이 프로토콜은 C.elegans 뉴런 개발에 축축한 및 점원과 같은 상세한 세포 형태를 동시에 분석하는 동안 살아있는 배아에서 세포 계보 및 정체성의 효율적인 추적을 가능하게 합니다. 공초점 현미경 검사법에 비해 이중 보기 반전 선택적 비행기 조명 현미경 검사법 또는 diSPIM은 소음에 더 높은 신호, 더 많은 등위학적 공간 해상도를 제공하며 생체 내 이미징의 장기에 더 적합합니다. 오목한 현미경 슬라이드의 우울증에 1% 메틸셀룰로오스 용액의 500 마이크로리터를 추가하여 시작합니다.
플래티넘 와이어 픽을 사용하여 선충 성장 중간 플레이트에서 M9 메틸셀룰로오스 용액으로 성인을 이송합니다. 18 게이지 피하 바늘의 날카로운 팁을 사용하여 각 동물을 중간 체에서 반비례하여 적어도 1 ~ 4 개의 세포 배아로 슬라이스하십시오. 아스피라이터 마우스피스가 치아 사이에 부드럽게 유지되어 M9 버퍼 10~15마이크로리터로 마이크로카세필리 파이펫을 미리 채우고 슬라이드에서 모세관으로 여러 배아를 부드럽게 흡인시합니다.
신선한 M9 버퍼로 채워진 강철 이미징 챔버의 커버슬립의 중앙 사각형으로 배아를 분배합니다. 각 배아의 긴 축이 커버슬립의 긴 축에 수직이 되도록 배아를 수직으로 부드럽게 방향을 지정합니다. 그런 다음 강철 이미징 챔버를 디스피M 의 단계에서 샘플 홀더에 놓습니다.
이미징용 배아를 준비하기 위해 마이크로 매니저를 열고 레이저 강도를 179 마이크로와트0.5%의 동일성으로 설정하여 488나노미터 및 79마이크로와트0.25%의 561나노미터에 대해 동일성을 설정합니다. 소프트웨어 조정과 실제 레이저 출력 간의 교정은 특정 마이크로와트의 범위를 설정하려면 미리 수행해야 합니다. 플러그인 메뉴에서 장치 제어를 선택하고 과학 이미징 diSPIM을 적용하여 적용 된 과학 이미징 이중 보기 반전 선택적 평면 조명 현미경 창을 엽니 다.
획득 탭에서 매개 변수가 표시된 대로 설정되어 있는지 확인합니다. 자동 초점 탭에서 표시된 대로 매개 변수를 설정합니다. 자동 초점 채널은 계획된 리노징 실험에 대해 핵 형광 채널을 지정해야 합니다.
경로 A 또는 B에 대한 빔과 시트 박스를 확인하고 라이브를 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 라이브 뷰 창이 열립니다. 그런 다음 관심있는 배아 주위에 상자를 그려 배아의 자동 초점 분석 영역을 선택하고 시작 인수를 클릭하여 장기 다차원 이미지 캡처를 시작합니다.
이미지 보기, 처리 및 셀 리니지 분석을 위해 소프트웨어 번들을 다운로드하고 추출한 후 CytoSHOW_app jnlp 파일을 두 번 클릭하여 CytoSHOW 실행을 시작합니다. 파일 메뉴에서 새 및 diSPIM 모니터 마이크로 관리자를 선택하여 원시 마이크로 관리자 이미지가 저장된 루트 데이터 집합 폴더를 찾습니다.
시간 점 폴더를 선택하고 열기를 클릭합니다. 다차원 네비게이션 창은 다차원 네비게이션 윈도우가 다각형 선택 도구를 사용하여 SPIM A와 SPIM B.를 모두 자동으로 열고, 관심있는 배아의 전방, 후방, 등및 복부 가장자리 바로 밖을 클릭하여 SPIM A및 SPIM B 뷰 모두에서 배아 위에 나비 넥타이 패턴을 생성하고 디스피엠을 클릭합니다. 각 SPIM 암에 대한 녹색 및 빨간색 채널을 정렬하고 다시 diSPIM을 클릭합니다.
교대는 다른 모든 위치 창에서 트리거됩니다. 다음으로, 디스피M을 클릭하고 퓨즈를 클릭하여 deconvolved 퓨즈 퓨즈 디스피M 원시 데이터 볼륨 대화 상자를 열고 표시된 대로 매개 변수를 설정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 예를 클릭하고 확인을 클릭하기 전에 처리된 파일을 저장할 출력 디렉터리를 지정합니다. 미리 보기 창에서 t-스크롤 막대를 창 의 두 시간 지점으로 이동하고 배아의 긴 축을 직접 따라 보기가 표시될 때까지 z-슬라이더를 이동합니다.
t 스크롤 막대를 미리 보기 창에서 시간 지점 1로 다시 이동하고 라인 선택 도구를 사용하여 AB 셀 메타위상 플레이트의 평면을 통해 복부 대부분의 둥근 핵에서 선을 그립니다. 디스피M 미리 보기 버튼을 클릭하여 미리 보기된 이미지 볼륨의 방향을 미세조정합니다. 디스피M 모니터 창의 t 스크롤 막대를 처리할 전체 이미지 범위의 시작 및 종료 시간 점으로 설정합니다.
그런 다음 확인을 클릭합니다. 효율적이고 정확한 셀 리니지 분석을 위해서는 Starry Night 처리 전에 데이터 볼륨의 정확한 ADL 방향을 달성하는 것이 중요합니다. AceTree에서 별이 빛나는 야간 계보 추적 시리즈를 열려면 제공된 사용자 지정된 AceTree 파일을 열고 열린 구성 파일을 선택하여 이전에 표시된 출력 디렉터리를 찾습니다. 관심 있는 배아용 퓨즈 하위 폴더를 열고 편집된 파일을 선택합니다.
그런 다음 열린 다음 이전에 설명한 대로 계보 시각화 및 편집을 진행합니다. 최적화된 프로토콜은 부화 시점및 발달 이정표와 관련된 타이밍에 의해 평가된 바와 같이 배아에 검출 가능한 광독성을 유도하지 않습니다. 이 프로토콜을 사용하여 선충 균주를 발현하는 이 형광성 단백질에서 정체불명의 세포는 운동 뉴런, 배설운하 세포 및 2개의 근육 세포에 대응하도록 결정되었다.
확인된 뉴런은 뉴라이트 아웃성장을 위한 후속 축을 나타내는 더 긴 세포축으로 360분 일찍 수정을 부각했다. 385내지 410분 후 수정, RMDD 중성염은 세포체의 전방약 6마이크로미터를 확장했다. 415분에서 445분 후 수정, 두 중성염은 추정 신경 고리 안팎으로 등쪽으로 확장되었습니다.
평균적으로, 각 RMDD neurite는 링의 정점에 있는 그것의 반대측을 동기적으로 충족하기 전에 세포 바디에서 대략 11 마이크로미터를 확장했습니다. 종합, 이러한 데이터는 단일 식별 셀에 대한 신경 발달 기능이 이 통합 프로토콜을 사용하여 검사, 비교 및 정량화될 수 있음을 보여줍니다. 각 배아의 긴 축이 커버슬립의 긴 축에 수직이 되도록 배아를 수직으로 방향을 지정하는 것이 중요합니다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 모든 각도에서 초기 배아 신경계를 탐구하기 시작했습니다. 예를 들면, 세포 출생 도중, 이주 및 분화, 중성염 형성, 밖으로 성장 및 매혹.
