이 작품은 VENOMICS 프로젝트, 일곱 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7 건강 2,011에서 2,015 사이)을 통해 278,346 ° 유럽 프로젝트 보​​조금 N에 의해​​ 지원되었다. VENOMICS 프로젝트는 유럽의 여러 연구 기관과 기업 간의 협력입니다 : AFMB, 엑상 프로방스, 마르세유 대학교 (프랑스), CEA 클레 (프랑스), NZYTech (포르투갈), SistemasGenomicos (스페인), 대학 드 리에 주 (벨기에), VenomeTech (프랑스), Vitamib (프랑스), 뉴질랜드 제약 (덴마크) 이 작품은 통합 구조 생물학 (FRISBI) ANR-10-된 InSb-05-01 프랑스의 인프라에 의해 지원되었다. 저자는 또한 비디오의 촬영을위한 준비를 지원 씨 제레미 Turchetto에게 감사의 말씀을 전합니다.

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	<li>Berrow, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+protein+expression+and+solubility+screening+in+Escherichia+coli:+a+comparative+study.">Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).</li><li>Correa, A., Oppezzo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+different+expression+parameters+to+achieve+soluble+recombinant+proteins+in+E.+coli:+advantages+of+high-throughput+screening.">Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening.</a> Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5, 135-146 (2008).</li><li>Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+conformational+quality+of+insoluble+recombinant+proteins+is+enhanced+at+low+growth+temperatures.">The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures.</a> Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).</li><li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+systematic+N-+and+C-terminal+deletions+to+promote+production+and+structural+studies+of+recombinant+proteins.">The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins.</a> Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).</li><li>Bird, L. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

가용성, 접힘, 기능성 단백질의 발현에 대한 하나의 보편적 인 프로토콜이 없습니다. 비용 및 시간 효율적일 여러 대상 작업 대부분의 실험실 또는 단백질 코어 설비 따라서 표적 대부분 수용성 활성 단백질을 얻기 변수 유용한 &#39;일반적인&#39;조합을 찾기 위해 선별 높은 처리량 단백질 발현을 사용하세요. 우리는 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질 11의 수용성 발현에 일반적으로 적용 융합 파트너 것으로 DsbC을 발견했습니다. DsbC 융합 및 높은 처리량 방법을 사용하여, 주 내에서 여러 대상의 가용성 식 (11)을 관찰 할 수있는 다음과 같은 소개에서 논의 된 것과 같은 추가적인 변수는 더 최적화가 필요한 대상에 대한 후속 라운드에서 상영 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 이황화 풍부한 단백질과 펩타이드의 발현을 목표로하고 있습니다. 그러나, 사용자의 특급하고자하는높은 처리량 방식으로 RESS 비 그물 단백질은 해당 프로토콜은 이전에 발표 된 다른 곳에서 (22, 24)을 발견 할 수있다. 높은 처리량 설정이 용해 식 또는 동시에 여러 표적 유전자에 대한 (다양한 융합 태그 포함) 식 구조의 많은 수의 검사에 대한 다른 많은 단백질의 심사를 포함하여 응용 프로그램의 수, (이상적입니다 또는 여러 식은 성공률을 향상시키기 위해 단일 ​​대상)에 대한 구성한다. 이 플랫폼은 또한 대상의 많은 수의 새로운 프로토콜의 벤치마킹 및 유효성 검사에 사용할 수 있습니다. 다른 응용 프로그램은 하나의 어려운 대상에 대한 변형 검사, 예를 들어, 모든 orthologs 또는 같은 가족의 구성원, 또는 실험에서 단일 대상의 돌연변이의 패널 생산의 성공을 테스트 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 공동 발현 벡터 (위트와 조합하여 사용되어왔다H의 하나는 아래로 당겨 올바른 복합체 형성과 화학 양론 (33)를 확인하기 위해보다 철저한 생물 물리학 적 분석에 의해 다음에 단백질 - 단백질 복합체의 예비 특성을 허용하는) 유일한 단백질을 태그. 정제 된 단백질의 양은 마이크로 분석법 (기능 시험, 단백질-DNA (34) 또는 단백질 - 단백질 상호 작용 분석) 때로는 적합하다. 높은 처리량 발현 스크리닝 전략 몇 가지 장점이있다 : (ⅰ) 대상의 다수를 테스트 할 수있는 능력 또는 번의 ​​실험에서 많은 변수, (ⅱ) 제한된 배치 별 편차, (ⅲ)는 단순하고 (V) 자동화를위한 잠재력 및 추적 (VI) 단순, 더 큰 규모로 깊은 우물, (IV) 확장 성 및 재현성을 사용하여 작은 규모에서 일하는 개별 튜브 (레테르를 붙이기, 이하 취급하지의 용이성 ) 혼합 개별 튜브의 취급보다 플레이트 형식을 사용하거나 클론의 교환 할 때 도입 실수. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 프로토콜 절에서 논의되지 않지만, 아래에서 간략하게 설명되는 실험의 준비를위한 몇 가지 중요한 고려 사항이있다. 논의에 대한 더 많은 우리의 이전 출판 (24)를 참조하십시오. 최대 효율성을 위해, 그것은 대상의 다수의 하위 복제를 단순화하기 위해, 높은 처리량 복제에 적합한 시스템을 가지고 도움이됩니다. VENOMICS 프로젝트의 초기 단계를 위해, 우리는 일주일에 클론의 수백의 속도로 모든 대상 벡터에 서브 클로닝을 허용하는 다양한 게이트웨이 재조합 시스템 (25)을 사용한다. 게이트웨이 재조합 복제에 대한 프로토콜은 인비 트 로젠의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 높은 처리량 복제에 대한 다른 대안은 37 복제 내고 독립적 인 복제 (LIC) (35, 36)과 제한없는 (RF) 등이 있습니다. 항목 클론 컬렉션에서, 주형 DNA에서 PCR에 의해 포함, 표현의 대상 유전자를 얻기 위해 여러 가지 방법이 있습니다 또는VENOMICS 프로젝트를 위해 선택한 전략 합성 유전자,. 합성 유전자는 유전자 및 유전자 합성의 각 끝에 재결합 사이트로 주문할 수 있습니다 표적 유전자 서열의 쉬운 코돈 최적화 (희귀 대장균 코돈을 제외 할) 수 있습니다. 이 권장되지만 필수되지 않습니다. 희귀 코돈의 높은 숫자, 로제 2 (매우 대장균에서 발현되지 않는 희귀 코돈에 tRNA에 탑재) (DE3) pLysS를을 포함 코돈 최적화하지 않고 대상의 BL21 (DE3) pLysS를보다 더 적합 할 수있다. 세포질의 일반적으로 감소 환경에서 이황화 결합의 감소를 제한하는 것이 가능한 변종이 있지만, 우리 손에 그들은 일반 E.만큼 성공하지 않은 콜라이 11 균주. 분석 규모의 친화력 정화는 수용성 융합 단백질을 복구하고 수율을 정량화하기 위해 테스트 식의 문화에서 수행됩니다. 정량적 데이터는 일에 얻을 수있다문화가 100 ㎎ / L - 0.1의 범위로 표현되는 융합 단백질의 전자 수용성 수율. 대상이 용해되지 않으면 다른 융합 파트너를 추구하기 전에, 다른 표현과 유도 온도, 변형 또는 매체를 테스트 할 수 있습니다. 이황화 풍부한 단백질의 수용성 발현을 위해, 우리는 이전에 세포질 식 11 DsbC&gt; DSBA&gt; GST&gt; MBP&gt; TRX는&gt; HIS 태그로 융합 파트너의 효과를 평가했다. 세포질 표현은 이황화 풍부한 대상의 성공 접는 도움을 수있는 또 다른 가능성이다. 주변 세포질 세포질보다 덜 감소 환경 및 이황화 결합을 지원하기 위해 유용한 산화 환원 보호자를 포함한다. DsbC, DSBA 및 MBP 단백질은 일반적으로 자신의 주변 세포질 신호 서열에 의해 세포질로 지역화됩니다. 이 폴딩을 지원하기 위해 주변 세포질 공간 이황화 풍부한 대상을 지시하는 이러한 태그를 악용 할 수있는 기회를 제공합니다. 난치성 목표 들어, 다음 단계는 P로 될(이것은이 프로토콜의 범위를 벗어난 것으로 여기에 3 구를 논의하지 않을 것이다) 용해 및 접힘, 봉입체에서 불용성 HIS-태그 목표를 urify. 이것은 단지 하나 또는 두 개의 디설파이드 결합을 갖는 대상에 대해 매우 간단하지만, 이황화 결합의 수가 증가함에 따라 점점 더 어려워지고있다. 다른 방법으로, 특히 네 개 이상의 이황화 결합과 단백질 및 펩티드, 그것은 효모, 곤충이나 포유류의 표현으로 복잡한 생산 시스템을 시도 도움이 될 수 있습니다. 소형화 및 자동화의 발전과 함께, HTP의 전기 생리학 실험실 - 온 - 칩 기술 (28)는 의심 할 여지없이 기능 분석을위한 미래의 방법이 될 것입니다. 우리는 (아마도 구조적 연구 제외)이 대규모 배양의 필요성을 부정한다 대부분의 목적을 위해 그것을 직시. 작은 규모의 문화 표현의 조건을 심사하는 데 유용 할뿐만 아니라, SUF를 제공 할 수있을 것뿐만 아니라ficient이 소형화 기능 분석을위한 시료의 양은. 기능적 특성화를 위해 충분한 양으로 평행하게 복수의 타겟을 생산하는 능력이 배양 및 플랫폼의 이러한 종류를 사용하여 비용을 절감하고, 재조합 단백질의 발현 및 특성화 추가 비용 및 시간 효율적인해질 것이다. 프로토콜은 여기에 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트의 초기 단계에서 이황화 풍부한 펩타이드와 단백질의 발현에 적용되었습니다. 독은 종종 흥미로운 약물 가능성이 생리 활성 펩타이드의 훌륭한 소스입니다. 그러나, 그들의 생산 인해 복잡한 이황화 결합 패턴과 작은 크기에 도전합니다. 본원에 기술 된 것과 같은 고 처리량의 플랫폼을 사용하여, 프로젝트 VENOMICS 자연에서 볼 다양성을 재현하기 만 신규 독 펩티드 라이브러리를 생성하는 것을 목표로하고있다. 이 라이브러리는 이황화-R의 특성을 위해 이용 될 것입니다신약 개발을 목표로 잠재적 인 약물이나 치료 응용 프로그램과 무형 문화 유산 펩티드. 이 플랫폼은 현재 VENOMICS의 프로젝트에서 사용하기 위해 새로운 프로토콜을 벤치마킹하고 유효성을 검사하는 데 사용하고있다.

유전체학의 발전과 새로운 단백질의 발견의 빠른 속도에 의해 동기 부여, 높은 처리량의 파이프 라인 검사 및 최적의 단백질 생산 전략의 식별을위한 전통적인 접근 방식을 병렬 처리하기 위해 개발되었습니다. 최적화 될 가능성이 변수는 다른 표정이 대상이 샤페론 14,15 함께 5, 융합 파트너 6-13 공동 발현을 변형, 1,2, 3,4 온도, 미디어 2,3 균주 세포질, 포함 하나 이에 한정되지 않는다 또는 세포질 표현 16-18, 정제 버퍼 구성 요소 3. 배치 별 편차를 제한하면서, 높은 처리 방법, 다양한 변수 또는 여러 표적 높은 수준의 효율성과 병렬로 테스트 할 수있는 구현을 따라. 우리의 경험, 전략은 동일한 문화 (온도, 미디어, 통풍 등), 정제 조건 (같은 집용을 사용하여 규모 확대에 따라 재현성을 제공합니다N, 완충제 등). 여러 높은 처리량 플랫폼, 즉 같은 융합 파트너, 표현의 변종 또는 온도 19 ~ 23 등 다양한 매개 변수를 통해, 수용성 단백질 발현을위한 조건을 식별하기 위해 지난 10 년간 사용되어왔다. 우리는 최근에 용해 이황화 풍부한 단백질 11의 발현에 대한 우리의 높은 처리량 검사 방법을 사용했다. 선택된 단백질은 악의에 찬 소스에서뿐만 아니라이었다, 또한 식물, 돼지, 소와 인간을 포함한 종의 넓은 범위에서 이황화 풍부한 효소 억제제가 포함되어 있습니다. 실험은 12 다른 융합 파트너 및 28 이황화 망상 단백질의 용해도 및 폴딩에 3 개의 다른 발현 균주의 효과를 비교했다. 우리는 스트레인 BL21의 생산을위한 융합 파트너 (DE3)로 DsbC를 사용 pLysS를 크게 outproduced (얻은 수용성 단백질의 수율과 수 모두에서) 긴장과 융합의 다른 조합이 11 테스트 것을 보여 주었다.이 실험의 결과는 이황화 풍부한 표적 발현 더 적합 하나에 (단백질의 넓은 범위의 발현 스크리닝에 사용되었다) 오리지널 일반 높은 처리 파이프 라인 (22, 24)를 적응시키기위한 기초를 형성했다. 동물의 독에서 이황화 풍부한 단백질은 특별한 관심입니다. 독은 약리 및 치료 적으로 잠재적 인 가치로, 생리 활성 펩타이드와 단백질의 복잡한 혼합물이다. 그러나, 이황화 결합을 포함하는 단백질의 발현은 간단하지 않습니다. 이 단백질은 일반적으로 일곱 이황화 결합을 하나 사이에 포함하고 활성화하기 위해 올바른 이황화 결합 패턴과 산화해야합니다. 현재 플랫폼은 FP7 유럽 VENOMICS 프로젝트 (www.venomics.eu)의 일부로 이황화 풍부한 동물 독 많은 단백질의 발현을 심사 및 대상의 수천의 높은 처리량의 표현에 대한 새로운 프로토콜을 벤치마킹하는 데 사용되는 . 여기서, 자동화 된 방법높은 처리량 소규모 발현 검사 및 정화 (그림 1 참조)에 제공된다 이황화 풍부한하는 동물 독 단백질을 적용했다. 이황화 풍부한 펩타이드 및 단백질에 대한 전략은 표적 단백질을 분해 될 HIS-DsbC 융합을 만드는 정화 및 산화 환원 활성 융합 파트너, DsbC위한 HIS 태그를, (그림 2 참조)를 사용합니다. 프로토콜의 초점은 본원 액체 핸들링 로봇과 HTP 전기 영동을 사용하여 자동화 있지만, 이들 방법은 기본 설정과 심지어 연구소 고가의 장비에 대한 전제 조건없이 프로토콜을 활용할 수 있다는 것을 의미 또한 높은 처리량 수동 방식에 적합 . 정제 및 분석 (이황화 풍부한 단백질에 특정하지 않음)로 변환을위한 수동 프로토콜은 다른 곳에서 24 게시 된 여기 반복하지 않는다. 재조합에 의해 생성 된 표현 클론의 수동 절차의 처리량 (,수용성 단백질 수준의 분석에 국가 복제 25) SDS-PAGE 감지) 또는 384 (4 X 96을 사용하여 (96이다 (그림 1 참조)) 주 문화를 점 오점 및 SDS-PAGE (26)를 사용하여. (예 캘리퍼스 GXII LabChip 시스템 (22)과 같이, 액체 핸들링 로봇 (26) 및 도트 블롯 또는 HTP 전기 영동을 사용하여 반자동 방식으로 수행 경우에 증가 될 수있다 여기에 설명 된대로 일주에 병렬로 최대 1,152 (12 × 96) 문화에 대한 결과)의 분석. 일정한 진탕 인큐베이터 충분한 통기 짧은 궤도 고속 진탕 배양기의 사용을 필요로 96 (DW96) 포맷 (진탕 디프 웰에서 성장 배양 달리 사용될 수 있도록 배양은 디프 웰 24 (DW24) 형식으로 수행 800 rpm에서). 자동 유도 매체 (27)의 사용은 또한 수동 유도 단계를 제거 식을 단순화한다. 연구소는 이미 사전 정의 된 표현과 푸리를 사용하는 경우에도문법을 없애는 조건, 이들은 단순히 효율을 향상시키기 위해 본 HTP 시스템으로 직접 전달 될 수있다. 이황화 풍부한 단백질에 대한 높은 처리량 스크리닝 파이프 라인의 상세한 회로도는도 3에 제공된다. 파이프 라인의 파라미터주세요 단백질 생산을위한 가장 유용한 조건을 선택하도록 허용 광범위한 스크리닝 실험 11, 22에 기초하여 선택 하였다. 특성은 샘플의 마이크로 그램 수십 충분한, 또는 민감한 기능 분석 및 결합 분석 (예를 들어, 낮은 볼륨 HTP 패치 클램프 시스템 28)을위한 것입니다 파일럿 연구에서 작은 규모의 표현에서 직접 정제 태그 단백질에서 수행 할 수 있습니다. 동일도 태그와 프로테아제 (역상 HPLC에 의해, 예를 들어) 제거 제공, 벽개 후에 태그가 대상에 수행 될 수있다. 품질 관리도 (예상 크기 및 산화 성을 확인하기 위하여 질량 분석계에 의해 수행 될 수있다ATE) 또는 크로마토 그래피 방법은 () 29 순도 이질성을 확인합니다. 때로는 분열 (특히 난 용성 단백질 30, 31에 대한) 불필요한 또는 바람직하지 않은 태그를, 그래서이 프로토콜의 분열에 선택 사항입니다. 에 관계없이, 모든 구조에 직접 (그림 2 및 토론 참조) 절단 후 기본 단백질을 생산하는 표적 유전자를 이전 TEV 단백질 분해 효소 절단 부위 (ENLYFQ / [G] 32)이있다. 융합 태그의 절단을 원하는 경우, 절단 효율을 분석하기 위해 작은 규모 (용출 분획 또는 &#39;열&#39;) 시험 할 수 있으며, 이후의 스케일 업 실험 수율 신뢰성 추정치를 요구하고 구하는 경우의 조건을 최적화한다. 친 화성 정제시 사용하는 구슬의 볼륨에 대한 두 가지 옵션이 실험의 목적과 기대에 따라이 있습니다. (파일럿 또는 MS 분석을 위해 정제 또는 extrapol 극력 단백질을 포착 할 수있는) 스케일 업 수율 먹은 수지의 200 μL의 최종 볼륨이 시스템의 포화 전에 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 허용, 사용되어야한다) 제 8.1 (프로토콜 (A 참조) . 실험의 목적은 수용성 단백질의 낮은 양의 검출 된 경우에는, 그 후에 수지의 50 μL의 최종 부피는 (B (프로토콜 참조 0.1-25 ㎎ / L 배양의 범위에서 가용성 단백질의 검출을 가능하게 적합 ) 8.2 절에). 필요한 경우 생산 수용성 발현을 확인 조건을 사용하여 더 구조 및 기능 연구에 정제 대상 밀리그램 수량을 얻기 위해, 확장 할 수 있습니다. AFMB에서 사용 스케일 업 프로토콜의 세부 사항은 다른 곳에서 (22, 24) 논의되었다. 실험 설정, 프로토콜 내에서 중요한 단계에 관련된 더 자세한 사항은, 수정 및 문제 해결 및 기술의 한계는 디스크에 제공된다ussion. 실험을 시작하기 전에 설명을 읽어 보시기 바랍니다. 우리는 각 단계에서 90 %의 성공률을 기대할 프로토콜 걸쳐 (예를 들어, 문화의 적어도 90 %는 임의의 소정 단계에 성장한다). 실험의 모든 단계의 성공율이 90 % 아래로 떨어지면 샘플은 폐기되고, 실험은 구조물의 전체 컬렉션에 대해 반복된다. 이것은 시험 단백질에 매우 의존적 일 것이다 그러나이 성공률 등 수용성 단백질 또는 100 %의 효율로 절단 구조의 비율을 표현하는 구문의 수에 적용 할 수 없다. 로봇의 작업 테이블의 셋업에 대한 특정 세부 사항은 다른 작업대 셋업에 필요한 그러나 그들이 적용 할 수있다, (또한 그림 4 참조) 각 프로토콜에 제공됩니다. 로봇 하드웨어 (테칸)는 96 채널 팔 (MCA96), 로봇 매니퓰레이터 (로마) 및 8 채널 액체 처리 헤드 (구성LIHA). MCA96를 사용하는 모든 단계는 LIHA이 단계 사이에 세척 할 필요가 있기 때문에 그들이 오래 걸릴 것이다 MCA96를 사용할 수없는 경우 LIHA를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 로봇이 기술적으로 무균 환경은 아니지만, 항생제를 포함하는 것이 일반적으로 오염이나 불임에 문제가되지 않도록합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&#38;ID=5270&#38;Menu=1&#38;Item=21.1.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PCR (PCR96) plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>652270</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 &#176;C. Use a 1 in 1000 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity</td>
			<td>Greiner Bio-One&#160;</td>
			<td>780270</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression vectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the expression of target constructs. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) pLysS competent cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Or alternative E. coli expression strain of the user&#39;s choice. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breathseal breathable adhesive film</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>676050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine with 96-well plate block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well sterile tissue culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>662165</td>
			<td> 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclaved for sterility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l sterile disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 617</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw</td>
			<td>Infors</td>
			<td>AJ103</td>
			<td>Not essential, a regular shaking incubator can also be used. 
			http://www.infors-ht.com/index.php/en/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtiter plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For glycerol stocks and elution using purification protocol B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For the preparation of glycerol stocks.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 038 616</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape pads&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19570</td>
			<td> 
			http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactinyl</td>
			<td>Orapi Group</td>
			<td></td>
			<td>Or equivalent microbial disinfectant.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZYP-5052 medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>See Table 1 for recipes of components.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity&#160;</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>7701-5102</td>
			<td>Autoclaved for sterility. 
			http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat-bottomed, clear microtiter plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>For absorbance readings. 
			http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reading spectrophotometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional. For measuring OD600nm of cultures.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge with rotor for deep well plates&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Suitable for 3800 x g.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mg/ml in water. Store at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole ACS grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>IX0005-1</td>
			<td>A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates)</td>
			<td>Misonix Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at &#8722;20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2M stock in water, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE or Caliper sample buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binding buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Receiver/Filter Plate 20 &#181;m, 1.8 ml capacity</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740686.4</td>
			<td> 
			http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;l disposable wide bore tips</td>
			<td>Tecan Group Ltd.</td>
			<td>30 050 348</td>
			<td> 
			http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&#38;ID=4118&#38;Menu=1&#38;Item=21.4.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni Sepharose 6 Fast Flow resin</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5318-02</td>
			<td>For purification of target fusion proteins. Store at 4 &#176;C. Wash and equilibrate before use. 
			http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco Etch Virus (TEV) protease</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at &#8722;80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well 0.22 &#181;m filter plate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MSGV N22 10</td>
			<td>Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. 
			http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user&#8217;s discretion.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer and cuvettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZipTip pipette tips</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td>Optional. The type of ZipTip is at the user&#39;s discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. 
			http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author&#8217;s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in e. coli

대장균 (E. 콜라이)는 구조적 및 기능적 연구에 대한 재조합 단백질의 생산에 널리 이용되는 발현 시스템이다. 많은 단백질이 불용성 형태로 표현하기 때문에, 단백질을 정제하는 것은 때때로 도전이다. 어렵거나 여러 대상으로 작업 할 때 그것은 따라서 신속하게 용해 식의 조건을 식별하기 위해 높은 처리량 (HTP) 작은 규모의 단백질 발현 검사 (1-4 ml의 문화)를 사용하는 것이 좋습니다. 실험실의 다양한 구조 유전체학 프로그램 (재조합 단백질의 0.1 ~ 100 ㎎ / L 문화의 범위 내) 양적 HTP 단백질 발현 검사 프로토콜이 단백질의 수천에 구현하고 검증 된 대처하기. 프로토콜은 액체 핸들링 로봇을 이용하여 자동화 된뿐만 아니라 특수 장비없이 수동으로 수행 될 수있다. 이황화 풍부한 독 단백질 얻고있다치료 약물 리드로 자신의 잠재력에 대한 인식을 증가시킨다. 그들은 매우 유력한 선택이 될 수 있지만, 자신의 복잡한 이황화 결합 네트워크는 생산에 도전합니다. FP7 유럽 Venomics 프로젝트 (의 일원으로서 <a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a> ), 우리의 도전은 기능적인 특성에 대한 새로운 독 단백질의 수천을 생산을 목표로 생산 성공 전략을 개발하는 것입니다. 이황화 결합의 이성화 DsbC의 산화 환원 특성에 힘 입어 우리는 E.의 산화, 기능 독 펩타이드의 발현을위한 우리의 HTP의 제작 파이프 라인을 적용 대장균 세포질. 프로토콜은 또한 다양한 디술 풍부한 단백질의 생산에 적용될 수있다. 여기에서 우리는 우리의 파이프 라인은 동물의 독 단백질의 생산에 적용 보여줍니다. 프로토콜이 여기에 설명으로는 수용성 이황화 풍부한 단백질이 일주일에 한 작은 얻을 수 가능성이 높습니다. 비록 작은 스케일에서 회를 사용할 가능성이있다전자 파일럿 연구에서, 또는 민감한 마이크로 분석을위한 특성화, 질량 분석에 의해 산화 상태의 유효성을 검사하는 단백질을 정제.

대표 결과 VENOMICS 파이프 라인 96 이황화 풍부한 단백질의 발현 검사는 그림 6에 나타나있다. 단백질은 다음 잔류 수를 증가 이황화 결합의 증가로 배치되어있다. 펩티드는 HIS 태그와 DsbC 융합 파트너와 세포질에서 발현되었다. 추천하는 배양 조건을 사용하는 경우, (12)의 OD (600)은 일반적으로 달성된다. 펩티드 니켈 친 화성 수지의 50 μL의 최종 부피로 8.2-프로토콜 B를 사용하여 정제하고, 이렇게 ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대는이 실험에서 검출 될 수있다. 도 6a는 캘리퍼스 LabChip 시스템 (절단 전에 융해를 나타내는) 및 융합 단백질 ㎎ / L 배양에서 수득 외삽에 근거 채점 시스템 (0.1-2 ㎎ / L 문화 수준에서, 2 행에서 전기 영동 결과를 나타낸다 10 ㎎ / L 문화, 10 25 ㎎ / L의 문화와 더<html> T가 검출.) 예상대로 절단 DsbC 태그는 일반적으로 오히려 27 kDa의 것보다 약 32 kDa의에서 실행합니다. 마찬가지로, DsbC 융합은 예상보다 높은 약 5 kDa의를 실행합니다. 대상의 많은 우리는 그대로 융합 (상위 대역)을 참조하십시오뿐만 아니라, 융합 파트너는 혼자 (낮은 대역). 이러한 대상의 일부에 대한 배양 조건을 최적화하는 것은 단독 DsbC 최종 수율 증가를 허용 비교 그대로 융합 (상측 대역)의 비율을 향상시킬 수있다. 스코어링은 그대로 융합 수준에 기초한다. 16 96 중 단백질의 융합 수준에서 감지 할 수 없습니다. 이 83 %의 전반적인 성공의 수준에 해당합니다. 감지 할 수있는 80 단백질이 45 2 ㎎ / L의 문화 (56 %)보다 높은 수준에서 검출되었다. (이 예에서 프로토콜 8.2 B ~ 25 ㎎ / L 융합 단백질의 최대 검출 할 수를 사용하더라도) 타겟과의 융합에 따라, 단백질 수율은 2-100 ㎎ / L 배양의 범위에서 일반적이다. t &quot;&gt; 현재 이황화 결합의 수 (그림 (b) 참조)에 의해 성공의 분석은 가장 낮은 성공 수준이 6 이황을 포함하는 대상에 대해 66 %되는, (1과 7 사이) 테스트 이황화 결합의 모든 숫자에 대한 합리적인 성공을 보여줍니다 채권. 등전점 및 잔기의 수 (도 6c에 도시 됨)에 기초하여 식 성공의 분포의 분석은 모두 성공적으로 표현 대상 및 플롯에 걸쳐 흩어져 검출되지 않았다 대상으로, 그 기술에 대한 특정한 바이어스를 보여주지 않는다. 도 6d는 DTT와 함께 샘플의 환원 전후, 단일 목표에 대한 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)로부터 얻어지는 질량 분석 결과의 예를 나타낸다. 일반적으로, 이러한 소모적 질량 분광법 분석 그러나 철저한 demonstratio의 목적으로, (a 감소 시료를 분석 할 필요가없는 것)을 수행 할 필요가 없을 것N 우리는 결과를 모두 보여 주었다. 표시 대상은 4 이황화 결합과 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독 단백질이다. 왼쪽의 스펙트럼은 추가 개입없이 분열과 탈염 후되면서, 이전의 DTT로 감소 단백질에 대한 결과를 보여줍니다. 우측의 스펙트럼은 어떤 과잉 DTT를 제거하는 탈염 하였다 DTT와 함께 환원 후에 단백질을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온이 각 이온의 스펙트럼 지정에 화살표로 표시됩니다은 녹색으로 표시됩니다. 이러한 이온에 대해 계산 된 실험 부모의 대중 (단백질에 대한 이전의 감소 (- DTT)와 감소 (+ DTT) 후) 표에 표시됩니다. 대중 8 다의 질량 차이를 나타낸다 (이전의 감소 및 감소 된 샘플 5717.6 다에 샘플 5709.6 다). 둘 다의 질량의 차이는, 1 산화 이황화 결합의 존재에 대응한다 (예상대로) 따라서 8 다의 질량의 차이는 4 이황화 결합의 존재를 나타내는 소재비 - 환원 샘플. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig1highres.jpg" width="500" /> 설명 반자동 장비 높은 처리량 식 검사 프로토콜의 그림 1. 도식 표현.이 프로토콜을 사용하여, 96-384 조건 수동 방법을 사용하여 한 주에 한 사람에 의해 테스트 할 수 있으며, 최대 1,152 조건. 발현 플라스미드는 수많은 표적 한번에 서브 클로닝 될 수 있도록 재조합 클로닝 기술을 사용하여 구성된다. 일단 수용성 발현 조건이 식별되었으며 수행 단리는, 원하는 경우, 단백질은 산화 및 순도, microassays 및 / 또는 대규모 생산을 확인하는 품질 관리를 진행할 수있다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig2highres.jpg" wiDTH = &quot;500&quot;/&gt; 그림 2. 보편적 인 재조합 복제에 대한 회로도 및 디자인을 구성합니다. 대상 항목 클론에서 여러 발현 벡터는 높은 처리량 패션 (주에서 최대 6 × 96 항목 클론)에서 하나의 실험에서 하위 복제 할 수 있습니다. 발현 된 단백질은 니켈 친화 정제 HIS 태그를 인코딩합니다. DsbC (세포질 표현의 세포질 신호 순서가 결여) 융합 파트너는 용해도 및 / 또는 원조 폴딩 및 표적 단백질의 정확한 산화를 증가하는 데 사용됩니다. 태그 분해가 필요한 경우 대상 코딩 시퀀스는 N-말단 TEV 단백질 분해 효소 사이트 (ENLYFQ)를 포함해야합니다. 왼쪽 상단 삽입 된 PCR 또는 유전자 합성에 의해 얻을 수있다 도너 벡터와 표적 서열을 사용하여 엔트리 클론의 생성을 보여준다. 항목 클론은 상업 항목 클론 컬렉션에서 얻을 수 있습니다. 여러 재조합 복제 시스템을 사용할 수 있습니다,하지만 우리는 게이트웨이 Syste의에게 사용m, 회로도와 같이. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig3highres.jpg" width="500" /> 여러 이황화 풍부한 대상에 대해 그림 3. 높은 처리량 검사 파이프 라인. 대상은 처음 BL21 (DE3) pLysS를 E.의 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현된다 자동 유도 매체 (ZYP-5052)를 사용하여 17분의 37 ° C에서 대장균. 정화는 HTP 전기 (또는 점 오점 / SDS-PAGE로)에 의해 용해 구조의 검출 다음 니켈 수지에서 수행됩니다. 식 검사의 첫 번째 라운드가 실패하면 다른 배양 조건이 시도됩니다. 구문이 충분히 높은 수율, microassays 및 품질 관리에 가용성 단백질을 생산하는 경우 수행 될 수 있고 필요한 경우, 대규모 생산은 추구 될 수있다. 수용성 수익률이 충분히 높지 않다 대상의 표현 검사는 다른 스트라를 계속할 수 있습니다인 다음 온도 다른 융합 파트너 및 주변 세포질 식입니다. 선택 단계가 점선 상자로 표시됩니다. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig4highres.jpg" width="500" /> HTP 플랫폼에 대한 그림 4. 로봇 작업대 설치. 다른 작업 테이블도 사용할 수 있지만 우리의 액체 처리 로봇 작업대의 배치가 표시됩니다 가능한 동등한 사이트가 제공했다. 설정은 (8 - 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)), 4 개의 위치를​​ 가진 두 개의 마이크로 캐리어 각 (MP4, 1-4과 5-8를 배치), 2 위치와 진공 스테이션 세척 스테이션 (WS)로 구성 캐리어에게 (테 - 셰이커 14-15과 16-17을 배치) 2 위치를 가진 두 개의 플레이트 뜨는 각각 3 위치와 마이크로 캐리어 (MP3가, 11 ~ 13를 배치), (테 - 진공 청소기, 9, 10 배치) 및 3 위치를 가진 처분 할 수있는 팁 (DITI, 18 ~ 20를 배치). 또다시 두 호텔 깊은 웰 플레이트에 대한 사업자와 (도시하지 않음) 마이크로 플레이트에 대한 하나입니다. 액체 처리 로봇에 설치되어있는 하드웨어는 처분 할 수있는 끝, 주변에 접시 / 장비를 이동 고정 팁 8 채널 액체 처리 헤드 (LIHA)와 로봇 매니퓰레이터 (로마)와 함께 사용하기위한 96 채널 팔 (MCA96)입니다 작업대. 위치의 번호는 프로토콜에 걸쳐이라고합니다. <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 5. 4 개의 24 웰 플레이트에 하나 96 - 웰 플레이트에서 전송하기위한 개략도. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 6. 대표 결과는 96 이황화 풍부한 독 프로의 발현 화면에 표시됩니다teins. 단백질이 세포질에있는 HIS-DsbC 융합으로 표현하고 니켈 수지의 50 μL (프로토콜 8.2-B)를 사용하여 정제 하였다. A) 식 심사 결과, 가상 젤을 보여주는 식 수율 득점. 가상 젤의 대비가 매우 희미하거나 강렬한 밴드를 보상하기 위해 차선에 차선 조정되었습니다. 어떤 대상에 대해 두 밴드가 상위 대역에서 이황화 결합의 수와 비교). B 형 융합 태그에 대응하는 본래 융합 단백질 및 하부 대역으로 각각의 발현 수준에서 발현 된 단백질의 비율을 대응하는 볼 수 있습니다 단백질. 각 그룹에있는 단백질의 실제 개수는 그래프. C)에 오버레이되는 등전점 (PI) 및 잔기의 수에 기초하여 발현 량의 분포. D) 5.7 kDa의 이황화 풍부한 독이 질량 분석 결과의 예 4 이황화 결합과 단백질. 의 스펙트럼좌측은 종래 DTT와 함께 감소하고 우측의 스펙트럼 단백질 DTT로 환원 한 후 탈염 단백질 정보을 나타낸다. 실험 대중에 해당하는 이온은 화살표로 표시되어 자신의 할당은 녹색으로 표시됩니다. 이전의 감소 및 감소 후 표와 환원제를 첨가하기 전에 산화 단백질의 존재에 해당하는 8 다의 질량 차이를 전시하는 단백질에 대한 실험 대중. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51464/51464fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 .</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 조리법 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> ZY </td><td> ~ 928 ㎖의 10g 트립 톤 5g 효모 추출물 925 ㎖의 물 </td><td> 혼합 후 소독 압력솥. </td></TR&gt; <tr><td> 2 M 망초 </td><td> 100 ML 49.3 g 망초 · 7H 2 O ~ 60 ml의 물 </td><td> 용해 될 때까지 교반 한 후 소독 압력솥. </td></tr><tr><td> 50X 5052 </td><td> 1 L 250g의 글리세롤 730 ㎖의 물 25g의 포도당 100g α-유당 </td><td> 순서대로 추가 모두 용해 될 때까지 불로 저어 후 소독 압력솥. </td></tr><tr><td> 20 배 NPS </td><td> 1 L 900 ㎖의 물 66g (NH 4) 2 SO 4 136g의 KH 2 PO 4 142g 나 2 HPO 4 </td><td> 순서대로 추가하고 모든 용해 후 소독 압력솥 때까지 저어. </td></tr></tbody></table> ZYP-5052 배지의 성분 표 1. 레시피.

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High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다.

에서 생산 재조합 이황화 풍부한 독 단백질에 적용되는 높은 처리량 정량 식 검사 및 정화<em&gt; E. 대장균</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

high-throughput-quantitative-expression-screening-purification

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

23.9K 조회수.  Aix-Marseille Université.  심사 양적, 높은 처리량의 표현과 소규모 대장균 문화의 융합 단백질의 분석 정화하기위한 프로토콜을 설명하고 이황화 풍부한 동물 독의 표적 단백질의 발현에 적용됩니다. 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

연구

생물학

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

에서 단백질의 감독 진화에 대한 돌연변이 유발 및 기능 선택 프로토콜 E. 대장균</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

에서 곰팡이 Endoglucanase 활동의 높은 처리량 검사 대장균</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

에서 펩타이드 및 단백질과 재조합 엘라스틴 같은 폴리 펩타이드 및 그 융해의 비 크로마토 그래피 정제<em&gt; 대장균</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

루시 페라 제 발현 재조합 바이러스의 높은 처리량의 적정

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

정제 및 아밀로이드 피 브릴로 리 폴딩 (그의)<sub&gt; 6</sub&gt; -tagged 재조합 Shadoo 단백질의 봉입체로 표현<em&gt; 대장균</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...