우리는 안티 리프트 밸리 열병 바이러스의 혈청을 제공하는 CISA-INIA에서 알레한드로 브룬 감사합니다. 우리의 실험실에서 작업 Forschungsförderung 보석에 의해 지원됩니다. 2 상승률 §. 3 Kooperationsvertrag Universitätsklinikum 기센 운트 마르부르크, 신흥 바이러스 성 질병에 대한 라이프니츠 대학원 (EIDIS), DFG Sonderforschungsbereich (SFB) 1021 및 DFG Schwerpunktprogramm (SPP) 1596.

감염 A549 세포의 1. 시드 <ol><li> 37 ° C에서 A549 세포의 T75 플라스크를 육성하고 5 %는 세포 배양 배지에서 CO 2 (DMEM 10 % FCS, 526.6 ㎎ / ℓ의 L-글루타민, 50.000 U / L 페니실린, 50 ㎎ / ℓ의 스트렙토 마이신과 보충). </li><li> 세포를 수확을 시작하기 전에 37 ℃로 가열 수조에 세포 배양 배지, PBS 0.05 % 트립신-EDTA를 따뜻하게 </li><li> 매체를 제거하고 10 ㎖의 PBS로 세포를 씻어. 다시 PBS를 제거합니다. </li><li> 트립신-EDTA의 3 mL를 넣고 플라스크에 동일하게 배포 할 수 있습니다. 37 ° C로 인큐베이터에서 플라스크를 전송하고 5 % CO 2. </li><li> 모든 세포가 분리되면, 세포 배양 배지 12 mL를 넣고 세포를 재현 탁하고, 15 ㎖의 팔콘 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> RT에서 5 분 동안 800 XG에서 세포를 원심 분리하고 상등액을 10 ㎖의 신선한 세포 배양 배지에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 카운팅 챔버와 함께 세포를 카운트. </li><li> 두 T25 플라스크 각 세포 배양 배지 5 ㎖에 2.5 × 10 6 세포를 추가합니다. 37 ° C에서 16 시간 동안 배양하고 5 % CO 2. 한 플라스크 모의 제어 및 망할 CIA 13 감염에 대한 하나 제공합니다. </li></ol> 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 2. 감염 된 (C1 13) <ol><li> 참고 : 망할 CIA (13)가 독일에서 BSL-2 조건에서 처리 할 수​​있는 약독 화 바이러스의 돌연변이이다. 해당 국가의 지침을 참조하십시오. 다른 일반적인 IFN 유도제 센다이 바이러스 (변형 Cantell) 뉴캐슬 질병 바이러스 일 것입니다. </li><li> 5 % FCS를 함유하는 사전 따뜻한 PBS, 무 혈청 배지 및 세포 배양 배지. </li><li> 5 감염 다중도 (MOI)로 2.5 × 106 A549 세포를 감염 혈청 배지에서 망할 CIA 13 1.25 × 10 7 PFU / ㎖를 준비한다.을 고려하는 데 필요한 것보다 약간 (약 10 %)보다 많은 양을 준비 피펫 오류. </li><li> 1.3에 설명 된대로 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 망할 CIA 13 ml의 희석 또는 추가무 혈청 배지의 세포 (감염되지 않은 제어, 모의), 37 ° C에서 1 시간 5 % CO 2 알을 품다. 각각 망할 CIA 13 희석 혈청 배지의 동등한 분배를 보장하기 위해 매 15 분 조심스럽게 플라스크를 이동합니다. </li><li> 감염의 1 시간 후, 접종을 제거 5 % FCS로 예열 된 세포 배양 배지 5 ㎖를 추가하고, 37 ° C에서 5 시간 5 % CO 2 알을 품다. </li></ol> 세포 용 해물의 3. 준비 <ol><li> 4 ℃에서 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100을 준비 세린 프로테아제 억제제를 추가하지 마십시오. </li><li> 차가운 PBS로 세포를 세척하고 신선한 PBS의 10 ML을 추가합니다. </li><li> RT에서 5 분 800 XG에서 세포 팔콘 튜브 서스펜션, 원심 분리기를 전송하고, 세포를 긁어. </li><li> 상층 액을 제거하고 30 ㎕의 PBS / 0.5 % 트리톤 X-100에있는 세포 펠렛을 resuspend. 새로운 1.5 ML 튜브에 해물을 전송하고 4 ℃에서 적어도 10 분 동안 품어 </li><li> 10.00 해물을 원심 분리기0 ~ 4 ° C에서 10 분 동안 XG와 신선한 튜브에 명확히 세포 용 해물 (상층 액)을 전송합니다. </li><li> 다른 33 설명한대로 브래드 포드 분석에 의해 단백질 농도를 결정합니다. </li><li> -20 ° C에서 보관 또는 트립신 소화 (4.1) 또는 기본 페이지 (5.1)로 진행합니다. </li></ol> 패턴 인식 수용체의 구조적인 변경 4. 결정 <ol><li> 세포 용 해물의 TPCK - 트립신 처리 <ol><li> 2 ㎍ / μL의 최종 작업 농도로 PBS에 L-1-tosylamido-2 - 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 처리 (TPCK) 트립신을 희석. </li><li> 두 개의 새로운 튜브 PBS 9 μL의 최종 볼륨 (모의 또는 망할 CIA 13) 각 단백질의 용해 액의 25 μg의 최종 단백질 농도를 조정합니다. 따라서, 그것은 두 번 모의 두 번 망할 CIA 13 감염 25 μg의 해물을 각각 네 개의 튜브해야합니다. 하나는 입력 제어 (치료) 및 TPCK - 트립신 처리를위한 하나의 세트로 설정합니다. </li><li> PBS의 1 μl를 추가합니다 (치료)또는 1 ㎍ / ㎕의 TPCK-트립신 (최종 농도 0.2 ㎍ / μL) ㎕의 세포 용 해물을하고 피펫으로 반응을 섞는다. 그것은 소화의 효율성을 손상하기 때문에, 동결 TPCK-트립신 분주을 해동하지 마십시오. </li><li> 25 분 동안 37 ° C에서 해물을 품어. 배는 (250 MM 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % SDS, 50 % 글리세롤, 25 %의 β-머 캅토 에탄올, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀) 샘플 버퍼를 변성 추가하여 95 ℃에서 5 분간 끓여 반응을 중지 그것은 트립신 보육 시간을 연장하지하는 것이 중요합니다. 더 프로테아제 저항하는 조각이 검출없는 경우, 트립신 소화의 시간을 단축 할 수 있어야합니다. </li><li> 끓는 후, 샘플은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (PAGE)과 웨스턴 블로 팅 <ol><li> 황산 도데 실 나트륨 12 % 해결 젤에 5 %의 스택을 포함하는 (SDS) 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 샘플을로드합니다. 까지 젤 당 25mA에서 단백질을 분리브로 모 페놀 블루 밖으로 실행됩니다. </li><li> 메탄올로 30 초 동안 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 멤브레인을 활성화하고 전송 버퍼 (48 mM 트리스, 39 mM의 글리신, 1.3 mM의 SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 반 건조 블로 팅 시스템과 블로 팅을 준비하고 1 시간 동안 10 V에서 단백질의 전송을 할 수 있습니다. 멤브레인을 꺼내 물로 간단히 씻어서 말리면. </li><li> 곧 메탄올로 전송하여 막 활성화하십시오. TBS로 5 분 씻으십시오. 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 TBS에서 10 % 탈지 우유로 차단 5 분 TBS 각각의 막 배를 씻으십시오. </li><li> 표 1에 권장 항체 희석을 준비하고 실온에서 4 ° CO / N.에서 1 시간 동안 막 부화 </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 씻으십시오. TBS의 1 % 탈지 우유 1:20,000 희석에 고추 냉이 퍼 옥시 다제과 함께 적절한 보조 항체를 추가합니다. 실온에서 45 분 알을 품다. </li><li> 10 분 TBS-T와 각 막 배를 세척하고, 오TBS와 네브라스카 추가 시간. </li><li> 신호 검출을위한 상용 chemiluminescense 키트 및 디지털 겔 이미징 시스템을 사용한다. </li></ol></li><li> 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색법 <ol><li> 4.2.1에 설명 된대로 SDS-PAGE를 수행합니다. 브로 모 페놀 블루가 소진 될 때까지로드 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔에 샘플 및 젤 당 25mA에서 젤을 실행합니다. </li><li> RT에서 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색을 수행합니다. 일정한 진탕 모든 배양을한다. </li><li> 40 % 메탄올, 30 분 동안 10 % 아세트산을 함유하는 고정액으로 겔을 전송. </li><li> destaining 용액 (25 % 에탄올과 8 % 아세트산)에 버퍼를 교환하고 5 분 동안 품어. </li><li> 40 % 메탄올로 1 시간 동안 10 % 아세트산 0.2 % 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250으로 겔을 염색. </li><li> destaining 용액 겔을 Destain하고 10 분, 30 분 및 60 분 후에 버퍼를 교환한다. </li><li> 4 ° C에서 25 % 에탄올, 8 % 초산, 4 % 글리세롤에 젤을 저장 </lI&gt; <li> 4.2.8에 설명 된대로 이미징 및 분석을 수행합니다. </li></ol></li></ol> 패턴 인식 수용체의 올리고머 미국의 5. 분석 <ol><li> 기본 페이지 <ol><li> PBS 10 μL의 최종 부피로 세포 용 해물 50 μg를 준비의 최종 농도 5 × 네이티브 샘플 완충액 (250 mM 트리스 - 염산 pH를 6.8, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 50 % 글리세롤, 블루 0.5 % 브로 모 페놀)를 추가 1X. </li><li> 스태킹 5 % 젤을 해결하는 등의 8 %와 기본 폴리 아크릴 아마이드 젤에 즉시 샘플을로드합니다. 지연은 네이티브 단지 (34)의 손실이 발생할 것입니다. </li><li> 양극과 50 mM 트리스 산도 8.3, 384 MM의 글리신, 음극 버퍼로 1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트 등으로 50 mM 트리스 - 수산화 나트륨의 pH 9.0, 384 mM의 글리신과 4 ° C에서 젤 당 20mA에서 젤을 실행합니다. 1.5 시간 후 전기가 완료 (브로 모 페놀 블루 밴드는 약 45 분 이전에 젤 남아있다). </li></ol></li><li> 웨스턴 블로 팅 <ol><li> polyv 활성화메탄올 30 초 동안 플루오 라이드 (PVDF) 막을 inylidene 및 Towbin 버퍼 (25 MM 트리스, 192 mM의 글리신, 0.1 % SDS, 20 % 메탄올)에 넣어. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 젖은 얼룩 챔버를 조립하고 Towin 버퍼 탱크를 채우십시오. </li><li> 4 ℃에서 1.5 시간 동안 250mA로 블로 팅을 수행합니다 </li><li> 모래 바닥 경우는 4.2.3에서 설명 된대로 진행으로 완성되고 있습니다. </li></ol></li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

바이러스의 존재와 I 시스템을 IFN 항 바이러스 유형의 활성화를 감지 성공적으로 타고난 면역 반응 22 중요하다. 바이러스 탐지함으로써 신속한 대응 및 항 바이러스 방어 메커니즘의 활성화를 가능하게 RIG-I와 PKR 같은 병원체 인식 수용체 (PRRS)에 의해 매개된다. 여기, 우리가 직접 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 평가하기 위해 두 가지 방법을 설명합니다. RIG-I과 PKR의 구?...

항 바이러스 숙주 방어에서 중요한 이벤트는 소위 패턴 인식 수용체 (PRRS) 1,2에 의해 병원균의 신속한 검출입니다. RNA 바이러스 감염 세포 내 검출은 두 가지 세포 내 RNA의 헬리, RIG-I (레티노 산 유도 유전자 I) 및 MDA5 (흑색 종 분화 관련 단백질 5) 3-5에 따라 달라집니다. RIG-I은 두 개의 N-말단 카스파 모집 도메인 (카드), 중앙 DECH 박스 타입 RNA 헬리 케이즈 도메인과 C-말단 도메인 (CTD) 4,6로 구성되어있다. CTD 및 헬리 케이즈 도메인이 아닌 자기 (바이러스) RNA를 인식에 필요한 반면, 카드는 항 바이러스 호스트 상태의 설립에 이르는 다운 스트림 신호를 중재. RIG-I가 특정 RNA 리간드의 부재 즉 무음 상태에있는 경우, 제 CARD는 중앙 헬리 케이즈 도메인과 상호 작용하고 자동 억제 입체 7-11 RIG-I를 유지한다. RIG-I는 짧은에 바인딩 더블5&#39;-트리 포스페이트 (5&#39;PPP), 긴 dsRNA에, 그리고 polyU / UC 풍부한 RNA, 많은 RNA 바이러스 12-16의 게놈에 존재하는 고전적인 서명 구조 베어링 가닥 (DS) RNA. RIG-I 활성화의 두 가지 주요 특성은 닫힌 형태 6,17 및 호모 올리고머 6,18,19로 전환합니다. 구조적 스위치, RNA 바인딩 향상 다운 스트림 신호의 카드를 노출하고 활성 ATP 아제 사이트 8,9,11,20을 재구성한다. 올리고머 RIG-I 복합체의 형성은 항 바이러스 신호 전달 (11)를위한 플랫폼을 형성하도록 하류 시그널링 어댑터 분자의 향상된 모집에 이르게한다. RIG-I-조절 신호 체인은 결국 전사 인자를 활성화 IRF-3 위로 규칙 전체 바이러스 반응 (21, 22)에 대한 인터페론 (IFN-alpha/beta) 유전자와 인터페론 자극 유전자의 따라서 유전자 발현 (ISGs)의 . 최고의 특성화 ISGs 중 하나는 RNA 활성화 PROTEI입니다N 키나제 (PKR) 23. PKR은 진핵 번역 개시 인자 2 알파 (eIF2α) 키나아제의 가족에 속하는 N-말단 이중 가닥 RNA 결합 도메인과 C-말단 키나제 도메인으로 구성되어 있습니다. 키나아제는 PKR 활성화를위한 이량 인터페이스 중요한 구성하고 단백질의 촉매 기능을 수행한다. 바이러스를 dsRNA에 PKR의 바인딩의 구조적 변화가 다른 잔류 물 사이의 Thr 446에 이합체 및 자동 인산화를 허용로 연결됩니다. PKR는 따라서 바이러스의 mRNA 23-27의 번역을 차단 eIF2α의 인산화를 중재. RIG-I와 PKR 모두 주요 구조 재 배열을 받아야 올리고머 단지를 형성하고 포스트 병진 인산화 / 탈 인산화와 유비퀴틴 10,11,19,23,24,26-29에 의해 수정됩니다. 바이러스 성 RNA의 구조는 RIG-I과 PKR 활성화 (그리고 어떤 단계에서 바이러스 성 길항제 ㄴ 수있는의 더 나은 이해를위한E) 간섭, 그것은 정확하게 활성화 상태를 결정하는 것이 중요하다. 모두 PRRS를 위해 이전에 활성화가 트립신 내성 단백질 조각 6,17,30 및 고차 올리고머 6,18,19의 출현에 이르게 설명했다. 그러나, 항 바이러스 호스트 응답 1,2,24 이러한 핵심 요소에 대한 문학의 재산을 주어, 직접 방법의 응용 프로그램은 비교적 드문 것 같다. 광범위한 사용을 촉진의 희망, 우리는 견고 RIG-I와 PKR의 활성화 상태를 분석 할 수있는 편리하고 민감한 프로토콜을 제공합니다. IFN 유능한 인간 세포주 A549은 RIG-I과 PKR, 감쇠 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) (31, 32)의 설립 활성화에 감염된다. 간단한 용해하는 과정을 거친 후, 감염된 세포의 추출물 구조적 전환을 평가하기 위해 제한된 트립신 소화 / 웨스턴 블롯 분석에 의해 테스트되고 파란색 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE) / 웨스턴 블롯 분석가로올리고머의 형성을 측정하는 것이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="320">
	<tbody>
		<tr height="43" style="height:32.25pt">
			<td class="xl66" height="43" style="height:32.25pt;width:60pt" width="80">Name</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Company</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Catalog Number</td>
			<td class="xl67" style="width:60pt" width="80">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">cell culture</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">21969-035</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">OptiMEM</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">31985-47</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl72" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">L-glutamine</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25030-024</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl72" height="61" style="height:45.75pt;width:60pt" width="80">penicillin-streptomycin</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">15070-063</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl73" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">fetal calf serum (FCS)</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">PAA</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">10270</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl70" style="width:60pt" width="80">Gibco</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">25300-054</td>
			<td class="xl71" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">chemicals</td>
			<td class="xl76" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="190" style="height:142.5pt">
			<td class="xl73" height="190" style="height:142.5pt;width:60pt" width="80">L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone-treated (TPCK) trypsin</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">T1426</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80"></td>
		</tr>
		<tr height="22" style="height:16.5pt">
			<td class="xl68" height="22" style="height:16.5pt;width:60pt" width="80">antibodies</td>
			<td class="xl78" colspan="3" style="border-right:1.0pt solid black;
 border-left:none;width:180pt" width="240"></td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-RIG-I antibody (ALME-1)</td>
			<td class="xl74" style="width:60pt" width="80">Enzo Life Sciences</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">ALX-804-849-C100</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-PKR (B10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-6282</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-PKR (Thr446)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Epitomics</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">1120-1</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 5% BSA in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="64" style="height:48.0pt">
			<td class="xl69" height="64" style="height:48.0pt;width:60pt" width="80">rabbit polyclonal anti-IRF-3</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Santa Cruz</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">sc-9082</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:500 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl69" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">rabbit monoclonal anti-P-IRF-3 (Ser386)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">IBL</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">og-413</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:100 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="126" style="height:94.5pt">
			<td class="xl81" height="211" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 height:158.25pt;border-top:none;width:60pt" width="80">rabbit anti-RVFV hyperimmune serum &#34;C2&#34; (MP-12)</td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl82" rowspan="2" style="border-bottom:1.0pt solid black;
 border-top:none;width:60pt" width="80"></td>
			<td class="xl75" style="width:60pt" width="80">Kindly provided by Alejandro Brun (CISA-INIA)</td>
		</tr>
		<tr height="85" style="height:63.75pt">
			<td class="xl65" height="85" style="height:63.75pt;width:60pt" width="80">WB: 1:2.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">mouse monoclonal anti-beta-actin (8H10D10)</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Cell Signalling</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">3700</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:1.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl69" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-rabbit</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">0031460 1892914</td>
			<td class="xl65" style="width:60pt" width="80">WB: 1:20.000 in 1% skim milk in TBS</td>
		</tr>
		<tr height="106" style="height:79.5pt">
			<td class="xl64" height="106" style="height:79.5pt;width:60pt" width="80">polyclonal peroxidase-conjugated goat anti-mouse</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">Thermo Fisher</td>
			<td class="xl63" style="width:60pt" width="80">0031430 1892913</td>
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monitoring activation of the antiviral pattern recognition receptors rig-i and pkr by limited protease digestion and native page

바이러스 감염에 대한 숙주 방어는 타고난 면역 시스템의 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의한 신속한 검출에 따라 달라집니다. 세포질에서, PRRS RIG-I 및 특정 바이러스 성 RNA의 리간드 PKR 바인딩. 이것은 첫 번째 구조적 전환 및 올리고머를 중재하고 항 바이러스 인터페론 반응의 활성화를 가능하게한다. 바이러스 숙주 유전자 발현을 측정하는 방법은 잘 확립되어 있지만, 직접 RIG-I 및 PKR의 활성 상태를 모니터링하는 방법은 부분적으로 만 이하이며 잘 확립. 여기, 우리는 설립 인터페론 유도, 리프트 밸리 열병 바이러스 돌연변이 클론 13 (망할 CIA 13) 감염시 RIG-I과 PKR 자극을 모니터링하는 두 가지 방법을 설명합니다. 제한 트립신 소화 PRRS의 구조적 변화를 나타내는 단백질 분해 효소의 감도 변화를 분석 할 수 있습니다. RIG-I과 PKR, wherea의 급속한 저하의 모의 감염된 세포 결과에서 해물의 트립신 소화망할 CIA의 13 감염은 단백질 분해 효소 내성 RIG-I 조각의 출현에 이르게한다. 또한 PKR은의 Thr 446에 그것의 특징 인산화와 일치 트립신 소화에 바이러스에 의한 부분적인 저항을 보여줍니다. RIG-I과 PKR 올리고머 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해 확인 된의 형성. 이 단백질은 모의 감염된 샘플 단량체로 남아있는 반면 감염되면, RIG-I과 PKR 올리고머 단지의 강한 축적이있다. 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지는 RIG-I과 PKR 활성화의 두 다양한 단계의 민감하고 직접 측정을 허용, 웨스턴 블롯 분석을 결합 둘. 이 기술은 상대적으로 쉽게 수행 할 수 신속하고 고가의 장비를 필요로하지 않습니다.

RIG-I 또는 PKR에 의한 바이러스 성 작용제의 인식은 구조적 전환 6,17,30 및 올리고머 6,18,27를 트리거합니다. 우리는 각각 제한된 단백질 분해 효소의 소화와 네이티브 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기 영동 (PAGE)에 의해이 두 활성화 마커를 정량. 인간의 A549 세포는 IFN 길항제 NSS (35, 36)의 돌연변이에 의해 특징 리프트 밸리 열병 바이러스의 복제 13 (망할 CIA...

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Monitoring Activation of the Antiviral Pattern Recognition Receptors RIG-I And PKR By Limited Protease Digestion and Native PAGE

바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다.

항 바이러스 패턴 인식 수용체 RIG-I와 PKR에 의해 제한 프로테아제 소화 및 기본 페이지의 모니터링 활성화

Host defenses to virus infection are dependent on a rapid detection by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system. In the cytoplasm, ...

monitoring-activation-antiviral-pattern-recognition-receptors-rig-i

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K 조회수.  Philipps-University Marburg.  바이러스 감염에 타고난 방어는 패턴 인식 수용체 (PRRS)에 의해 실행됩니다. 두 세포질 PRRS RIG-I과 바이러스 서명 RNA를 변경 형태, 올리고머, 항 바이러스 신호를 활성화하기 위해 PKR 바인딩. 방법은 편리한 구조적인 스위칭 및 이러한 세포질 PRRS의 올리고머를 모니터링 할 수있는 기술되어있다. 

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Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In genetically predisposed individuals, tTG2 triggers autoimmune responses that are characterized by the production of tTG2 antibodies and their direct deposition into small intestinal wall 1,2. The presence of such antibodies constitutes one of the major hallmarks of the celiac disease (CD). Epidermal transglutaminase (eTG) is another member of the transglutaminase family that can also function as an autoantigen in a small minority of CD patients. In these relatively rare cases, eTG triggers an autoimmune reaction (a skin rash) clinically known as dermatitis herpetiformis (DH). Although the exact mechanism of CD and DH pathogenesis is not well understood, it is known that tTG2 and eTG share antigenic epitopes that can be recognized by serum antibodies from both CD and DH patients 3,4.
In this study, the confocal microscopy examination of biopsy samples from skin lesions of two rhesus macaques (Macaca mulatta) with dermatitis (Table 1, Fig. 1 and 2) was used to study the affected tissues. In one animal (EM96) a spectral overlap of IgA and tTG2 antibodies (Fig. 3) was demonstrated. The presence of double-positive tTG2+IgA+ cells was focused in the deep epidermis, around the dermal papillae. This is consistent with lesions described in DH patients 3. When EM96 was placed on a gluten-free diet, the dermatitis, as well as tTG2+IgA+ deposits disappeared and were no longer detectable (Figs. 1-3). Dermatitis reappeared however, based on re-introduction of dietary gluten in EM96 (not shown). In other macaques including animal with unrelated dermatitis, the tTG2+IgA+ deposits were not detected. Gluten-free diet-dependent remission of dermatitis in EM96 together with presence of tTG2+IgA+ cells in its skin suggest an autoimmune, DH-like mechanism for the development of this condition. This is the first report of DH-like dermatitis in any non-human primate.

Recognition of Epidermal Transglutaminase by IgA and Tissue Transglutaminase 2 Antibodies in a Rare Case of Rhesus Dermatitis

Dermatitis herpetiformis (DH) is a chronic inflammatory condition characterized by an autoimmune reaction between IgA and epidermal transglutaminase (eTG). DH develops in a very small portion of gluten-sensitive and/or celiac patients. The results of this study indicate that DH can also develop in a rhesus monkey host with symptoms of idiopatic dermatitis.

의 드문 경우에 이가와 조직 Transglutaminase이 항체에 의해 표피 Transglutaminase의 인식 붉은 털원숭이 피부염

Tissue transglutaminase 2 (tTG2) is an intestinal digestive enzyme which deamidates already partially digested dietary gluten e.g. gliadin peptides. In ...

연구

면역학 및 감염병학

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

C 형 간염 바이러스에 대한 인간 락토페린의 세포 흡수 및 관련 바이러스 활동을 모니터링하는 면역 형광

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

초기 바이러스 성 항목 식별을위한 분석 실험 및 항 바이러스 화합물의 평가

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em마우스 소장 Organoids의&gt; 문화 및 패턴 인식 수용체 자극

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors (PRRs) such as the retinoic acid (RIG-I) like receptors (RLRs) RIG-I and melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA-5) leads to the induction of the innate immune response. The formation and intracellular distribution of dsRNA in positive-sense RNA virus infection has been well characterized by microscopy. Many negative-sense RNA viruses, including some arenaviruses, trigger the innate immune response during infection. However, negative-sense RNA viruses were thought to produce low levels of dsRNA, which hinders the imaging study of PRR recognition of viral dsRNA. Additionally, infection experiments with highly pathogenic arenaviruses must be performed in high containment biosafety level facilities (BSL-4). The interaction between viral RNA and PRRs for highly pathogenic RNA virus is largely unknown due to the additional technical challenges that researchers need to face in the BSL-4 facilities. Recently, a monoclonal antibody (Mab) (clone 9D5) originally used for pan-enterovirus detection has been found to specifically detect dsRNA with a higher sensitivity than the traditional J2 or K1 anti-dsRNA antibodies. Herein, by utilizing the 9D5 antibody, we describe a confocal microscopy protocol that has been used successfully to visualize dsRNA, viral protein and PRR simultaneously in individual cells infected by arenavirus. The protocol is also suitable for imaging studies of dsRNA and PRR distribution in pathogenic arenavirus infected cells in BSL4 facilities.

Double-stranded RNA produced during RNA virus replication can be recognized by pattern recognition receptors to induce an innate immune response. For negative-sense RNA viruses, the interaction between the low-level dsRNA and PRRs remains unclear. We have developed a confocal microscopy method to visualize arenavirus dsRNA and PRR in individual cells.

이중 가닥 RNA와 패턴 인식 수용 체 부정적인 감 RNA 바이러스 감염에의 confocal 영상

Double-stranded (ds) RNA is produced as a replicative intermediate during RNA virus infection. Recognition of dsRNA by host pattern recognition receptors ...

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

확산의 분석 및 형광 현미경 검사 법에 의해 수용 체 막의 클러스터 크기에 대 한 프로토콜을 처리 하는 이미지

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...