이 프로토콜은 단일 T 셀및 고체 입자를 사용하여 AFM 캔틸레버를 작동하는 가장 좋은 방법을 설명합니다. 이러한 팁은 단일 쌍 수지상 세포-T 세포 상호 작용을 조사하고 각각 변덕스러운 크기의 세포 반응을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캔틸레버의 단일 T 세포 기능화를 위해 생체 적합성 접착제를 사용한다는 것입니다.
이 접착제는 진핵 세포에 불활성, 따라서 그들의 기준선 활성화 단계에 T 세포를 유지. 이 방법은 면역 세포 활성화 및 면역 시 냅 스 형성 등 복잡 한 세포 간 이벤트에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 방법은 또한 세포 세포 또는 세포 표면 상호 작용을 관련시키는 그밖 시스템으로 확장될 수 있습니다.
이 기술에 새로운 누군가를 위해, T 세포가 사용하기 전에 양호한 상태에 있고 하룻밤 IL-2로 전처리된다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 또한 생체 적합성 접착제를 사용할 때는 불필요한 산화로부터 보호하기 위해 신속하게 움직입니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜을 따라 다음하여 현미경 검사법에 대한 단일 T 셀을 준비합니다.
그런 다음 DC2.4 셀로 시드된 유리 커버립을 준비하고, 37°C와 5%CO2에서 가습 챔버에서 밤새 세포를 배양한다. 피라냐 처리, 플라즈마 청소 또는 UV 오존 청소를 사용하여 낮은 스프링 상수로 부드럽고 팁없는 캔틸레버를 청소하십시오. 그런 다음 청소된 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착합니다.
다음으로 깨끗한 샘플 챔버를 준비하고 순수한 물로 채웁니다. 캔틸레버의 감도를 얻기 위해 먼저 유리 기판에 힘 곡선을 실행하여 물 용액에서 캔틸레버를 보정합니다. 그런 다음 열 잡음 스펙트럼을 기록하여 스프링 상수를 추출합니다.
캔틸레버가 제대로 보정되면 솔루션에서 AFM 스캐닝 헤드를 제거합니다. 장착된 캔틸레버를 순수 에탄올 몇 방울로 씻고 캔틸레버를 스캐닝 헤드에 건조하게 유지합니다. 살아있는 세포 환경 인클로저를 섭씨 37도로 예열하여 5%의 CO2로 예열합니다.
이어서, DC2.4 셀로 시드된 유리 커버슬립을 샘플 챔버 어셈블리에 장착하고, 즉시 600마이크로리터의 중간 B를 챔버에 첨가한다. 완성된 어셈블리를 AFM 샘플 스테이지에 배치합니다. 인간 IL-2-인큐베이션CD4 양성 T 세포를 샘플 챔버에 추가합니다.
표적 T 세포가 표지 슬립의 바닥에 완전히 정착 될 때까지 기다린 다음 현미경아래 시야로 세포를 가져옵니다. 이제 파이펫으로 장착 된 캔틸레버의 끝에 생체 호환 접착제 2 마이크로 리터 드롭을 추가하십시오. 생체 적합성 접착제가 캔틸레버에 적용되면 접착력을 최대화하기 위해 가능한 한 빨리 후속 단계를 완료해야 합니다.
스캐닝 헤드를 샘플 단계에 빠르게 배치하여 접착제 코팅 캔틸레버를 솔루션에 담급니다. 상태 T 셀이 캔틸레버 의 끝 아래에 위치할 때까지 샘플 스테이지를 이동합니다. 그런 다음 스캐닝 헤드를 이동하여 위치를 미세하게 조정합니다.
다음으로 캔틸레버를 수동으로 낮춥춥습니다. 50 미크론 스텝 크기로 시작한 다음 캔틸레버 이미지의 선명도에 의해 표시된 대로 10, 5 및 2로 감소하고 마침내 0.5 미크론을 점진적으로 감소시다. 이제 스테퍼 모터의 위치를 잡고 스캔 헤드의 위치를 조정하여 캔틸레버 팁과 셀을 더 잘 정렬합니다.
0.5 ~ 1.5 나노 뉴턴의 전형적인 힘에 대응하는 레이저 위치의 작은 변위에 의해 확고한 접촉이 표시 될 때까지 계속하십시오. 접촉 30초 후 캔틸레버를 철회합니다. 셀이 캔틸레버로 이동하는 경우 첨부 파일이 성공했습니다.
그렇지 않은 경우 새 캔틸레버로 전환하기 전에 접착 단계를 최대 3배까지 반복합니다. 샘플 단계와 스캐닝 헤드를 이동하여 부착된 T 셀을 DC2.4 셀 위에 배치합니다. 적절한 매개 변수를 설정한 후 샘플 위에 힘 분광법을 실행합니다.
새로운 프로빙을 위해 새롭고 깨끗한 캔틸레버를 장착하십시오. 순수한 물에서 교정한 다음 T 세포 수지상 세포 쌍으로 돌아가 스캔을 반복합니다. 시료 챔버 어셈블리에 청소 유리 커버 슬립을 마운트합니다.
커버슬립의 왼쪽에 에탄올에 희석되고 6미크로른 직경의 폴리스티렌 구슬이 들어 있는 비드 용액 한 방울을 추가합니다. 용매가 증발하면 20배 의 목표를 갖춘 밝은 필드 현미경을 사용하여 구슬의 간격을 확인하십시오. 개별 구슬이 잘 분리되어 있는지 확인합니다.
그런 다음, 마이크로피펫 팁이나 이쑤시개를 잘 혼합된 에폭시 접착제에 담그고, 소량의 접착제를 오른쪽에 연속적인 부드러운 터치로 3개의 별도 반점으로 옮기지만, 표지슬립의 중앙에 가깝습니다. 다음으로, 깨끗하고 팁이 없는 캔틸레버를 AFM 스캐닝 헤드에 장착하고 깨끗한 표면으로 공기 중으로 보정하여 스프링 상수를 얻습니다. 그런 다음, 마지막 에폭시 접착제 스팟의 왼쪽 경계 위에 캔틸레버 팁을 배치하고 스테퍼 모터의 작은 스텝 크기를 사용하여 캔틸레버를 접착제에 가깝게 천천히 놓습니다.
접착제와 접촉하면 AFM 스캐닝 헤드를 뒤로 이동하여 캔틸레버를 측면으로 빠르게 당깁니다. 유리에 문지르면 여분의 접착제를 제거하고 끝 끝에 소량의 접착제만 남깁니다. 이제 캔틸레버 팁을 잘 분리된 비드 위에 넣습니다.
단일 비드에 천천히 접근하여 약 10초 동안 2~5나노뉴턴 범위에서 단단히 접촉한다. 접촉하는 동안 미세 팁 조정을 사용하여 팁의 맨 끝에 비드를 배치합니다. 접촉 끝에 있는 팁을 철회합니다.
구슬이 원래 초점 평면에서 사라지면 성공적인 접착 이벤트가 발생했습니다. 마지막으로, 비드 수정 캔틸레버를 조심스럽게 탈착하고, 에폭시가 완전히 치료할 수 있도록 하룻밤 동안 캔틸레버 상자에 보관합니다. 다음은 하나의 접근 방식-리트랙트 주기 동안 단일 T 셀과 단일 수지상 셀 간의 결합 상호 작용에서 얻은 일반적인 힘 거리 곡선입니다.
밝은 빨간색 곡선은 연장 곡선이고 어두운 빨간색 곡선은 철회 곡선입니다. 곡선의 최소 값은 T 셀과 수지상 셀 사이의 최대 접착력을 측정하고 곡선 아래 영역은 이를 분리하는 데 필요한 작업을 나타냅니다. 날카롭고 단계적인 파열 이벤트는 세포-세포 계면에서 강한 결합으로 인해 세포 표면에서 막 밧줄이 꺼낸 다음 연속 당기는 하에서 이산적으로 깨는 것으로 해석될 수 있다.
여기서, 종래의 T 세포결합은 수지상 세포에 대한 회색으로 나타내고, 수지상 세포에 결합하는 조절T 세포는 파란색으로 도시된다. 기존의 T 세포와 조절T 세포 사이의 접착력은 항원 제시 세포에 의해 제시된 펩티드 항원들을 인식하는 반면, 조절T 세포는 면역 반응의 끝으로 기존의 T 세포 매개 면역을 차단하는 억제제 T 세포이다. 형광 표지, phagocytic RAW264.7 세포의 이 회로도는 단일 벌거 벗은, 6 미크론 직경, 폴리스티렌 구슬로 접근하는 세포를 보여줍니다.
구슬을 참여시막 PIP2는 b 근처의 접촉 부위에서 정렬되어 모에신의 막 모집을 유도하여 식세포 이벤트가 발생합니다. 여기에 설명된 절차 이외에, AFM 계 단일 세포 힘 분광법은 단일 세포 수준에서 실시간으로 면역 세포 활성화를 연구하기 위해 형광 영상과 함께 사용될 수 있다. 결합된 형광 기술, 이 방법은 수지상 세포와 T 세포 쌍 사이 면역 시냅스의 형성과 같은 더 복잡한 세포 프로세스를 실시간으로 해결하는 것을 허용합니다.
