우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 셀의 제조 및 미디어 (주 1) <ol><li> 문화 DMEM 매체는 10 % FBS가 포함 된 인간의 섬유 아세포를 확장합니다. </li><li> 플레이트 인간의 섬유 아 세포 전달 전날에 잘 당 적절한 밀도로 24 웰 플레이트 상에 (그림 1). 참고 : 다른 종류의 세포가 다른 첨부 파일 기능을 가지고 있기 때문에 다음과 같은 일련의 희석액 (200K, 100K, 50K, 25K, 12.5K 및 6.25K)을 권장합니다. </li><li> 세포가 완전히 준수 및 확장이 보장, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하루 더의 세포를 품어. </li></ol> 2. 형질을 수행합니다 (2 일) <ol><li> 형질 도입의 날에, 세포 밀도를 확인하고 가장 효율적인 밀도 웰 (도 2)을 선택했다. 높은 (80 ~ 90 %), 중 (50 ~ 70 %)과 낮은 (20 ~ 40 %)의 세 가지 다른 밀도를 선택하는 것이 좋습니다. </li><li> 1 시간 이상 전달하기 전에, fibrobl를 대기음AST의 세포에서 미디어와 섬유 아세포 매체의 새로운 300 μl를 변경합니다. </li><li> -80 ° C 저장에서 4 개의 다른 센다이 바이러스 튜브의 한 세트를 제거합니다. 몇 초 동안 37 ° C의 물 배스 동시에 각 튜브를 해동하고 수욕으로부터 튜브를 가지고. 그 후, 실온까지 이들을 해동; 원심 분리기 10 초 동안 6,000 XG에 튜브 및 사용까지 얼음에 배치합니다. 동결을 다시 및 역가가 유지되지 않으므로 바이러스를 해동하지 마십시오. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 네 센다이 바이러스 튜브 (10 월 - 4, KLF-4, C-Myc와와 삭스-2)의 각각의 지정된 볼륨을 추가합니다. 용액을 부드럽게 피펫 팅하여 잘 혼합되어 있는지 확인합니다. 예를 들어, 전달 24 - 웰 플레이트 lookwell의 50K 세포 / 잘 하나 : (생활 기술에서 분석의 인증서를 기반으로 역가가 배치에서 배치에 차이가있을 수 있습니다) 튜브 hOct-4 = 6.0 × 10 7 CIU, 3 MOI 5 μl를 = 튜브 hSox-2 = 6.5 × 10 7 CIU, 3 MOI는 = 4.6 μ; L 튜브 hKlf-4 = 6.3 × 10 7 CIU, 3 MOI = 4.8 μL 튜브 HC-Myc와 = 7.8 × 10 7 CIU, 3 MOI = 3.8 μL 총 = 24 - 웰 플레이트의 네 가지 바이러스 요인 혼합물 / 잘 하나 (50K 세포)의 18.2 μL </li><li> 세포 밀도에 따라; 2X, 1X, 그리고 잘에 바이러스 혼합물의 0.5X 볼륨을 추가합니다. 부드럽게, 플레이트 앞뒤 흔들어 좌우 (2X : 바이러스 혼합물, 1X의 36.4 μL : 18.2 μL와 0.5X : 9.1 μL). </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 세포를 놓고 밤새 품어. </li></ol> 3. 문화 매체의 교체 (3 일 · 5 일) <ol><li> 24 시간 전달 후, 500 ㎕의 신선한 섬유 아세포 매체와 매체를 교체하십시오. </li><li> 5 일에, 신선한 섬유 아세포 미디어와 중간 변경합니다. </li></ol> 4. 공동 문화 MEF 요리를 준비 (8 일) <ol><li> 10 % 60mm 배양 접시에 MEF 세포를 준비 FBS는 DMEM 매체 하나 다 포함MEF 피더 세포에 형질 도입 된 섬유 아 세포를 계대 전에 Y. 참고 : 우리는 각 60mm 접시에 MEF의 5 × 5를 사용하고 있습니다. </li></ol> 5. 시작 공동 문화 MEF 피더 세포 (9 일)으로 세포를 형질 도입 <ol><li> 형질 세포를 도금하기 전에 대기음 10 % FBS는 MEF 피더 요리에서 DMEM 매체를 포함하고 FBS는 DMEM 매체를 포함 신선한 10 %를 추가합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트에 있고 D-PBS로 한 번 세포를 씻어 형질 섬유 아 세포에서 매체를 제거합니다. 24 - 웰 플레이트 기계가 섬유 아세포의 세포에 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 200 μl를 추가합니다. 세포가 플레이트에서 분리하기 시작할 때 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 미만 5 분 배양 후, 15 ML 원뿔 튜브에 성장 매체와 세포를 수집합니다. 그런 다음 4 분 6,000 XG에서 그들을 원심 분리기. 참고 : 2X, 1X, 0.5X 및 바이러스를 풀링은 형질 섬유 아세포를 권장합니다. </li><li> 뜨는 매체를 제거하고 다시 중단에 씻어트립신의 중화를위한 신선한 섬유 아세포 배지 중에서 4-5 ㎖를 가진 세포 펠렛. 그런 다음 4 분 동안 135 XG에이를 원심 분리. </li><li> 예 : 1 / 2, 1 / 4, 1 / 8, 1 / 16, 1 / 32, 1 / 64, 및 백이십팔분의 일 60 당 : 시리얼 희석 밀도 및 MEF 상에 섬유 아세포 미디어와 공동 문화에 시작 플레이트 세포 mm 접시. 전달의 첫 주 동안 세포 사멸 속도에 따라, 하나는 1 / 2 또는 128분의 1 밀도에 희석 할 필요가 있습니다. 형질 전환 유전자 RT-PCR에 대한 긍정적 인 제어로 총 RNA를 추출하기 위해 옆에 남아있는 세포를 넣어. </li><li> 5 % CO 2 배양기 하룻밤, 37 ° C에서 60mm 요리를 놓습니다. </li></ol> 6. 인간 배아 줄기 세포의 중간 피드와 셀 (주 10) 모니터 <ol><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES 미디어에 섬유 아세포 미디어를 변경합니다. 그 후, 인간 ES 매체 매일 매체 변경 : 800 ml의 DMEM/F12 + 200 ㎖의 녹아웃 혈청 교체 + 10 ml의 L-글루타민 + 10 10 mM의 MEM 최소 비 필수 아미노산의 ML기본적인 섬유 아세포 성장 인자의 2 - 머 캅토 에탄올 + 10 겨 / ㎖의 + 1 ㎖. </li><li> 신선한 인간의 ES의 미디어와 매일 미디어 변경 작업을 수행합니다. 일주일 후, ES 식민지와 같은 세포 덩어리의 형성을 현미경으로 한 번에 2 ~ 3 일이다 요리를 확인합니다. 콜로니가 발견되기 전에 세포의 종류에 따라, 배양은 더 많거나 적은 시간이 걸릴 것이다. </li></ol> 7. 유도 다 능성이 세포 식민지 줄기 및 셀 확장 따기 (일 20 ~) <ol><li> 3 주 전달 후, 식민지 따기 제대로 성장 나타납니다. </li><li> 식민지를 따기 전날 24 - 웰 플레이트에 MEF 공급 장치를 준비합니다. 참고 : 우리는 하나 24 - 웰 플레이트에 MEF 12.5 × 10 5를 사용하고 있습니다. </li><li> 다음 날, 10 μM Y-27632 인간의 ES의 미디어에 섬유 아세포 미디어에서 MEF 요리의 매체를 변경합니다. 수동 따기 후드에서 현미경으로 각각 한 번에 하나의 식민지를 선택하고 피펫으로 작은 덩어​​리를 만들어 전송할새로 개의 클론을 선택하는 MEF dishes.Try 준비에. </li><li> 통로 처음 6 웰 플레이트에 24 웰 플레이트에서 각 웰 확장합니다. 그런 다음 6 잘 플레이트에서 더 전파하기 전에 60mm 요리에. </li></ol> (10 구절 후) 인간 유도 만능의 8. 특성 <ol><li> 면역 형광 <ol><li> 매일 미디어 변화 4-5 일 도중 24 웰 플레이트와 문화 플레이트 인간 유도 만능. </li><li> 면역 형광 분석을 시작, 한 번 D-PBS로 접시를 씻으십시오. 그런 다음 30 분 동안 0.4 % 파라 포름 알데히드 즉시 세포를 고정합니다. 그 후 5 분 동안 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 용액으로 고정 된 세포를 치료. </li><li> permeablization 용액 (0.1 % 트리톤 X-100 용액) 대기음 다음, 상온에서 1 시간 동안 0.5 % BSA 블로킹 용액을 추가한다. </li><li> Nanog를, 10 월 - 4, SSEA (무대 특정 배아 antig의 검출을 수행EN) 및 TRA-1-81 0.5 % BSA 용액에 항 인간 항체를 사용하여 (종양 제거 항원) (항체의 희석 비율에 대한 자료 표를 확인하시기 바랍니다.) 실온에서 2 시간 동안 차 항체를 품어. 그런 다음 5 분마다 D-PBS로 세 번 씻어. </li><li> 실온에서 0.5 % BSA 용액에 1:2,000 희석하는 2 차 항체와 같은 알렉사 플 루어 488 염소 항 - 마우스 IgG 항체와 배양 1 시간 후 형광 현미경을 사용하여 확인합니다. DAPI 각 MEF 피더 세포와 hiPSCs의 모든 핵을 얼룩. </li></ol></li><li> 형질 전환 유전자 확인의 RT-PCR <ol><li> RNA 추출 시약을 사용하여 세포 펠렛에서 총 mRNA의 압축을 풉니 다. </li><li> 역전사하여 PCR 증폭을위한 총 RNA와 그 결과의 cDNA의 분취에 역전사 (1 μg)을 수행합니다. </li><li> cDNA를 템플릿의 2 μL, 2X PCR 마스터 믹스 10 μL, 프라이머 2 pmol의 2 μl를 포함하는 PCR 혼합물을 준비합니다(앞으로 1 μL 및 역방향 : 1 μl를) 및 DW 6 μL. 표 1에 기재된 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 유전자 발현을 검출한다. </li><li> 증폭 반응의 효율을위한 제어로 GAPDH 유전자와 RT-PCR을 수행합니다. 시각화하고 1 % 아가로 오스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물을 분석한다. </li></ol></li></ol>

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	<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells.">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li><li>Okita, K., Nakagawa, M., Hyenjong, H., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells+without+viral+vectors.">Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors.</a> Science. 322, 949-953 (2008).</li><li>Zhou, W., Freed, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenoviral+gene+delivery+can+reprogram+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).</li><li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li><li>Yusa, K., Rad, R., Takeda, J., Bradley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgene-free+induced+pluripotent+mouse+stem+cells+by+the+piggyBac+transposon.">Generation of transgene-free induced pluripotent mouse stem cells by the piggyBac transposon.</a> Nature Methods. 6, 363-369 (2009).</li><li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins.">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Yoshioka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Human+iPSCs+by+a+Synthetic+Self-Replicative+RNA.">Efficient Generation of Human iPSCs by a Synthetic Self-Replicative RNA.</a> Cell Stem Cell. 13, 246-254 (2013).</li><li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression.">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nature Protocols. 7, 2013-2021 (2012).</li><li>Fluri, D. 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S., Rowntree, R. K., Mekhoubad, S., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+and+epigenetic+fluidity+in+human+embryonic+stem+cells.">X-chromosome inactivation and epigenetic fluidity in human embryonic stem cells.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 4820-4825 (2008).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-371-3+expression+predicts+neural+differentiation+propensity+in+human+pluripotent+stem+cells.">miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).</li></ol>

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hiPSCs에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 것은 기본 생물학, 개인 의학 및 이식 12 전례없는 약속을 보유하고 있습니다. 이전에, 인간의 IPSC 세대는 의약품 개발과 이식 치료 13으로 추가 임상 응용 프로그램을 제한하는 바람직하지 않은 유전자 변이를 만들 수 있습니다 호스트 게놈으로 통합 위험이 DNA 바이러스를 요구했다. 이러한 이유로, 많은 연구는 여러 다른 방법으로 벡터 ?...

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 약물 검사에 대한 질병 모델링을위한 잠재적으로 유용 할 수 있고, 질병 및 조직 손상을 치료하는 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 자기 갱신 시험 관내 및가 능성에 대한 능력을 보유하고 있습니다. 그러나 인간 배아 줄기 세포 때문에, 면역 학적 종양학과 윤리적 장벽의 세포 대체 요법에 대한 제한이 있고, 질병 관련 유전자를 연구, 질병 특정 인간 배아 줄기 세포는 착상 전 유전자 진단 (PGD) 방식을 통해 분리 할 수​​ 있지만, 여전히 기술적으로 도전 및 배아 기증은 매우 드물다. 이러한 문제는 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 개발을 주도하고있다 줄기 세포 생물학의 진행과 관련이 있습니다. 인간 유도 만능은 유 전적으로 인간의 성인 체세포에서 프로그램이 다시 그들에게 예 : D 재생 의학을위한 유용한 소스를 만드는 인간 배아 줄기 세포와 유사한 만능 줄기 세포와 같은 기능을 품고있다양탄자 발견, 질병 모델링 및 환자 특정 방식으로 1,2의 세포 치료. 지금까지 바이러스 매개 (레트로 바이러스 및 아데노 바이러스)를 포함하여 인간 유도 만능를 생성하는 여러 가지 방법, 3, 비 바이러스 매개 (BAC 시스템과 벡터의 형질) 4 유전자 transductions 및 단백질 전달 시스템 5-7이 있습니다. 바이러스 매개 유전자 전달 효율의 특정 수준을 보장 할 수 있지만 그들이 통제 할 수없는 방식으로 프로그램을 다시 만들 유전자를 표현하는 호스트의 염색체에 통합하기 때문에, 바이러스 성 벡터는 유전자 발자국을 떠날 수 있습니다. 전사 인자의 바이러스 통합을 활성화하거나 호스트 8 유전자를 불 활성화 할 수 있더라도, 이는 예기치 유전 수차 및 종양의 5,9의 위험을 일으킬 수있다. 한편, 체성 세포로 단백질 또는 RNA의 직접적인 도입은보고 있지만, 이러한 노동 집약적 반복 TRANSF 등의 몇 가지 단점을 가지고 있었다ection 및 7,10 재 프로그램의 낮은 수준입니다. 심지어 에피 솜 및 비 통합 아데노 바이러스, 아데노 - 관련 바이러스, 플라스미드 벡터는 여전히 11 비교적 덜 효율적이다. 이러한 이유로, 그것은 IPSC 세대의 높은 효능과 적은 유전자 이상과 비 통합 프로그램을 다시 만들 방법을 선택하는 그럴듯​​. 이 연구에서, 우리는 센다이 바이러스 기반 프로그래밍을 사용합니다. 이 방법은 호스트 게놈에 비 통합과 지속적으로 유전자 통합하지 않고 인간 유도 만능를 생산하는 것으로 알려져있다.

<table><tbody><tr><td>CytoTune-iPS Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A1378002</td><td></td></tr><tr><td>CF-6,MEFs, neomycin-resistant, mitomycin C treated&amp;nbsp;</td><td>Global stem</td><td>GSC-6105M</td><td>5 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;/6 cm or 12.5 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;/24-well plate</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25% Trypsin with EDTA 4Na 1X</td><td>Invitrogen</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>24-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid</td><td>BD</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td>10 &amp;#956;M (Stock: 10 mM)</td></tr><tr><td>basic fibroblast growth factor</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>PHG0263</td><td>10 ng (Stock : 100 ug)</td></tr><tr><td>Knock-out serum replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;#039;s Modified Eagle Medium (D-MEM, DMEM) (1X), liquid (high glucose)</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine-200 mM (100X), liquid</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td>1/100</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>LIFE TECHNOLOGIES</td><td>11140050</td><td>1/100</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid</td><td>GIBCO</td><td>21985023</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Hausser Phase Contrast Hemacytometers</td><td>Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>DSHB</td><td>MC-813-70</td><td>1/200</td></tr><tr><td>anti-Tra-1-81</td><td>Cell Signaling</td><td>4745S</td><td>1/200</td></tr><tr><td>mouse monoclonal Oct4 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>R&amp;amp;D</td><td>AF1997</td><td>1/1,000</td></tr><tr><td>Alexa Flouor 488 goat anti-mouse</td><td>Invitrogen</td><td>948492</td><td>1/2,000</td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco&amp;#039;s Phosphate-Buffered Saline), 1X without calcium &amp;amp; magnesium</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transcription Kit</td><td>QIAGEN</td><td>205313</td><td></td></tr><tr><td>PCR Master Mix [2X]</td><td>Thermo Scientific Fermentas</td><td>K0171</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>picking hood</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td></td></tr><tr><td>dissecting scope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr></tbody></table>

efficient generation human induced pluripotent stem cells from human somatic cells with sendai-virus

몇 년 전, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)의 설립은 생물 의학의 새로운 시대를 열었다. 인간 유도 만능의 잠재적 인 사용은 인간의 유전 질환의 모델링 발병 유전자 보정 후자가 세포 치료, 환자 별 증상과 관련된 세포의 소스를 제공함으로써 맞춤 약물 검사를 포함한다. 그러나, 이러한 인간 유도 만능 생산 후 남은 프로그래밍 인자 유전자의 발현을 제거하는 등의 극복하는 여러 장애물이있다. 더 중요한 것은, 미분화 된 인간 유도 만능 잔류 유전자 발현 적절한 분화를 방해하고 질병 관련 체외 표현형에서의 해석을 잘못지도 할 수 있습니다. 이러한 이유와 함께, 통합 - 무료 및 / 또는 유전자가없는 인간 유도 만능는 아데노 바이러스, 피기 백 (PiggyBac) 시스템, minicircle 벡터, 에피 솜 벡터, 직접 단백질 전달과 같은 몇 가지 방법을 사용하여 개발 및 mRNA의 합성되었다. 그러나 reprogra의 효율성통합없는 방법을 사용하여 mming하는 것은 대부분의 경우 매우 낮습니다. 여기서, 우리는 센다이 바이러스 (RNA 바이러스) 기반 프로그래밍 시스템을 사용하여 인간 유도 만능을 분리하는 방법을 제시한다. 이 프로그래밍 방법은 일관된 결과 및 비용 효율적인 방식으로 고성능을 나타낸다.

보통 감염 섬유 아 세포는 센다이 바이러스 전달 후 몇 일에 한 어떤 형태의 변화를 보여주지 않지만, 5 일 후, 그들은 다른 모양 (그림 1)를 가지고 시작합니다. 도 1의 오른쪽 패널에서 설명한 바와 같이, 세포는 전형적인 섬유 아세포의 형태를 가지고 있지 않는다. 그들은 세포질보다 둥근 모양과 더 큰 핵이있다. 전달이 80 %의 세포 포화 상태에서 수행되는 경우에도 그들...

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Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

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22.5K 조회수.  Johns Hopkins University School of Medicine.  여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다. 

비디오: Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Frozen Buffy Coats using Non-integrating Episomal Plasmids

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-Myc), typically expressed by human embryonic stem cells (hESCs). Due to their similarity with hESCs, iPSCs have become an important tool for potential patient-specific regenerative medicine, avoiding ethical issues associated with hESCs. In order to obtain cells suitable for clinical application, transgene-free iPSCs need to be generated to avoid transgene reactivation, altered gene expression and misguided differentiation. Moreover, a highly efficient and inexpensive reprogramming method is necessary to derive sufficient iPSCs for therapeutic purposes. Given this need, an efficient non-integrating episomal plasmid approach is the preferable choice for iPSC derivation. Currently the most common cell type used for reprogramming purposes are fibroblasts, the isolation of which requires tissue biopsy, an invasive surgical procedure for the patient. Therefore, human peripheral blood represents the most accessible and least invasive tissue for iPSC generation.
In this study, a cost-effective and viral-free protocol using non-integrating episomal plasmids is reported for the generation of iPSCs from human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats after whole blood centrifugation and without density gradient separation.

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent a source of patient-specific tissues for clinical applications and basic research. Here, we present a detailed protocol to reprogram human peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) obtained from frozen buffy coats into viral-free iPSCs using non-integrating episomal plasmids.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Somatic cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by forcing the expression of four transcription factors (Oct-4, Sox-2, ...

연구

발생학

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

생물학

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted for research in regenerative medicine and are currently in clinical trials for eye diseases, diabetes, heart diseases, and other disorders. The potential to differentiate into specialized cell types coupled with the recent advances in genome editing technologies including the CRISPR/Cas system have provided additional opportunities for tailoring the genome of iPSC for varied applications including disease modeling, gene therapy, and biasing pathways of differentiation, to name a few. Among the available editing technologies, the CRISPR/Cas9 from Streptococcus pyogenes has emerged as a tool of choice for site-specific editing of the eukaryotic genome. The CRISPRs are easily accessible, inexpensive, and highly efficient in engineering targeted edits. The system requires a Cas9 nuclease and a guide sequence (20-mer) specific to the genomic target abutting a 3-nucleotide &#34;NGG&#34; protospacer-adjacent-motif (PAM) for targeting Cas9 to the desired genomic locus, alongside a universal Cas9 binding tracer RNA (together called single guide RNA or sgRNA). Here we present a step-by-step protocol for efficient generation of feeder-independent and footprint-free iPSC and describe methodologies for genome editing of iPSC using the Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. The genome editing protocol is effective and can be easily multiplexed by pre-complexing sgRNAs for more than one target with the Cas9 protein and simultaneously delivering into the cells. Finally, we describe a simplified approach for identification and characterization of iPSCs with desired edits. Taken together, the outlined strategies are expected to streamline generation and editing of iPSC for manifold applications.

This protocol describes in detail the generation of footprint-free induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human pancreatic cells in feeder-free conditions, followed by editing using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins and characterization of the modified single-cell clones.

효율적인 생성 및 급지대 무료 Ipsc CRISPR Cas9 시스템을 사용 하 여 인간의 췌 장 세포에서의 편집

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

생체공학

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...