저자는 Armenise ​​하버드 재단, 마리 퀴리 트렌 티노 COFUND (ACS), 트 렌토 (Ecomm)의 자치 지방과 자금 CIBIO을 인정합니다.

1. DNA 템플릿을 준비 <ol><li> E.의 표준 실험실 균주에서 플라스미드 정제 같은 E. 등의 대장균, 대장균 DH5a 또는 상용 키트와 함께 노바 블루. 또한, 선형 PCR 제품은 유사 상용 키트로 정제 할 수있다. 단지 H 2 O와 DNA를 용출. </li><li> 페놀 - 클로로포름은 DNA 솔루션에게 26의 압축을 풉니 다. </li><li> UV 흡광도 또는 다른 적당한 방법으로 예를 들어 DNA 농도 및 순도를 결정합니다. 그것은 전사 번역 효율을 위해 고순도의 DNA를 사용하는 것이 중요합니다. </li></ol> 2. 얇은 지질막을 준비 <ol><li> 건조한 지질 분말 무게를 용매에 용해. 1 파르 미트-2-oleoyl-SN-팔미-3-포스 포 콜린 (POPC)의 주식 솔루션은 40 mg / ml의 농도로 클로로포름에 준비가되어 있습니다. 주 : 유기 용제는 항상 유리 피펫 및 병 처리해야합니다. 즉, 플라스틱을 사용해서는 안됩니다. 스토어의바람직 아르곤 하에서 -20 ° C에서 밀폐, 용매 저항 호박색 유리 병에 똑딱 솔루션. </li><li> 5 ML 둥근 바닥 플라스크에 나누어지는 12 μmol의 POPC (40 MG / ML 주식 솔루션의 220 μL). </li><li> 얇은 지질막을 생성하는 회전 증발기 (그림 1) 용매를 증발. <ol><li> 안전하게 원형 클립 증류 관에 둥근 바닥 플라스크를 연결하고 플라스크의 회전을 시작합니다. </li><li> 콘덴서 코일을 통해 물의 순환을 시작합니다. 클로로포름 61.2의 낮은 비등점 ° C 대기압에서을 가지고 있기 때문에 열 목욕을 사용하여 필요하지 않습니다. </li><li> 시스템이 마개가 열려 있는지 확인하여 대기로 열려 있는지 확인합니다. 진공 펌프의 전원을 켜고 천천히 시스템에 진공을 적용 꼭지를 닫습니다. </li><li> 얇은 지질 필름은 불투명 필름을 형성하는 회전 증발하는 동안 둥근 바닥 플라스크의 벽에 증착그 눈으로 볼 수 있습니다. 회전 증발 0.5-2 시간 동안 계속하자. 프로세스를 중지하려면, 천천히, 진공 압력을 해제 회전을 중지하고 둥근 바닥 플라스크를 제거합니다. </li></ol></li></ol> 3. 지질 부유 및 소포 균질화 <ol><li> 직접 둥근 바닥 플라스크에 얇은 지질막에 1 ML 18.2 MΩ H 2 O를 추가합니다. 최대 속도 적극적으로 소용돌이 솔루션, 약 3,200 rpm으로, 지질 영화는 눈으로 관찰되는 유리에서 분리 될 때까지. </li><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브에 지방 분산을 전송합니다. </li><li> 셋업 링 5 개 mm 팁 균질화를 개최하라. 안전하게 지방 분산을 보유하는 균질 아래의 microcentrifuge 스탠드를 놓습니다. 18.2 MΩ H 2 O의 끝을 담그고 몇 초 동안 실행하여 균질의 분산 요소를 씻어. </li><li> 일을 보장 지질 분산에 직접 분산 요소를 배치끝에서 microcentrifuge 관의 바닥에 접촉하지 않습니다. 전력 레벨 4 이상 14,000 rpm에서 1 분간 균질화. </li></ol> 4. 소포 압출 및 동결 건조 <ol><li> 외부 케이싱으로 구성되어 미니 압출기 (그림 2), 두 개의 테플론 내부 막 지원, 두 개의 O-링, 하나의 테프론 베어링을 전시 리테이너 너트의 부품을 조립. <ol><li> 내부 막 지지대 홈에 두 개의 O-링을 놓습니다. Prewet 2 개의 필터 한 400 nm의 막. 필터는 그들 사이의 막으로 O-링의 안쪽에 테플론에 배치됩니다. </li><li> 막 O-링 사이에 두 개의 필터로 둘러싸인 막 압출기 외부 케이스에 지원 놓습니다. 케이스 내부에 테프론 베어링을 배치하고 고정 너트를 부착하고 손으로 조입니다. </li></ol></li><li> 두 주사기를 씻어 18.2 MΩ 물을 채운다. 작은 시간에 주사기 바늘을 삽입압출기 어셈블리의 양쪽 끝에 테프론 oles. 바늘은 쉽게 미끄러 져한다 바늘을 강요하지 않습니다. 압출기 하우징과 착용에 주사기와 압출기를 고정합니다. </li><li> 천천히 한 주사기의 출력 및 기타에 물을 밀어 압출기를 통해 물을 전달합니다. 이것은 하나의 흐름을 나타냅니다. 현재의 누출이없는 것을 보장 세 구절의 총 반복합니다. 물이 주사기를 제거하고 물을 폐기하십시오. </li><li> 샘플 하나의 주사기를 작성하여 압출기에 연결하고 위의 단계 4.3에서 설명한대로 천천히 세포막을 통해 소포 솔루션을 전달합니다. 11 구절의 총 배 반복합니다. 압출 공정의 진행으로, 샘플은 덜 혼탁하고 막을 가로 질러 밀어 쉽게 될 것입니다. 저항의 급격한 감소는, 그러나, 일반적으로 막의 파열을 나타냅니다. </li><li> 압출 소포 솔루션을 전송하고의 microcentrifuge 튜브에 소포의 40 μL 분주합니다.플래시 드라이 아이스하거나 또는 액체 질소에 각각 나누어지는을 동결. </li><li> 30에서 하룻밤 원심 증발기 ° C. 각 나누어지는 냉동 건조 -20 ℃에서 동결 건조 된 빈 소포를 저장 </li></ol> 5. 전사 - 번역 기계 캡슐 <ol><li> 전사 - 번역 반응의 구성 요소를 믹스의 RNase 억제제의 20 단위를 추가합니다. 얼음에 품어. </li><li> DNA 템플릿을 추가합니다. 제어 반응, 250 플라스미드 인코딩 mVenus의 NG 또는 T7 전사 프로모터 뒤에 비슷한 형광 단백질과 강한 E. 대장균 리보솜 결합 부위가 권장됩니다. </li><li> RNase가없는 물과 최종 부피 25 μL를 가져옵니다. </li><li> 단계 5.3에서 조립 반응 10 μL와 동결 건조 된 소포의 수화물 나누어지는 (단계 4.6). 간단히 소용돌이는 혼합물은 소포가 재현 탁 할 때까지. 이 미만 30 초를 취해야한다. </li><li> 3 얼음에 반응을 품다0 분 소포가 팽창 할 수 있도록합니다. </li><li> 50 MM 트리스 - 염산, 50 mM의 NaCl을, 산도 7.4의 27.0 μL 20.2 밀리그램 / ML proteinase를 K. DNase의와 RNA 분해 효소 1.5 μL로 소포의 1.5 μl를 추가하여 30 μL의 최종 볼륨 20 배 소포 혼합물을 희석 단백질 분해 효소 K에 대한 대안 extravesicular 자료를 저하로이 단계에서 추가 할 수 있습니다. </li><li> 37 적어도 2.5 시간 동안 품어 ° C. </li></ol> 6. 현미경 사용 <ol><li> 서로 다른 시간 지점에서 소포와 형광 단백질 생산의 진행 상황을 검사합니다. 소포는 400 nm의 소포 압출에 사용되는 분리막의 기공 크기보다 큰 직경을해야합니다. <ol><li> 표준 현미경 슬라이드에 20 X 5mm 실리콘 스페이서를 배치하여 샘플 챔버를 준비합니다. 샘플 챔버에 소포의 피펫 10 μL. 챔버에 실리콘 처리 된 유리 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 63X 오일 분산 O로 소포를 관찰악용 형광 단백질에 대한 적절한 필터 세트를 사용하여 시야 및 형광 현미경에 의한 연구와 유사한 목적. </li></ol></li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

무 세포 합성 생물학은 아직 초기 단계에 있지만, 진보는 점점 더 복잡 해지는 세포와 같은 시스템을 만들 수있는 토대를 마련했다. 소포 28의 완전히 정의 구성 요소 9 내부에서 전사 번역 기계의 재구성은 환경에 반응하는 인공 cells17, 18 건설의 뒷부분에 노력을 촉진 특히 중요했습니다. 마찬가지로, 인공 세포 연구는 진화 과정에게 4,29,30을 검사하는 데 사용되었습니다, 기계적인 RNA의 내용과 단백질 합성 22,31, 신진 대사 load32, 33의 영향, 그리고 바이러스 입자 (34)의 조립. 중요한 것은 충분한 지식은 이제 기본적인 세포 기능이 이전 보고서와 문서에 설명 된 프로토콜에 따라 실험실에서 소포 내부 재구성 할 수 존재합니다. , 설명 캡슐화 홍보 쉽다고에 추가ocedure 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 많은 빈, 동결 건조 소포 분주은 사전에 할 수 있으며, 나중에 사용하기 위해 -20 ° C에 저장됩니다. 프로토콜은 유기 용제, 급격한 온도 변화, 또는 투석 오랜 기간에 적용되지 생물학적 분자 않습니다. 우리는 필요에 따라 절차의​​ 상냥함 추가 구성 요소의 결합을 촉진 할 것으로 기대합니다. 우리는 또한 캡슐 또는 전사 변환 효율 막 지질 성분의 변화에​​ 악영향을 관찰하지 않았습니다. 따라서, 막 단백질, 특정 형태학, 또는 시각화의 설립에 더 순종 지질 생각할 악용 될 수 있습니다. 설명 방법의 주요 한계는 결과 소포가 크기 또는 lamellarity에서 동질하지 않은 것입니다. 많은 애플리케이션의 경우, 이러한 어려움은 데이터의 해석을 방해하지 않습니다. 그러나 필요한 경우 추가 단계가 좁은 일에 통합 할 수 있습니다전자 크기 분포 및 캡슐화 후 같은 압출의 추가 라운드로 세포막의 층을, 감소는, 동결 해동, 또는 투석 35. 이들과 다른 문제를 회피 의심 할 여지없이 더 나은 방법이 개발 될 것이다. 그때까지 우리는 프로토콜이 아니라 세포의 모방의 건설에 적합하도록 여기에서 설명하는 찾을 수 있습니다.

셀 무료, 체외에서 전사 번역 반응과 합성 지질의 소포의 생성은 새로운 아무것도 없습니다. 그러나 모방 세포에 두 가지를 결합하는 challenging1-6 훨씬 더있다. E.는 T7 RNA 중합 효소의 유무에 관계없이 대장균 세포 추출물은 전사 번역 기계 7,8의 소스로 사용할 수 있습니다. 단백질 발현 및 폴딩을 촉진 할 수있는 추가 세포 구성 요소의 존재에서 세포 추출물 혜택을 누릴 수 있습니다. 또한, 개별적으로 정제 된 RNA와 단백질 분자의 혼합은, PURE 시스템 9 즉 intravesicular 단백질 합성에게 4,10-14을 중재하는 데 사용할 수 있습니다. PURE 시스템은 완전히 정의 세포 모방의 건설을 허용하고 세포 추출물에서 발견되는 핵산 활동에서 고통을하지 않습니다. 실제로, 이것은 그로 인하여 낮은 캡슐화 효율을 11로 프로세스를 용이 훨씬 적은 DNA 템플릿이 필요하다는 것을 의미합니다 </sup&gt;. 자주 사용하지만, 휴대 모방은 진핵 cells15에서 파생 된 세포 추출물로 구축 할 수 있습니다. 지금까지 환경을 감지 유전자 코드 캡슐화 폭포 및 세포 모방은 16-18보고되었습니다. 전사 - 번역 반응을 모니터링하는 간단한 방법은 유전자 인코딩 된 요소의 형광 또는 발광을 측정하는 것입니다. 체외에서 반응이 자주 방사선 물질에 의해 측정하고 있지만 일반적으로, 반딧불 루시 페라 제 19 또는 GFP가 사용됩니다. 형광 감지 추가하여 생물학적 같은 과정의 확률 적 특성에 몇 가지 통찰력을 제공하고, 세포 계측법 기반 방법을 통해 소포 20,21의 인구를 모니터링 할 수 있습니다. 이러한 모니터링 방법은 I과 호환되는 형광 단백질의 컬렉션을 포함 설계 규칙의 작은 세트와있는에서 빌드하는 부품의 라이브러리를 정의하는 데 사용되었습니다N 시험관 전사 번역 22 식 22 유전자 조직의 영향, 시그마 요인 16의 활동과 전사 터미네이터 (23)의 효율성이다. 그럼에도 불구하고, 많은 체외에서 예측 건물의 기능, 유전자 인코딩 장치를 높이기 위해 수행해야하는 남아있다. 소포를 만들기 위해 사용할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다. 가장 일반적인 방법은 수성 solution24에있는 부유 뒤에 유리 표면에 얇은 지질막의 생성에 따라 다릅니다. 수용액 전사 번역 기계가 포함되어있는 경우, 예를 들어, 다음 소포의 일부를 형성 단백질 생산에 필요한 구성 요소가 포함됩니다. 그러나, 이러한 방법의 캡슐화 효율은 소포의 단지 작은 비율이 활성화되어 있다는 것을 의미 낮다. 다른 방법의 대부분은 매우 높은 캡슐화 EFF의 특징iciency는 소포를 물에 기름 에멀젼 방울의 변환을 악용. 이 같은 방법은 미래에 일반화 될 가능성이 있지만, 현재 이러한 방법은 전문 장비의 필요성 고통 변경된 막 조성에 25 소포를 제공합니다. 소포 메소드에 물에있는 기름의 독특한 장점은 막 lamellarity을 제어 할 가능성이있다. 여기에 설명 된 방법은 추가 균질화 단계를 포함하여 약간의 수정과 함께 사방 연구소 (11)에 의해 설명 된 얇은 지질막 프로토콜을 기반으로합니다. 이 방법은 쉽고 싸고, 잘 전사 번역 기계 캡슐에 적합한 강력한 소포를 제공합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

개별 분자에서 분자 시스템에 관심을 교대로, 실험실의 증가는 더 나은 세포의 삶의 복잡성을 나타내는 세포 모방 아래에서 위로 빌드 모색하고있다. 물에 기름 에멀젼, 마이크로 유체 장치 및 소포의 착취 등 구획화 된 세포의 모방을 구축하기 위해 수행 할 수있는 경로의 수, 거기 주기적합니다. 사용할 수있는 각 옵션에 특정 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, 물에서 기름 유화액 높은 캡슐화 효율을 제공하지만, 잘 살아있는 세포의 투과성 장벽을 모방하지 않습니다. 여기에 설명 된 방법의 주요 장점은 모두 간단하고 구현하는 싼 것입니다. 전사 번역 기계는 같은 원심 증발기 및 압출기와 같은 일반적인 기기를 활용 과정을 통해 인지질 소포의 내부에 캡슐화됩니다. 반응은 형광 분광법에 의해 모니터링됩니다. 프로토콜의 재조합 단백질 발현, 세포의 모방의 건설, 세포 수명의 최소 요구 사항의 탐사, 또는 유전 적 회로의 조립에 적용 할 수 있습니다.

형광 현미경 extravesicular 물질이 효소 저하 때문 형광 만 (그림 3), 소포의 내부 관찰 보여준다. mVenus의 표현, intravesicular 형광 37 ° C에서 1.5 시간 후 관찰되기 시작하고 6 시간 내에 최대의 형광 강도에 도달합니다. 최적 배양 온도와 시간은 사용되는 특정 구조에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 서로 다른 형광 단백질은 온도에 의존 방식에서 확실히 다르게 성숙. 즉, 단백질 생산의 관찰은 단백질 합성과 폴딩시뿐만 아니라 발색단 형성에 전적으로 의존하지 않습니다. 전체적인 단백질 합성은 전사 및 번역 27에 필요한 소모 부품의 유입을 허용하는 막 단백질 모공을 통합하여 증가시킬 수 있습니다. 그것은 유사한 전사 transla을 수행하는 것이 좋습니다악용 유전자 구조가 작동하는지 확인하는 소포의 부​​재 TION 반응. 이 컨트롤 반응이 더 쉽게 형광 분광법보다 현미경으로 모니터링합니다. 그림 4는 구조 인코딩 mVenus의 시험관 전사 - 번역 반응을 보여줍니다. 캡슐화 반응은 유사 intravesicular 반응보다 훨씬 높은 총 형광 강도를 제공합니다. 총 intravesicular 볼륨이 extravesicular 볼륨 (즉, 희석 효과)보다 훨씬 작으므로이 캡슐화 효율로 인해입니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. 회전하는 증발기, 진공 펌프. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 2. 주택 압출기 부품은 별도로 표시됩니다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 주사기, 고정 너트, 테프론 베어링, 내부 막은 서로를 마주 검은 색 O-링, 압출기 외부 케이싱, 그리고 두 번째 주사기를 지원합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . 리포솜의 mVenus 단백질 생산의 그림 3 형광 이미지와 C :.. multilamellar 소포의 시야 이미지 1.5 시간과 2.5 시간 후 B와 &amp;# 160, D : mVenus의 생산은 형광 (녹색으로 표시) 1.5 및 2.5 시간 후에, 각각에 의해 시각입니다. 스케일 바는 20 μm의 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> 그림 4. mVenus의 시험 관내 전사 및 번역 nonencapsulated의 생체 조절 반응합니다. 형광 강도는 4 시간 동안 5 분마다 측정 하였다. 데이터는 실시간 PCR 장비로 획득 하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다.

휴대 모방 자의 건설을위한 소포는의 셀이없는 전사 및 번역 기계의 캡슐화

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K 조회수.  University of Trento.  여기에서 우리는 소포, 전사 및 번역 기계 캡슐, 단백질 생산의 모니터링 준비를위한 간단한 방법을 설명합니다. 그 결과 세포가없는 시스템은 점점 더 복잡 해지는 세포의 모방을 구축하기 시작 지점으로 사용할 수 있습니다. 

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

연구

생체공학

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

미세 패턴 매크로 스케일 3D 셀룰러 아키텍처 모듈 형 하이드로 겔 시트의 건설

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

세포질 기계 화학 Epigenetic 한정자를 리디렉션하여 억압 유전자 전사

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

고분자 나노 입자에 소수 성 및 친수성 화합물의 캡슐화에 대 한 NanoPrecipitation 플래시

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

세포가 없는 세균 추출물, 리포좀 및 에멀젼 전달을 사용하여 합성 세포를 생산하는 단백질 을 준비합니다.

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

셀룰러 전기 미세 환경의 유한 요소 모델링

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

무세포 자동 유도 워크플로우를 사용하여 24시간 이내에 세포에서 무세포 단백질 합성까지

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

합성 생물학 및 천연 제품 응용 을 위한 고수성 연쇄상 구형 전사 -번역 도구 키트

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...