우리는 사용 된 마우스 척수 조직 샘플을 제공하기 위해 미네소타 대학의 리 실험실에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 MB의 랜디 면도기 암 연구 및 지역 사회 기금과 미네소타 난소 암 연맹 (MOCA)이 MB의에 의해, 국방 난소 암 연구 프로그램 (OCRP) MB의 OC093424의 부서에 의해 지원되었다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

1. 용해 버퍼 준비 <ol><li> 2 M 원액을 만들기 위해 탈 (DI) 물에 설탕을 녹인다. 0.22 ㎛의 폴리 불화 비닐 리덴 (PVDF) 필터를 구동 진공을 사용하여 수크로오스 2 M 용액 필터. </li><li> 혐기성 조건에서 500 mM의 스톡 용액을 저장하기 위해 DI 물에 디티 오 트레이 톨 (DTT)을 녹인다. 100 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 염화 마그네슘 (의 MgCl 2)을 녹인다. 50 mM의 스톡 용액을 제조하기 위해 DI 물에 아데노신 삼인산 (ATP) 나트륨 수화물을 녹인다. </li><li> DI 물에 후, Trizma 염산염을 용해시키고 수산화 나트륨 (NaOH)을 이용하여 pH를 조정하여 pH를 7.4 트리스 용액을 구성한다. </li><li> 250 mm의 1mm를 5mm의의 MgCl 2 농도 1mM이 ATP 농도 및 50 mm의 트리스 농도 DTT 농도의 슈 크로스 농도의 용해 완충액을 만들기 위해 DI 물에 원액의 일부를 겸용 . 예를 들어, 트리스, 50 μL를 혼합 535.30의 MgCl 2 μL, 1.25 수크로오스 ㎖, 20 μL의 DTT, ATP 200 μL 및 DI 물 7.4947 ml의 용해 완충액 10 mL로한다. 이것은 약 20 실험에 사용될 수있다. </li></ol> 실험 2. 배양 세포 <ol><li> DMEM + 10 %, 50㎖ 태아 소 혈청 (FBS) 원추형 튜브의 30 ㎖를 분취하여 미디어를 확인. </li><li> 미지근한 물을 작은 비커에 액체 질소 저장에서 냉동 M17이나 헬라 세포를 전송합니다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 첫째, 세포 바이알에 일부 미디어를 추가합니다. 그리고 해동 5 초 이내에 재현 탁 세포를 전송합니다. </li><li> 세포 펠렛을 얻기 위해 5 분 동안 450 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기. T75 플라스크에 매체의 20 ML을 추가합니다. </li><li> 흡입을 사용하여 세포에서 용지를 제거합니다. 세포 펠렛 및 재현 탁에 신선한 매체의 5 ML을 추가합니다. </li><li> T75 플라스크에 미디어의 20 ㎖에 5 ml의 세포 현탁액을 전송하고 37 ° C에서 품어. 채널3 일마다 미디어를 앙. </li></ol> 3. 셀 수확 <ol><li> 세포를 만지지 않도록 조심하면서, 흡입을 통해 용지를 제거합니다. </li><li> 인산염 완충 생리 식염수 5 ㎖ (PBS)와 세포를 씻으십시오. 흡입을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> T75 플라스크에 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 3 ㎖를 추가하고 3 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 플라스크에 신선한 미디어 6 ML을 추가하고 세포를 재현 탁. </li><li> 5 분 동안 290 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 현탁액을 전송합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 PBS 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 조심스럽게 펠렛을 분쇄하기 위해 튜브의 바닥을 누릅니다. 5 분 동안 290 XG에 원심 분리기. </li><li> 단계를 반복 3.6 세 번. </li><li> PBS를 제거하고 신선한 PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁. 에펜 도르프 튜브 (1.5 ㎖)에 전송합니다. 5 분 동안 290 XG 스핀. </li></ol> 4. 세포 용해 <ol><li> 피펫을 사용하여 펠릿의 대략적인 체적을 측정1 부피비 : 질량에 유리 비드를 달아 (D1). 용해 완충액의 펠릿 두번 볼륨. 참고 : 유리 구슬을 추가하기 전에 버퍼를 추가합니다. </li><li> 를 Lyse 냉장실의 텍싱하여 4 ° C에서 30 분 동안 교반 최대의 에펜 도르프 튜브에 세포. </li><li> 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다. </li><li> 상층 액에 이전과 유리 구슬의 동일한 볼륨을 추가합니다. </li><li> 다시 한번 최대 교반에서 4 ℃에서 30 분 동안 소용돌이. </li><li> 200 XG 30 초 원심 분리기 짧게는 유리 구슬을 해결합니다. 상층 액을 수집합니다. </li><li> 5 분 5,030 XG에 원심 분리기는 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거합니다. 세포 용 해물 인 상층 액을 수집합니다. </li></ol> 5. 조직의 균질화 <ol><li> 용해 버퍼에 마우스 척수 조직의 9 해결책 : 1의 부피 : 질량을 확인합니다. 참고 :이 방법은 다른 다양한에 적용 할 수있다ENT 조직 샘플. </li><li> 남아있는 청크가 없다는 것을 보장하기 위해 30 초 동안 균질 기에서 2 레벨의 설정을 사용하여 조직을 균질화. </li><li> 핵, 세포막 손상되지 않은 세포를 제거하기 위해 3 분 동안 5,030 XG에 스핀 다운. </li><li> 해물 인 상층 액을 수집합니다. </li></ol> 6. 샘플 유도체 화 <ol><li> 피어스 BCA 단백질 분석 키트 프로토콜에 의해 지정된대로 비색 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 조직 파쇄 액의 단백질 농도를 결정하기 위해 96 웰 플레이트 분석 bicinchoninic 산 (BCA)을 수행한다. </li><li> 탈 이온화 (DI) 물을 사용하여 50 μL에 총 단백질의 20 μg의에 해당하는 나누어지는 가져와. </li><li> 솔루션 HA-UB-비닐 설폰 (VS)의 1.35 μm의 2 μl를 추가하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이것은 최종 반응 혼합물에 프로브를 50 nm의 용 해물 20 μg의 결과. 이 더빙 기능들의 태깅을 위해 큰 몰 과량이다. </li><li> 나는95 ° C에서 5 분간의 램 믈리 시료 완충액에서 샘플 ncubate. 52 ㎕의 반응 부피로 사용 배 샘플 완충액 26 μL, 4X 샘플 완충액 13 μL 또는 6X 샘플 완충액 8.87 μL를 들어. </li><li> 젤을로드하기 전에 얼음 쿨. </li></ol> 7. 서쪽 오점 <ol><li> 준비된 샘플의 40 μL와 12 웰 4-20% 트리스 - 글리신 젤로드 </li><li> 이온 전면이 바닥에 도달 할 때까지 95 V에서 젤을 실행합니다. </li><li> 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인 상에 겔의 하룻밤 전송을 수행합니다. </li><li> 아미 검은 얼룩의 막을 인큐베이션하고 각 레인에있는 단백질의 양을 보여주는 화상을 얻을 membane 스캔. </li><li> 막 Destain 및 차단하는 1 시간 동안 PBS에 5 % 우유에 품어. </li><li> 1의 농도 차 항 HA 항체에 막을 인큐베이션 : 어느 밤새 4 ℃에서 또는 실온에서 4 시간 동안 PBS에서 10,000 5 % 우유. </li><li> f를 3 세척을 수행0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다. </li><li> 1의 농도로 마우스 고추 냉이 퍼 옥시 다제에 막을 인큐베이션 : PBS 10,000 5 % 우유를 적어도 2 시간 동안. </li><li> 0.1 % 트윈 20 세제와 PBS에 5 분마다 3 세척을 수행합니다. </li><li> PBS에서 5 분 동안 1 세척을 수행합니다. </li><li> 10 분 동안 화학 발광 검출 시약에서 부화 막과 화학 발광 검출기를 이용하여 검출한다. 검출기에 자동 노출 설정을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

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유비퀴틴은 기본적인 셀룰러 활성이기 때문에, 규제 메커니즘을 이해하는 것이 질병의 병리 과정을 발굴하는 키가 될 수있다. HA의 사용은 여기에보고 UB 유래 활성 부위 감독 프로브는 UB-매개 단백질 분해 연구를위한 쉬운,하지만 매우 적용 할 수있는 방법을 제공하는 태그. 이 방법은 신속하고 저렴 개별적 더빙 각각 공부보다 길다. 유리 비드를 사용하는 -이 방법에서, 세?...

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)은 포유 동물 세포에서 주요 분해 경로의 하나로서 역할을한다. 프로 테아 좀 저하 행 기판을 공유 유비퀴틴 (UB) 1 중합체와 태그. 타겟 기판 분해 테아로 들어가기 전에, 폴리 - 유비퀴틴 태그는 제거되어야한다. 효소 (더빙) deubiquitinating 알려진 효소 클래스 유비퀴틴 분자 (2)의 제거 및 재활용 할 책임이있다. 이는 셀 3의 백 작업 거의 더빙이 있다는 인간 게놈으로부터 예측되어왔다. UB-매개 세포 과정을 조절 움직여 같은 많은 수의,이 효소를 공부에만 발현 수준에 대한 정보를 제공 mRNA의 기술 활동 및 서부 블로 팅에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에 문제를 제시한다. 인플루엔자 헤 마글 루티 닌 (HA)의 사용은 공유 개조를 허용 활성 부위 지향 프로브 UB 유래, 태그기능 더빙 따라서의 형 치수는 웨스턴 블롯 4에이 효소의 활동의 직접적인 시각화를 제공합니다. 프로브는 활성 부위 시스테인 잔기 5 자살 기질로서 작용 C 말단 티올 반응성기를 갖는다. 이러한 프로브, 상기 셀의 양쪽 병리 생리 학적 상태에 따라 다수의 더빙의 활성 및 발현 가능성을 연구 할 수있다. DUB 활성의 변화는 파킨슨, 알츠하이머, 빈혈 및 각종 암 6-10 같은 병리 적 상태의 범위에 연루되어왔다. 이 기술은 질병의 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 논문에서는 유리 비드를 사용하여 용해 된 헬라 세포 및 M17에서이 기술의 애플리케이션을 도시한다. 또한, 우리는 마우스 척수 조직 샘플에서이 방법을 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법에서 얻은 정보를 식별하기위한 출발점으로 사용될 수있다치료 대상뿐만 아니라 다른 질병 상태의 연구를위한 모델을 확립. 이 기술의 진정한 유틸리티는 단일 분석에서 여러 더빙에 대한 정보를 제공 할 수있는 능력에있다.

<table><tbody><tr><td>PowerGen 125 (homogenizer)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-261-02P</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-driven filters 0.22 &amp;micro;m</td><td></td><td>BPV2210</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, acid washed &amp;le;106 &amp;micro;m (~140 U.S. sieve)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4649-10G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>DL-dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; w/ filter cup 250 ml 120/cs</td><td>Cellstar</td><td>T-3001-2</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>HI FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-HA antibody produced in mouse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9658</td><td></td></tr><tr><td>Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-UW0155-0025</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli&#039;s SDS-Sample Buffer (4x, reducing)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-110R</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템은 최근 신경 변성 질환 및 암을 비롯한 다양한 병리에 관여한다. 이러한 관점에서,이 시스템의 조절 메커니즘을 연구하는 기술은 전술 한 질환의 세포 및 분자 적 프로세스를 해명에 필수적이다. 이 논문에 설명 된 적혈구 응집소 유래 유비퀴틴 프로브의 사용은이 시스템의 연구를위한 유용한 도구로서 기능한다. 이 논문은 효소 활성을 deubiquitinating의 직접적인 시각화를 제공 분석을 수행 할 수 있도록 해주는 방법을 자세히 설명합니다. Deubiquitinating 효소는 프로 테오 열화를 제어하고, 사용자가 하나의 분석에서 여러 효소의 활성을 조사 할 수 있도록 자신의 활성 부위에서 기능적 유사성을 공유한다. 해물을 부드러운 기계 세포 파괴를 통해 얻은 액티브 사이트 감독 프로브와 함께 배양한다. 비활성 효소가 결합되지 않은 유지하면서 기능 효소는 프로브와 태그. 실행으로닝이 분석에서, 사용자는 활성 및 빠르고 손쉽게 방식으로 여러 deubiquitinating 전위 효소 발현 모두에 대한 정보를 획득한다. 현재의 방법은 인간 세포에서 예측 백 deubiquitinating 효소 개별 항체를 사용하는 것보다 훨씬 더 효율적이다.

배양 된 M17과 헬라 세포는 프로토콜 (3 셀 수확)에 자세히 방법 및 마우스 척수 조직을 얻었다을 사용하여 수확했다. 세포 펠렛 / 척수 조직은 시약 제조 섹션에 기재된 용해 완충액으로 튜브에 넣었다. 세포 펠릿을 균질화 (도 1b)를 이용하여 균질화시켰다 유리 비드 (도 1a) 및 마우스 척수 조직 샘플을 사용하여 용해시켰다. 용해 또는 균질화 한 후, 샘플을 유리 비드 및 / ?...

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Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다.

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

method-for-measuring-activity-deubiquitinating-enzymes-cell-lines

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K 조회수.  University of Minnesota.  현재 프로토콜은 기능적 상동 deubiquitinating 효소의 활성을 측정하는 방법을 자세히 설명. 전문화 된 프로브에 공유 효소를 검출하고 수정할 수 있도록. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 잠재력을 보유하고있다. 

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Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

연구

생화학

In Vitro Ubiquitination and Deubiquitination Assays of Nucleosomal Histones

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination of chromatin function and DNA-associated processes. This modification involves a sequential action of several enzymes including E1 ubiquitin-activating, E2 ubiquitin-conjugating and E3 ubiquitin-ligase and is reversed by deubiquitinases (DUBs). Ubiquitination induces degradation of proteins or alteration of protein function including modulation of enzymatic activity, protein-protein interaction and subcellular localization. A critical step in demonstrating protein ubiquitination or deubiquitination is to perform in vitro reactions with purified components. Effective ubiquitination and deubiquitination reactions could be greatly impacted by the different components used, enzyme co-factors, buffer conditions, and the nature of the substrate.&#160; Here, we provide step-by-step protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reactions. We illustrate these reactions using minimal components of the mouse Polycomb Repressive Complex 1 (PRC1), BMI1, and RING1B, an E3 ubiquitin ligase that monoubiquitinates histone H2A on lysine 119. Deubiquitination of nucleosomal H2A is performed using a minimal Polycomb Repressive Deubiquitinase (PR-DUB) complex formed by the human deubiquitinase BAP1 and the DEUBiquitinase ADaptor (DEUBAD) domain of its co-factor ASXL2. These ubiquitination/deubiquitination assays can be conducted in the context of either recombinant nucleosomes reconstituted with bacteria-purified proteins or native nucleosomes purified from mammalian cells. We highlight the intricacies that can have a significant impact on these reactions and we propose that the general principles of these protocols can be swiftly adapted to other E3 ubiquitin ligases and deubiquitinases.

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in cellular processes and is tightly coordinated by deubiquitination. Defects in both reactions underlie human pathologies. We provide protocols for conducting ubiquitination and deubiquitination reaction in vitro using purified components.

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

Ubiquitination is a post-translational modification that plays important roles in various signaling pathways and is notably involved in the coordination ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. They include ubiquitin-activating enzyme E1, ubiquitin-conjugating enzyme E2, and ubiquitin ligase E3. Unlike to E1 and E2, E3 ubiquitin ligases display substrate specificity. On the other hand, numerous deubiquitylating enzymes have roles in processing polyubiquitinated proteins. Ubiquitination can result in change of protein stability, cellular localization, and biological activity. Mutations of genes involved in the ubiquitination/deubiquitination pathway or altered ubiquitin system function are associated with many different human diseases such as various types of cancer, neurodegeneration, and metabolic disorders. The detection of altered or normal ubiquitination of target proteins may provide a better understanding on the pathogenesis of these diseases. &nbsp;Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro. These protocols are also useful to detect other ubiquitin-like small molecule modification such as sumolyation and neddylation.

Ubiquitination is a key posttranslational modification carried out by a set of three enzymes. Mutations of genes involved in this modification are associated with many different human diseases. Here, we describe protocols to detect protein ubiquitination in cultured cells in vivo and test tubes in vitro.

단백질 Ubiquitination의 감지

Ubiquitination, the covalent attachment of the polypeptide ubiquitin to target proteins, is a key posttranslational modification carried out by a set of ...

생물학

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Ubiquitylated, SUMOylated 및 ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks 측정

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, methyltransferases, etc.) malfunctioning, or exogenous agents such as chemotherapeutics and crosslinking agents. Once DPCs are induced, several types of post-translational modifications (PTMs) are promptly conjugated to them as early response mechanisms. It has been shown that DPCs can be modified by ubiquitin, small ubiquitin-like modifier (SUMO), and poly-ADP-ribose, which prime the substrates to signal their respective designated repair enzymes and, in some cases, coordinate the repair in sequential manners. As PTMs transpire quickly and are highly reversible, it has been challenging to isolate and detect PTM-conjugated DPCs that usually remain at low levels. Presented here is an immunoassay to purify and quantitatively detect ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-ribosylated DPCs (drug-induced topoisomerase DPCs and aldehyde-induced non-specific DPCs) in vivo. This assay is derived from the RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery) assay that is used for the isolation of genomic DNA containing DPCs by ethanol precipitation. Following normalization and nuclease digestion, PTMs of DPCs, including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation, are detected by immunoblotting using their corresponding antibodies. This robust assay can be utilized to identify and characterize novel molecular mechanisms that repair enzymatic and non-enzymatic DPCs&#160;and has the potential to discover small molecule inhibitors targeting specific factors that regulate PTMs to repair DPCs.

저자 스포트라이트: DNA 단백질 교차결합의 정량적 검출 및 번역 후 변형(Post-Translational Modifications)  

The present protocol highlights a modified method to detect and quantify DNA-protein crosslinks (DPCs) and their post-translational modifications (PTMs), including ubiquitylation, SUMOylation, and ADP-ribosylation induced by topoisomerase inhibitors and by formaldehyde, thereby allowing the study of the formation and repair of DPCs and their PTMs.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Cleavage Assay를 사용한 신경 발달 장애의 DUB 변이체 평가

Measuring Enzymatic Activity of Neurodevelopmental Disorder-Associated Deubiquitylating Enzymes via an In Vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. Discrete disorders caused by single genes provide models to investigate mechanisms driving atypical neurodevelopment. Variants of genes encoding deubiquitylating enzyme (DUB) family proteins are associated with several NDDs, but there is a need to determine the pathogenic mechanisms of disorders driven by these gene variants. The impact of gene variants on DUB activity can be experimentally determined using a substrate-independent in vitro ubiquitin cleavage assay. This assay does not require knowledge of downstream substrates to directly measure catalytic activity. Here, the protocol for determining the impact of gene variants on enzymatic activity is modeled using the DUB Ubiquitin Specific Protease 27, X-linked (USP27X), which is mutated in X-linked intellectual disability 105 (XLID105). This experimental pipeline can be used to clarify the mechanisms underlying neurodevelopmental disorders driven by variants in DUB genes.

<meta charset="utf8"></head><body>In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

This protocol explains how to measure the effect of genetic variation associated with neurodevelopmental disorders on deubiquitylating enzyme activity by combining recombinant protein purification with ubiquitin chain cleavage assays.

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

Neurodevelopmental disorders (NDDs) are associated with impairments in nervous system function but often remain poorly understood at the molecular level. ...

세포주 및 조직 샘플에서 Deubiquitinating 효소의 활성을 측정 방법

요약

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이 비디오의 챕터

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

체외 유비퀴틴화 및 뉴클레오소말 히스톤의 이중화 율법의 비퀴틴화 어설션

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

단백질 Ubiquitination의 감지

병렬 반응 모니터링에 의한 유비퀴틴 연쇄 분석

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정

In vitro Ubiquitin Chain Cleavage Assay를 통한 신경 발달 장애 관련 Deubiquitylating Enzymes의 효소 활성 측정