저자는 지난 몇 년 동안 그녀는 항상 우수한 기술 지원을 부인 Meike Schaffrinski에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 공동 연구 그룹 942 (FOR942) 내에서 독일 연구 협회 (DFG)를 통해 의학 학부, 게오르그 8 월 - 대학 괴팅겐의 연구 프로그램에 의해 투자되었다.

무균 인간 AB 혈청의 1 준비 <ol><li> 신선한 냉동 혈장 (FFP)의 4-5 가방을 수집합니다. -20 ° C에서 보관 가방은 충분한 부대가 수집 될 때까지. </li><li> 가방을 해동 및 보완을 비활성화하고 섬유소를 제거하기 위해 물을 욕조에 56 ° C에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 철저하게 가방의 외부를 소독하고 50 ml의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 3,000 XG에 원심 분리기 침전물 및 잔여 혈소판을 제거 얻을 수 있습니다. </li><li> 모든 상층 액을 풀과 알약을 폐기합니다. </li><li> 나누어지는 혈청 15 ㎖의 튜브 샘플 및 저장 온도 -20 ° C에서. NOTE : 대안 적으로, 시판되는 열 - 불 활성화 된 정상 인간 AB 혈청을 사용할 수있다. </li></ol> 단핵구의 2 절연 원심 분리기의 분산을 용이하게하기 위해, 병렬로 두 버피 코트를 처리 할 것을 권장한다. 그러나, 캘리포니아을세포를 혼합하여 각각에 대해 별도의 도너 재료를 사용하지 재. 경우에 버피 코트를 쉽게 얻을 수없고, 헤파린 말초 혈액 400ml를 대신 사용할 수있다. <ol><li> 조심스럽게 버피 코트가 들어있는 비닐 봉지를 소독이 50 ml의 튜브에 각 버피 코트의 내용을 전송합니다. </li><li> 각 버피 코트의 경우 15 ㎖의 피콜 용액 (1.077 g / ml)로 세 50 ml의 튜브를 입력합니다. 피콜 조제 실온에서해야한다. </li><li> 제 층 밀도 구배 용 피콜 용액 위에 버피 코트 혈액 ML 30-35. 두 레이어를 혼합 방지하기 위해 천천히 조심스럽게 이렇게주의하십시오. </li><li> 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 각 구배를 들면 50 ㎖의 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전사와 두 단계 사이에 위치 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 흰색 환을 모은다. </li><li> 총 40 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. </li><li> 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 300 XG에 원심 분리기. </li><li> 기음 뜨는 및 40 ml의 PBS-EDTA (1 mM)을 다시 펠렛을 씻는다. </li><li> 각 기증자 풀의 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS없이 20 ㎖의 RPMI-1640의 펠렛. </li><li> 초 밀도 구배에 대한 ISO 삼투 퍼콜 솔루션을 준비 :이 기증자 23.13 ml의 퍼콜 솔루션 믹스 (밀도 : 1.131 g / ㎖) 50 ㎖의 튜브와 1.87 ml의 10 배 PBS를. 이어서 50 ㎖의 새로운 튜브에 상기 용액 23 mL로 전송하고 46 % 이소 삼투 퍼콜 용액을 얻었다 페놀 레드 10 + %의 FCS와 함께 27 ml의 RPMI-1640을 추가한다. 퍼콜는 자료 실온에 있어야합니다. </li><li> 50 ML 튜브로 제조 된 퍼콜 용액 25 ㎖의 각 기증자 전송 및 퍼콜 솔루션의 상단에 2.9에서 제조 된 PBMC 솔루션을) 층. 매우 느리게 이렇게 조심d를 조심스럽게 두 층이 쉽게 혼합하는 경향이있다. 정확하게하는 경우이 단계로 인해 색상들의 차이를 구별 할 수있다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 브레이크없이 550 XG에 원심 분리기. </li><li> 각 그라데이션의 경우 50 ML 튜브에 플라스틱 파스퇴르 피펫 및 전송로 두 단계 사이에 위치 단핵구의 흰색 반지를 수집합니다. </li><li> 총 50 mL로 PBS-EDTA (1 mM)을 각각 튜브를 입력합니다. </li><li> 실온에서 브레이크없이 10 분 동안 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 기음 페놀 10 + 빨간색 %의 FCS와 함께 20 ml의 RPMI-1640에 알약을 재현 탁. </li></ol> 대 식세포에 단핵구의 3 분화 <ol><li> 트리 판 블루시 10 분 희석에 격리 된 단핵 세포의 수를 결정합니다. 만 단핵구 아르 큰 종종 불규칙 모양의 세포를 계산합니다. 림프구 수있는 작고 둥근 모양의 세포를 계산하지 마십시오. NOTE : 단핵구 숫자들은 단지 세포의 분화에 사용될 얼마나 많은 그리고 FEP 테프론 코팅 된 (소형 또는 대형) 잡화에 관한 힌트를 제공하기 때문에 너무 정확하게 결정될 필요가 없다. </li><li> 한 기증자로부터 1.0-1.5 × 10 8 단핵구 들어 대규모 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 물 주머니에 세포를 시드. 각 부대 174 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (180 ml의 총 부피)로 구성된 배양 배지를 준비한다. <ol><li> 한 기증자로부터 3.0-5.0 × 10 7 단핵구를 들어 작은 테프론 코팅 된 세포 배양 용기에 세포를 시드. 각 봉지 배지 285 ㎖의 RPMI-1640 (섹션 1에서 제조 된 바와 같이) 2 % 인간 AB 혈청, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 2.5 NG / ㎖ M-CSF (30 ㎖의 총 부피)으로 이루어진 준비. 참고 : 예를 들어, 8.0 × 10 7 단핵 세포를 얻을 경우, 우리는 TW에서 그들을 시드 추천4.0 × 10 7 세포 각각 O를 작은 부피 가방. 대신, M-CSF에, 단구 대안 동일한 농도 (2.5 NG / ㎖)에서 과립구 대 식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF)와 구별 될 수있다. </li></ol></li><li> 준비된 배지에 세포 현탁액 (20 ml)에 조심스럽게 첨가하고 혼합한다. 이 백은 한 기증자로부터 제조하는 경우, 세포 현탁액에 20 ml의 RPMI-1640을 추가 한 다음 각 배지에 현탁 제제의 절반을 추가한다. </li><li> 선택 사항 : 단핵구 준비가 무균 상태로있게되면 결정 혈액 한천 접시에 세포 현탁액 한 방울을 찢고 37 ° C에서 밤새 배양합니다. </li><li> FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방의 플러그에 주사기 perfusor 50 ML의 외피를 조 준비된 세포 현탁액으로 채운다. </li><li> 주사기를 분리하고 가방에 남아있는 공기를 밀어 넣습니다. 폐쇄 콘 가방을 닫습니다. </li><li> 37 6-7일에 가방을 품어76, 5 % CO 2와 C. </li></ol> 4 대 식세포 수확 <ol><li> 세포의 분리 (최대 3 시간 수의 배양을) 용이하게하기 위해 적어도 1 시간 동안 얼음에 차별화 된 대 식세포와 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방을 놓습니다. 가방의 표면 전체가 얼음으로 덮여 있는지 확인합니다. </li><li> 책상 / 보드의 모서리에 살짝 배와 가방을 당기십시오. </li><li> 조심스럽게 가방의 외부를 소독하고 폐쇄 콘을 제거합니다. </li><li> 가방의 플러그에 50 ML의 주사기를 조, 세포 현탁액을 제거하고 50 ML 튜브로 전송. </li><li> 세포를 스핀 다운, 실온에서 10 분 동안 400 XG에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 대기음 총 10 ml의 RPMI-1640 + 10 % FCS에 한 가방에서 알약을 풀. </li><li> 혈구의 세포 수를 결정 (1 : 4-1 : 트리 판 블루 10 희석). 만 대형 원형 셀을 계산합니다. NOTE : FEP 테플론 코팅 가방 식세포를 미분 한 후, 잔여 도너 세포와 단핵구 분리의 품질에 따라, 예를 들어 림프구가있을 수있다. </li><li> FEP 테플론 코팅 된 가방을 다시 사용하려면 잔여 세포를 제거하기 위해 70 % 에탄올로 두 번 씻어. 50 ㎖의 70 % 에탄올로 채우고 하룻밤 배양한다. 가방, 멸균 PBS로 3 배 살균 종이에서 그들을 포장하고, 표준 절차를 사용하여 오토 클레이브 소독 세척 할 것. 주 : 세포 배양 가방 식세포 금리 손실없이 여러 번 재사용 할 수 있습니다. 그러나 우리는 그들이 누출을 시작하기 전에 10 사용 후 가방을 폐기하기로 결정했다. </li><li> RPMI-1640 + 10 % FCS 후속 실험 문화 대 식세포하십시오. 낮은 혈청 농도가 필요한 경우, 1 % FCS와 RPMI-1640에서 배양이 가능하다. 종자 3 ~ 4 시간 동안 배양 세포. 이 기간 후에는, 대 식세포가 세포 배양 접시 동안의 표면에 부착 유의어떤 오염 세포 (즉, 적혈구, 림프구, 수지상 세포) 서스펜션에있어. 비 부착 세포를 제거하는 PBS로 두 배 이상 세포를 씻으십시오. </li><li> 상기 실험을위한 세포 배양 접시에서 배양 한 대 식세포를 분리, 신중 표면들을 긁어. 또한, 얼음에 20 분 동안 요리를 배양 배지를 흡인하고, 1 ml의 효소가없는 세포 분리 버퍼를 추가합니다. 37 ° C에서 5 분 배양 한 후, 아래로 최소 3 분 동안 4 ml의 PBS를 추가하고, 피펫 팅하여 세포를 분리합니다. </li></ol>

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	<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496, 445-455 (2013).</li><li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Adaptive+Immunity+by+the+Innate+Immune+System.">Regulation of Adaptive Immunity by the Innate Immune System.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li><li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+plasticity+and+polarization:+in+vivo+veritas.">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> J Clin Invest. 122, 787-795 (2012).</li><li>Lionakis, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1-dependent+renal+macrophage+survival+promotes+Candida+control+and+host+survival.">CX(3)CR1-dependent renal macrophage survival promotes Candida control and host survival.</a> J Clin Invest. 123 (3), 5035-5051 (2013).</li><li>Blumenthal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wingless+homolog,+WNT5A+and+its+receptor+Frizzled-5+regulate+inflammatory+responses+of+human+mononuclear+cells+induced+by+microbial+stimulation.">The Wingless homolog, WNT5A and its receptor Frizzled-5 regulate inflammatory responses of human mononuclear cells induced by microbial stimulation.</a> Blood. 108, 965-973 (2006).</li><li>Lima, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammasome-derived+IL-1+beta+production+induces+nitric+oxide-mediated+resistance+to+Leishmania.">Inflammasome-derived IL-1 beta production induces nitric oxide-mediated resistance to Leishmania.</a> Nat Med. 19, 909-915 (2013).</li><li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis.">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 4, 71-78 (2004).</li><li>Subramanian, V., Ferrante, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+inflammation,+and+macrophages.">Obesity, inflammation, and macrophages.</a> Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme. 63, 151-159 (2009).</li><li>Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+atherosclerosis:+a+dynamic+balance.">Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance.</a> Nat Rev Immunol. 13, 709-721 (2013).</li><li>Pradere, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+macrophages+but+not+dendritic+cells+contribute+to+liver+fibrosis+by+promoting+the+survival+of+activated+hepatic+stellate+cells+in+mice.">Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice.</a> Hepatology. 58, 1461-1473 (2013).</li><li>Danciger, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+large+scale+isolation,+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis,+cellular+adhesion+assays,+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation.">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J Immunol Methods. 288, 123-134 (2004).</li><li>Reiling, N., Blumenthal, A., Flad, H. D., Ernst, M., Ehlers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacteria-induced+TNF-alpha+and+IL-10+formation+by+human+macrophages+is+differentially+regulated+at+the+level+of+mitogen-activated+protein+kinase+activity.">Mycobacteria-induced TNF-alpha and IL-10 formation by human macrophages is differentially regulated at the level of mitogen-activated protein kinase activity.</a> J Immunol. 167, 3339-3345 (2001).</li><li>Andreesen, R., Picht, J., Lohr, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cultures+of+Human+Blood-Borne+Macrophages+Grown+on+Hydrophobic+Teflon+Membranes.">Primary Cultures of Human Blood-Borne Macrophages Grown on Hydrophobic Teflon Membranes.</a> J Immunol Methods. 56, 295-304 (1983).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+bone+marrow+in+the+teflon+culture+bag:+identification+of+the+human+monoblast.">Culture of human bone marrow in the teflon culture bag: identification of the human monoblast.</a> Journal of the Reticuloendothelial Society. 32, 355-369 (1982).</li><li>van der Meer, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+monocytes+cultured+in+the+Teflon+culture+bag.">Characteristics of human monocytes cultured in the Teflon culture bag.</a> Immunology. 47, 617-625 (1982).</li><li>Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+human+monocyte-to-macrophage+differentiation+and+polarization:+New+molecules+and+patterns+of+gene+expression.">Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression.</a> J Immunol. 177, 7303-7311 (2006).</li><li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+and+macrophage+heterogeneity.">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat Rev Immunol. 5, 953-964 (2005).</li><li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10.">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li><li>Tushinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+Mononuclear+Phagocytes+Depends+on+a+Lineage-Specific+Growth-Factor+That+the+Differentiated+Cells+Selectively+Destroy.">Survival of Mononuclear Phagocytes Depends on a Lineage-Specific Growth-Factor That the Differentiated Cells Selectively Destroy.</a> Cell. 28, 71-81 (1982).</li><li>Rietkotter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zoledronic+acid+inhibits+macrophage/microglia-assisted+breast+cancer+cell+invasion.">Zoledronic acid inhibits macrophage/microglia-assisted breast cancer cell invasion.</a> Oncotarget. 4, 1449-1460 (2013).</li><li>Pilling, D., Fan, T., Huang, D., Kaul, B., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Markers+that+Distinguish+Monocyte-Derived+Fibrocytes+from+Monocytes,+Macrophages,+and+Fibroblasts.">Identification of Markers that Distinguish Monocyte-Derived Fibrocytes from Monocytes, Macrophages, and Fibroblasts.</a> Plos One. 4, E7475 (2009).</li><li>Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+generation+of+monocyte-derived+macrophages+under+serum-free+conditions+improves+their+tumor+promoting+functions.">In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions.</a> Plos One. 7, e42656 (2012).</li><li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques.">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am J Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li><li>Chernykh, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+and+properties+of+human+M2-like+macrophages:+potential+candidates+for+CNS+repair?.">The generation and properties of human M2-like macrophages: potential candidates for CNS repair?.</a> Cell Ther Transplant. 2, (2010).</li><li>Verreck, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+IL-23-producing+type+1+macrophages+promote+but+IL-10-producing+type+2+macrophages+subvert+immunity+to+(myco)bacteria.">Human IL-23-producing type 1 macrophages promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).</li><li>Pukrop, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+5a+signaling+is+critical+for+macrophage-induced+invasion+of+breast+cancer+cell+lines.">Wnt 5a signaling is critical for macrophage-induced invasion of breast cancer cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 5454-5459 (2006).</li><li>Hagemann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+induce+invasiveness+of+epithelial+cancer+cells+via+NF-kappa+B+and+JNK.">Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-kappa B and JNK.</a> J Immunol. 175, 1197-1205 (2005).</li><li>Pereira, C., Schaer, D. J., Bachli, E. B., Kurrer, M. O., Schoedon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5A/CaMKII+signaling+contributes+to+the+inflammatory+response+of+macrophages+and+is+a+target+for+the+antiinflammatory+action+of+activated+protein+C+and+interleukin-10.">Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10.</a> Arterioscl Throm Vas. 28, 504-510 (2008).</li></ol>

저자는 이해 관계의 충돌이 존재하지 않기 때문에 공개하는 게 없다.

대 식세포는 선천성 면역 시스템의 중요한 이펙터 세포 아르와 면역, 항원 제시 및 조직의 항상성에 중요한 기능을 표시합니다. 인해 현저한 소성하여, 그들의 표현형의 변화와 다른 자극에 반응 할 수있다. 대 식세포 편광 마커의 단지 약 50 %가 인체에 직접 16에 마우스 번역 될 수 있음을 보여주는 보고서가 있지만 그러나, 대 식세포의 편광에 관한 데이터의 지금까지 많은, 쥐의 시스템에서 얻을 수있다. 따라서 고가의 재료, 예를 들면 MACS 마그네틱 비드 또는 향류 원심 elutriation 장치에 대한 필요없이 충분한 수 및 여기 순도 차 인간 대 식세포를 얻는 방법을 제시한다. 우리의 방법은 한 PBMC에서 단핵 세포의 분리 및 FEP에서 대 식세포에 대한 그들의 이후의 차별화를 기반으로 낮은 conce의 존재 세포 배양 가방을 테프론 코팅M-CSF 11 ~ 13 ntrations. 단핵구를 자극시 인간에서 5 미만 말초 혈액 백혈구 ~ 10 %를 구성하는 동안 그들은 상주 조직 대 식세포 또는 수지상 세포로 분화 17 주연 사이트로 보충된다. 사이토 카인 M-CSF는 단핵 세포의 생존을 위해 중요하며, 대 식세포 (18, 19)로 분화를 구동한다. 지금까지, 단핵구의 분화에 선정되었다 M-CSF 농도는하지만, 우리의 프로토콜에 우리는 단지 2.5 NG / ML (12)의 M-CSF 농도 성숙한 대식 세포의 충분한 수를 얻을 수 있으며, 100 겨 / ㎖까지였다 20. 또한, 세포는 대 식세포의 박리 정의 세포 수에서의 후속 시드를 용이 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 백에서 배양한다. 잡화 여러 번 재사용 될 수 있기 때문에 상기 분리 공정에 대한 비용을 감소시킨다. 이 절차에 의해 수득 식세포CD45, CD14, CD11b를,의 CD11c에 매우 긍정적이며, 순수, 성숙한 대식 세포 (21, 22)의 인구에 대한 주장 만노스 수용체 CD206의 발현을 보여줍니다. 특히 높은 CD14 발현은 M-CSF (23)의 존재하에 분화 된 대 식세포에 대한 전형적인 것이다. 다른 사람이 기름에 튀긴 된 계란 표현형을 전시하면서 세포의 파종 후, 그들은 일반적인 스핀들과 같은 형태를 보여주는 몇 가지 세포와 플라스틱 표면 빠르고 준수를 표시합니다. 이것은 다른 저자 18,22,24에서 관측에 따라입니다. 그것은 M-CSF의 존재 하에서 단핵구 분화 M2 편광 식세포 16,25 리드 것으로보고되었다. 그러나, 우리의 프로토콜에 의해 단리 식세포는 그들이 프로 유도와 반응 정지 종양 세포 26,27 또는 LPS에 노출 종양 세포 유래 마이크로 소포와 공동 배양에의 노출을 포함하여 자극의 넓은 범위에 응답 할 수있다 이러한 IL-1과 같은 염증성 유전자# 946 ;, TNFα, Wnt5a, 또는 M1-편광 식세포 3,5,28에 대한 일반적인 고려되는 다양한 매트릭스 메탈로. 결론적으로, 기술적으로 어렵거나 비싼 절차 없이도 이중 밀도 구배 원심 분리 및 대 식세포의 높은 숫자 FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 백 결과 식세포 향해 후속 분화에 의해 단핵구의 분리. 수득 식세포는 종양 세포와 함께 공 배양하여 LPS를 통해 고전 활성화에서부터 후속 분석을 위해 이용 될 수있다.

대 식세포 - - 단핵구 혈통과 말기 차별화 된 파생 상품에서 세포 개발, 조직 복구, 면역 일 등 다양한 공정에서의 참여로 이어지는, 자신의 생물학적 기능과 관련하여 눈에 띄는 가소성을 나타낸다. 후자는 자신의 식세포 및 선천성 및 후천성 면역 반응이 사이의 교차로에 대 식세포를 배치 항원 제시 능력 때문이다. 그러나, 그들의 능력이 사이토 카인, 케모카인, 성장 인자 및 다른 시그널링 분자가 분비 한 그들의 면역 조절 성 기능을 증대뿐만 아니라, 자신의 부가 기능에 대한 기초 역할뿐만 아니라. M1과 M2 카테고리 3 이어질 아닌 미생물 매개 조건의 맥락에서 이러한 다양한 활성화 단계를 반영하려고 시도합니다. 이러한 분류가 완료되지 않은 반면, 대식 세포 생물학의 기본적인 이해를 위해 허용한다. 이러한 다각적 인 기능으로 인해이 대 식세포가 어떤 방식으로 조직을 리모델링하거나 염증을 포함하는 많은 조건과 연관되어 있다는 것은 놀라운 일이. 침입하는 병원균 4-6의 인식 및 통관에서의 기본적인 역할에 다음 대 식세포는 점점 동맥 경화증, 섬유증, 비만, 암 7-10의 초점이있다. 인간 대 식세포의 생성을위한 재현성있는 방식은 이러한 병리의 이해에 따라서 중요하다. 여기에서 우리는 이전에 설명한 바와 같이 11 배 밀도 구배 원심 분리 기술에 의해 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포에서 인간의 분리에 기반 방법을 제시한다. 식세포쪽으로 분화를 촉진하기 위하여, 절연 단핵 세포는 M-CSF 및 정상적인 인간 혈청 (12)의 낮은 농도의 존재 하에서 배양 하였다. 추가 처리 및 세포 수확을 쉽게하기 위해, 차별화 가스 투과 FEP에서 수행된다소수성 표면에 12 ~ 15 테프론 코팅 된 세포 배양 가방. 그들은 여전히​​ 어느 M1 또는 M2 유사한 방식으로 응답 할 수있는 바와 같이 얻어진 쉬고 식세포 분석의 다양한 실시 할 수있다. 자기 활성 셀 정렬 (MACS) 또는 원심 elutriation (CCE)를 역류 등의 단핵 세포 분리 및 후속 차별화의 다른 방법이 필요 수율, 비용 및 시간에 관한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본원에 기재된 프로토콜은 특수 시약 (예, 자성 비드를 MACS) 또는 장치 (예, CCE 장치)의 필요없이 표준 실험실 장비로 수행하고 세포의 대량의 처리를 허용 할 수있는 이점을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibodies for immunophenotyping</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>BioLegends</td>
			<td></td>
			<td>for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 200M microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcein-AM</td>
			<td>AnaSpec</td>
			<td>89201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>combi-stopper closing cones</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4495101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td>for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0,5 M EDTA per 500ml PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (Titriplex III)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084211000</td>
			<td>prepare a 0,5 M solution in H2O, use a sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13151-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll (density 1.077g/ml)</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>L6115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-mouse FITC</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS from E.coli</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L8274</td>
			<td>final conc: 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density 1,131g/ml)</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusor syringe 50ml</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>resuspend in methanol (c = 0,1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Pasteur Pipettes</td>
			<td>LVL technologies</td>
			<td>2655181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rh M-CSF</td>
			<td>ImmunoTools</td>
			<td>11343117</td>
			<td>Resuspend in 500&#181;l sterile H2O (c = 100 ng/&#181;l), aliquot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 with Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640 without Phenol Red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11835-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterilization paper</td>
			<td>VP group</td>
			<td>3KFKFS230116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain (0,4% w/v)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, small</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>72-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP Teflon-coated cell culture bag, large</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>197-C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags

인간 대 식세포는 감염성 질환에서 암에 이르기까지 병리학 적 과정의 과다에 참여하고 있습니다. 따라서 그들은 이러한 질병의 기본 메커니즘을 이해하는 유용한 도구 포즈. 따라서 우리는 높은 대식 세포 수율 결과 차별화 절차에 의해 다음 버피 코트에서 인간 단핵 세포의 분리를 위해 간단한 프로토콜을 제시한다. 기법은 일반적으로 사용할 실험 장비에 주로 의존하며, 따라서 인간 대 식세포 다량 수득 비용 및 시간 효율적인 방법을 제공한다. 간단히, 건강한 혈액 기증자 버피 코트는 말초 혈액에서 단핵구를 수확하는 이중 밀도 구배 원심 분리된다. 이러한 단핵구는 대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF)의 존재하에 플루오르 화 에틸렌 프로필렌 (FEP) 테프론 코팅 된 세포 배양 주머니에 배양한다. 차별화 된 대 식세포 쉽게 수확 및 후속 연구와 같은 기능을 사용할 수 있습니다말했다. 품질 관리 및 격리과 분화 단계의 검증하기위한 중요한 방법은 프로토콜 내에서 강조 표시됩니다. 요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 일상적 재현성 비용 집약적 도구 없이도 인간 대 식세포를 분리 과학자들 수있다. 또한, 질환 모델은 뮤린 대 식세포의 사용을 회피 동계 인간 시스템에서 연구 될 수있다.

피콜을 사용하여 제 밀도 구배 원심 분리 한 PBMC (도 1a), 즉 림프구 및 단핵구를 포함하는 백색 간기를 산출한다. 이는 월 Gruenwald 염색 (림프구의 일반) 높은 핵 / 세포질 비율을 모두 보여줍니다 수집 된 세포 (그림 1B 및 C)를 통해 확인 및 (단핵 세포의 전형) bean- 또는 고리 모양의 핵이 될 수있다. 이들 세포를 사용하여 다음 퍼콜 초 밀도 구배에로드 될 때, 단핵구는 림프구로부터 더욱 분리 될 다시 백색 상간 (도 1D-F)로 표시 할 수있다. 각 버피 코트를 들어 설명 이중 밀도 기울기 원심 분리 정기적으로 버피 코트 70 ± 30 × 10 6 대 식세포 (그림 2)로 구분됩니다 150 ± 40 × 10 6 단핵 세포를 얻을 수 있습니다. 에서 평균 식세포 수익률20 독립적 인 준비는 총 격리 된 단핵구의 47 ± 14 %였다. 퍼콜 구배 원심 분리 후 여전히 헌혈에뿐만 아니라 분리 공정의 정확도에 의존하는 제조에서 본 일부 잔류 비 단핵 세포가있을 수있다. 그러나 6-7일의 분화 단계 후, 준비는 주로 추가로 인해 플라스틱 표면에 자신의 준수, 임의의 오염 세포에 의해 공유되지 않는 기능 (그림 4A에 농축 될 수있다 성숙한 대식 세포 (그림 3)으로 구성 및 B). 뻗어 스핀들 같은 표현형 (그림 4C와 D)와 세포도 있습니다 동안 한 번 식세포의 대부분은 고전적인 &quot;기름에 튀긴 된 계란&quot;형태를 보여, 도금. 이 세포질과 접착 클러스터 내에서의 F-액틴 분포 미러링됩니다. 분화 된 세포성숙한 대식 세포 (그림 5)에 대한 일반적인 지표 인 CD45, CD14, CD16, CD206 (만노스 수용체), CD11b를 발현과의 CD11c을 특징으로한다. 는 CD11b의 존재는 세포가 수상 세포 마커 CD209 (DC-SIGN)에 대한 부정적인 있다는 사실에 의해지지된다 주로 수지상 분화 대해 주장한다. 분화 과정 후 세포가 기능적는 AM 염색 및 종양 세포에서 창고 외 소포를 취할 수있는 능력을 칼 세인으로 시각화 할 수있는 약 5-7일 (그림 6)에 대한 대사 적으로 활성 상태로 유지됩니다. 또한, 세포는 여전히 몇몇 염증성 유전자 (도 7)의 발현을 초래 리포 폴리 사카 라이드 (LPS)와 함께 자극, 예를 들면 도시 한 바와 같이 활성화 될 수있다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,554 / 51554fig1highres.jpg&quot;너비 = &quot;500&quot;/&gt; 이중 밀도 구배 원심 분리 후도 1 모양 및 PBMC-의 조성 및 단핵구 층. 이소 삼투 퍼콜 원심 후 피콜 구배 및 (D) 단핵구 단계 이후 (A) PBMC 대역을 나타낸 사진. cytospin의 (B, C) ​​PBMC 분획 제제 및 나머지 (E, F) 단핵구의 월 - Gruenwald 시약 염색. 200 B와 E의 μm의는, C와 F에서 50 μm의 = = 스케일 바 <img alt="그림이" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig2highres.jpg" width="300" /> 단핵 세포와 대 식세포의 그림 2 수율. 대표 세포 격리 된 단핵구의 countings 20 버피 코트 홍보의 대 식세포eparations. <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig3highres.jpg" width="600" /> 현미경 사진도 3 (A) 및 후 (B) 대 식세포 및 단핵구 분화 이전 식세포. 단핵 세포 현탁액의 위상차 현미경의 셀 크기 측정. 단구 (C) 및 대 식세포 (D)의 셀 크기 히스토그램 대응. 스케일 바 = 100 μm의. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" width="600" /> 그림 4 형태와 부착 대 식세포의 세포 골격 조직. (A) 전에 식세포의 위상차 현미경 및 비 adheren의 후 (B) 제거t 세포. 부착 성, 비 자극 된 대 식세포에서의 사상의 액틴 (C, D) Phalloidin TRITC-염색. 스케일 바의 AC = 100 μm의, D. 20 μm의 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" width="500" /> 그림 차별화 된 대 식세포의 면역 표현형 5. FEP 테플론 코팅 된 세포 배양 가방에 분화 육일 후 대 식세포의 유동 세포 계측법 분석 (빨간색으로 표시). 해당 이소 컨트롤이 회색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 대 식세포에 의한 종양 세포의 마이크로 소포도 6 통풍. PKH26로 표지 (적색 형광) 종양 세포 유래 마이크로 소포에 박람회 후 부착 식세포의 현미경 사진. 이미지는 생존의 염료 칼 세인 AM을 해당 (A) 시야 또는 (B) 세포질 염색에 오버레이됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51554/51554fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51554/51554fig7highres.jpg" width="500" /> 그림 7 IL-1 β의 상향 조절, Wnt5a, TNFα, IL-6, MMP-2, MMP-7 및 MT1-MMP stimu 후24 시간. 유전자 발현을위한 LPS (100 ng의 / ㎖)와 대 식세포 만큼은 전체 RNA 샘플 (A) 및 HPRT1 GNB2L1 및 발현에 정규화에서 정량적 RT-PCR에 의해 측정 하였다. 도시 된 값은 미처리 컨트롤에 비해 배 변화되어하는 (N, ± SD 수단 = 5 * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). LPS 자극 하에서 TNFα 및 IL-6 유도는 또한 (± SD 수단 * p &lt;0.05), ELISA (B)에 의해 확인되었다.

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Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다.

인간의 두 그라데이션 원심 분리하여 단핵구와 테프론 코팅 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화의 분리

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

isolation-human-monocytes-double-gradient-centrifugation-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

69.3K 조회수.  University Medical Center Göttingen.  우리는 인간 대 식세포의 세대를위한 간단하고 효율적인 프로토콜을 제시한다. 버피 코트는 이중 밀도 구배 원심 분리에 의해 처리되고 격리 된 단핵구는 테프론 코팅 된 세포 배양 가방에서 대 식세포로 분화된다. 이 대 식세포의 수율을 극대화하고 다음 실험을 위해 세포 수확을 용이하게한다. 

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

연구

면역학 및 감염병학

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

그라데이션 원심 분리에 의해 인플루엔자 A 바이러스 캡시드의 생체 외 분해에

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays. 
Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Here, we describe the purification of Legionella pneumophila (L. pneumophila) outer membrane vesicles (OMVs) from liquid cultures. These purified vesicles are then used for the treatment of macrophages to analyze their pro-inflammatory potential.

레지오넬라 뉴모 필라 외부 막 소포 : 분리 및 대 식세포에 그들의 프로 - 염증 가능성 분석

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

에 대한 응답으로 인간의 기본 호중구와 단핵구에 의해 항진균 활성의 라이브 영상<em&gt;를했다. 투스</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where immune cells reside and therefore contribute to mucosal immunity in the intestine. A complete understanding of how M cells differentiate in the intestine as well as the molecular mechanisms of antigen uptake by M cells is lacking. This is because M cells are a rare population of cells in the intestine and because in vitro models for M cells are not robust. The discovery of a self-renewing stem cell culture system of the intestine, termed enteroids, has provided new possibilities for culturing M cells. Enteroids are advantageous over standard cultured cell lines because they can be differentiated into several major cell types found in the intestine, including goblet cells, Paneth cells, enteroendocrine cells and enterocytes. The cytokine RANKL is essential in M cell development, and addition of RANKL and TNF-&#945; to culture media promotes a subset of cells from ileal enteroids to differentiate into M cells. The following protocol describes a method for the differentiation of M cells in a transwell epithelial polarized monolayer system of the intestine using human ileal enteroids. This method can be applied to the study of M cell development and function.

This protocol describes how to induce the differentiation of M cells in human stem cell-derived ileal monolayers and methods to assess their development.

인간 줄기 세포 유래 Ileal 장용 단층에서 M 세포 유사 세포의 분화 유도

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. While antiretroviral therapy efficiently lowers systemic viral load and restores normal CD4+ T cell counts, it does not reconstitute a completely functional immune system. A dysfunctional immune system in HIV-infected individuals undergoing cART may be characterized by immune activation, early aging of immune cells, or persistent inflammation. These conditions, along with comorbid factors associated with HIV infection, add complexity to the disease, which cannot be easily reproduced in cellular and animal models. To investigate the molecular events underlying immune dysfunction in these patients, a system to culture and manipulate human primary monocytes in vitro is presented here. Specifically, the protocol allows for the culture and transfection of primary CD14+ monocytes obtained from HIV-infected individuals undergoing cART as well as from HIV-negative controls. The method involves isolation, culture, and transfection of monocytes and monocyte-derived macrophages. While commercially available kits and reagents are employed, the protocol provides important tips and optimized conditions for successful adherence and transfection of monocytes with miRNA mimics and inhibitors as well as with siRNAs.

Presented here is an optimized protocol for isolating, culturing, transfecting, and differentiating human primary monocytes from HIV-infected individuals and healthy controls.

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...