩업 테이블에서 이미지 강도를 제공하고 구조가 겹치는 경우에 더 깊이 인식 할 수 있습니다. 소재 맥관의 의사 - 컬러 3D 화상의 예 6 지브라 피쉬는도 4에 제공된다 DPF. 살아있는 배아의 형광 이미징은 눈 및 신체 움직임을 포함 생리적 특성을 연구하기 위해 이용 될 수 있으며, 심장 활동. 3,4 피규어 형질 전환 제브라 피쉬 줄을 사용하여, 이러한 방법으로 얻은 대표적인 결과를 보여<html> 설명. 이미징 분해능 현미경 특성에 따라 다르지만, EGFP 신호의 밝기는 대부분의 상용 시스템과 양호한 화질 충분하다. 3D 표현의 재건 및 렌더링은 일관성이 오픈 소스 소프트웨어 내 옵션은 지속적으로 좋은 결과를 제공합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig1highres.jpg" width="600" /> 그림 1. 눈 제거. A) 텅스텐 필요없이 고정 세 DPF 배아는 눈 옆에 위치. 조직이)이 위치. B에서 눈 주위를 잘라 눈이가 빠지고 기본 안구 근육과 시신경이 절단된다. 빈 눈구멍은 점선 원으로 표시됩니다. C) 같은 배아 인계 및 메틸 셀룰로오스와 함께 장착되어, 최대 직면하고있는 그대로 눈으로.<html> hres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig2highres.jpg" width="600" /> 그림 2. 단계별 공 초점 이미지 스택의 3D 재건. A) 관심 영역으로 조각을 찾은 후. B)을 선택 플러그인&gt; 궤적&gt; Bioformat를 사용하여 피지 내에로드 파일 열기 (4104.1.ids), 임계 값 조정이 표시. C)로 선택 임계 값은 최고를 사용하여 (214)에 조정 슬라이더 적용이 선택됩니다. 같이 D) 3D 뷰어가 호출됩니다. E) 3 차원 재구성이 방향의 경우 그대로 눈을 가진 제브라 피쉬,. F) 이미지를 확대합니다. G) 360도 회전 동영상을 회전 한으로 표시됩니다 도시 된 바와 같이 이루어진다.<html> res.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg" width="600" /> 그림 3. 3D 재건의 전망. A) 10 배 목적으로 이미지화 6 DPF 배아의 내측 관점, 입이 오른쪽에, 입안하지 아가미. B 동일한 배아의) 측면, 주 지느러미 중간에 루프입니다. 20 배 목적으로 몇 군데 C) 같은 배아, 20 배 목표 영상의 중간 관점, 주 아가미 해상도. D) 측면 관점. 핀이 패널의 오른쪽 가장자리에 있습니다. 20 배 목적 영상의 E) 전후면 중간보기, 오른쪽에 20 배 목표, 머리 그것으로 몇 군데 같은 태아의 입 안에 주 아가미. F) 복부. 오른쪽 아래에 난황에 혈관을합니다.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" width="600" /> 신호 강도에 대한 사색의 룩업 테이블을 사용하여 6 DPF 재건의 6 DPF의 배아 그림 4. 강도의 차이는. 이미지. 입, 뇌, 아가미 및 난황이 방향에 표시되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50417/50417fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still.jpg" width="500" /> 4 DPF의 제브라 피쉬의 재구성 혈관 시스템의 그림 5. 영화. 물고기는 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 이미지가 있었다배아의 절반을 이미징. 그림 6에서 제공하는 GSI 처리 된 제브라 피쉬의 구조와 혈관 구조를 비교. 머리에 혈관의 밀도가 낮은 큰 아가미합니다. (다운로드 아래에있는 &quot;Zfish_spin.avi&quot;보충 파일을 참조하십시오) <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50417/Zfish_still1.jpg" width="500" /> 그림 6. 4 DPF에서 GSI 처리 된 배아의 혈관 시스템의 3D 영화. 물고기는 중간 선에 측면에서 통해 2.5 μm의에서 몇 군데 있었다. 그림 5와 같이 물고기 DPF 제어 4 혈관 구조를 비교. 아치형 다시 작은 크기는이 화학 물질로 처리 된 배아에서 전형적인이다. (다운로드 아래에있는 &quot;GSI-treated_4dpf_fish.avi&quot;보충 파일을 참조하십시오)

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Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.7K 조회수.  Western University of Health Sciences.  애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다. 

비디오: Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

연구

생물학

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Microdissection of Zebrafish Embryonic Eye Tissues

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post fertilization (dpf), the larvae will show the first visual response. Many genes have been identified to control a proper eye development, but we are far from a complete understanding of the underlying genetic architecture. Whole genome gene expression profiling is a useful tool to elucidate genetic regulatory network for eye development. However, the small size of the embryonic eye in zebrafish makes it challenging to obtain intact and pure eye tissues for expression analysis. For example, the anterior-posterior length of the eye between day 2 and 3 is only approximately 200-300 &mu;m, while the diameter of the lens is less 100 &mu;m. Also, the retinal pigment epithelium (RPE) underlying the retina is just a single-layer epithelium. While gene expression profiles can be obtained from the whole embryo, they do not accurately represent the expression of these tissues. Therefore pure tissue must be obtained for a successful gene expression profiling of eye development. To address this issue, we have developed an approach to microdissect intact retina and retina with RPE attached from 1-3 dpf, which cover major stages of eye morphogenesis. All procedures can be done with fine forceps and general laboratory supplies under standard stereomicroscopes. For retinal dissection, the single-layer RPE is removed and peeled off by brushing action and the preferential adherence of the RPE remnants to the surface of the culture plate for dissection. For RPE-attached retinal dissection, the adherence of RPE to the dissection plate is removed before the dissection so that the RPE can be completely preserved with the retina. A careful lifting action of this tissue can efficiently separate the presumptive choroid and sclera. The lens can be removed in both cases by a chemically etched tungsten needle. In short, our approach can obtain intact eye tissues and has been successfully utilized to study tissue-specific expression profiles of zebrafish retina1, 2 and retinal pigment epithelium3.

This article describes an approach to microdissect zebrafish retinas with and without retinal pigment epithelium attached, from one to three days postfertilization embryos.

Zebrafish 배아 눈 조직의 Microdissection

Zebrafish is a popular animal model for research on eye development because of its rapid ex utero development and good fecundity. By 3 days post ...

Immunostaining of Dissected Zebrafish Embryonic Heart

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology and genetics 1,2. About 100-200 embryos are readily available every week from a single pair of adult fish. The transparent embryos that develop ex utero make them ideal for assessing cardiac defects 3. The expression of any gene can be manipulated via morpholino technology or RNA injection 4. Moreover, forward genetic screens have already generated a list of mutants that affect different perspectives of cardiogenesis 5. 
Whole mount immunostaining is an important technique in this animal model to reveal the expression pattern of the targeted protein to a particular tissue 6. However, high resolution images that can reveal cellular or subcellular structures have been difficult, mainly due to the physical location of the heart and the poor penetration of the antibodies. 
 Here, we present a method to address these bottlenecks by dissecting heart first and then conducting the staining process on the surface of a microscope slide. To prevent the loss of small heart samples and to facilitate solution handling, we restricted the heart samples within a circle on the surface of the microscope slides drawn by an immEdge pen. After the staining, the fluorescence signals can be directly observed by a compound microscope. 
Our new method significantly improves the penetration for antibodies, since a heart from an embryonic fish only consists of few cell layers. High quality images from intact hearts can be obtained within a much reduced procession time for zebrafish embryos aged from day 2 to day 6. Our method can be potentially extended to stain other organs dissected from either zebrafish or other small animals.

A rapid way to conduct immunostaining of zebrafish embryonic heart is described. Compared to the whole mount immunostaining approach, this method dramatically increases the penetration of the antibodies, which allows obtaining high resolution images that reveal cellular/subcellular structures in the heart within a much reduced processing time.

해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

Zebrafish embryo becomes a popular in vivo vertebrate model for studying cardiac development and human heart diseases due to its advantageous embryology ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

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The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in transfected human embryonic kidney-293 (HEK) cells following stimulation with angiotensin II (Ang II). HEK cells are transiently transfected with plasmid DNA containing AT1aR tagged with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Lysosomes are identified with a red fluorescent dye. Live-cell images are captured on a laser scanning confocal microscope after Ang II stimulation and analyzed by software in three dimensions (3D, voxels) over time. Live-cell imaging enables investigations into receptor trafficking and avoids confounds associated with fixation, and in particular, the loss or artefactual displacement of EGFP-tagged membrane receptors. Thus, as individual cells are tracked through time, the subcellular localization of receptors can be imaged and measured. Images must be acquired sufficiently rapidly to capture rapid vesicle movement. Yet, at faster imaging speeds, the number of photons collected is reduced. Compromises must also be made in the selection of imaging parameters like voxel size in order to gain imaging speed. Significant applications of live-cell imaging are to study protein trafficking, migration, proliferation, cell cycle, apoptosis, autophagy and protein-protein interaction and dynamics, to name but a few.

Here we present a protocol to image cells expressing green fluorescent protein-tagged angiotensin type 1a receptors during endocytosis initiated by angiotensin II treatment. This technique includes labeling lysosomes with a second fluorescent marker, and then utilizing software to analyze the co-localization of receptor and lysosome in three dimensions over time.