시투 혼성화에서 발색성 HPV 관련 두경부 암 진단을 위한 도구

HPV RNA CISH는 활성 인간 유두종 바이러스 감염의 검출을 허용합니다. 시내 혼성화가 HPV RNA를 표적으로 하기 때문에 이 기술은 바이러스의 활성 전사의 시각화를 허용한다. 그것은 정확한 공간 해상도와 좋은 진단 성능을 가지고있다.

HPV의 검출은 구인두 편평상피 세포 암 또는 자궁 경부 신생물과 같은 몇몇 HPV 관련 병변의 진단을 지원할 수 있습니다. 그것은 또한 예후에 영향을 미칠 수 있습니다. 버퍼 및 반염색 시약을 준비한 후, 증류수 630밀리리터에 10배 표적 검색 시약 70밀리리터를 추가하여 대형 비커에 1개의 표적 검색 시약을 준비합니다.

비커를 자기 교반기로 가열 판에 놓고 알루미늄 호일로 덮습니다. 10~15분간 100°C로 끓여서 30분 이상 끓이지 않도록 하십시오. 이전에 분리되고 슬라이드 랙에 배치 된 조직 섹션이있는 슬라이드에서 과산화효소 활동을 차단하려면 4 ~ 6 방울을 추가하여 샘플을 덮을 만큼 충분한 4 ~ 6 방울을 추가하고 각 슬라이드에 과산화수소의 수소를 덮고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.

실온에서 증류수로 2분간 슬라이드를 2회 세척합니다. RNA 조직 단면에서 RNA 조직 경계를 분해하기 위해 먼저 발톱을 사용하여 1 x TRR의 끓는 알루미늄 호일을 제거하고 교반을 중지합니다. 슬라이드 랙을 천천히 매우 신중하게 담그십시오.

비커를 알루미늄 호일로 다시 덮고 15분간 배양합니다. 발톱을 사용하여 뜨거운 슬라이드 랙을 증류수 욕조로 즉시 옮기고 2 분 동안 씻으십시오. 슬라이드를 신선한 100% 에탄올로 2분간 세척하고 실온에서 2분간 건조시키세요.

다음으로 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 샘플 주위에 장벽을 그리고 적어도 5 분 동안 건조시키십시오. 프로테아제 소화의 경우, 슬라이드를 습도 제어 트레이에 넣고 샘플당 약 4방울의 프로테아제 플러스를 추가합니다. 트레이를 뚜껑으로 덮고 섭씨 40도에서 30분 동안 혼성화 오븐에 삽입합니다.

오븐에서 트레이를 제거하고 슬라이드 랙을 제거합니다. 한 번에 하나의 슬라이드를 작동하고, 여분의 액체를 신속하게 제거하고, 증류수로 채워진 염색 접시에 잠긴 슬라이드 랙에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드를 2분간 실온에서 증류수로 2분간 계속 세척합니다.

혼성화를 시작하려면 슬라이드를 탭하고 쓸어 넘기면 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 배치합니다. 오븐에서 미리 데워진 HPV 프로브를 제거하고 각 섹션을 완전히 덮기 위해 약 4 방울을 추가합니다. 트레이를 뚜껑으로 덮고 섭씨 40도에서 2시간 동안 오븐에 삽입합니다.

인큐베이션을 완료한 후 오븐에서 트레이를 제거하고 슬라이드 랙을 제거합니다. 한 번에 한 번의 슬라이드를 한 번에 한 번 미끄럼 처리하여 여분의 액체를 신속하게 제거하고 슬라이드랙에 슬라이드를 1x 세척 버퍼로 채워진 염색 접시에 담고, 상온에서 2 분 동안 슬라이드를 일정한 교반으로 세척하고 신선한 1 x 워시 버퍼로 반복하십시오. 슬라이드에서 여분의 액체를 제거하고 다시 슬라이드 랙에 배치하려면 탭하고 쓸어 넣습니다.

섹션당 약 4방울의 실온 AMP1을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 트레이를 뚜껑으로 덮고 섭씨 40도에서 30분 동안 오븐에 삽입합니다. 오븐에서 트레이를 제거한 후 슬라이드 랙을 제거합니다.

한 번에 하나의 슬라이드를 작동하고, 여분의 액체를 신속하게 제거하고, 슬라이드랙에 슬라이드를 1개의 세차 버퍼로 채워진 염색 접시에 담그고, 상온에서 2분 동안 일정한 교반으로 세척하고, 신선한 1x 워시 버퍼로 반복합니다. 각 DAB-A 및 DAB-B 용액의 동일한 수의 방울을 적절한 크기의 튜브에 분배하여 섹션당 약 120마이크로리터의 DAB 기판 및 소용돌이를 만듭니다. 슬라이드 랙에서 한 번에 하나씩 각 슬라이드를 가져 와서 탭하고 플릭하여 여분의 액체를 제거하고 슬라이드 랙에 다시 놓습니다.

각 조직 섹션에 DAB 혼합물의 약 120 마이크로 리터 파이펫, 섹션이 덮여 있는지 확인. 실온에서 10분 동안 인큐베이션을 하고 카운터스테인링을 진행합니다. 유리 칸막이당 중간 크기의 1방울을 놓고 칸막이를 슬라이드에 놓고 공기 건조시키세요.

몇 시간 후, 원고에 설명된 바와 같이 광학 현미경을 사용하여 평가를 진행한다. 여기에 설명된 바와 같이 머리와 목 편평세포 암, 세포질 또는 종양 세포의 핵에서 염색하는 갈색 펑크형태의 존재는 양성 사례를 정의하였다. 결과는 20배 의 목표로 관찰된 바와 같이 RNA CISH 높고 낮은 점수인 2개의 점수로 나뉘었다.

RNA CISH 점수 염색은 종양 세포의 50% 미만에서 관찰될 때 낮은 것으로 간주되고 세포 표면의 80% 미만을 커버합니다. 한편, RNA CISH 점수는 염색된 암세포의 50% 이상에서 관찰될 때 높으며, 또는 종양 세포의 30% 이상에서 80%를 초과하는 염색 표면을 갖는다. 하이브리드화를 위해 슬라이드를 건조하게 해서는 안됩니다.

프로브를 예열하는 것을 잊지 마십시오. 각 샘플에 대해, RNA의 품질을 평가하기 위해 양성 및 음수 제어를 수행한다.