이 프로토콜은 다운스트림 전 생체 분석용 전체 조직 표본에서 작은 세포 외 소포를 추출하고 격리하기 위한 엄격하고 재현 가능한 기술을 제공합니다. 현재 달성 가능한 가장 높은 수준의 순도 를 통해,이 방법은 종양을 포함한 다양한 조직 표본으로 분비된 간질 소포의 직접적인 형태, 면역 페노티픽 및 깊은 특성화를 용이하게합니다. 여기에서, 우리는 두뇌와 폐 종양 견본에서 조직 전기의 격리를 보여줍니다.
그러나, 이 기술은 다양한, 양성, 또는 그밖 종양 견본을 이용한 연구 결과에또한 적용될 수 있습니다. 시작하려면, 조직의 모든 0.4 ~ 1.0 그램에 대한 최대 절전 모드 -E 배지에서 해리 버퍼의 10 밀리리터를 준비합니다. 50 밀리리터 튜브의 완충제에 전체 신선하거나 냉동 된 조직을 추가하고 20 분 동안 섭씨 37도에서 따뜻한 수조에 배양하십시오.
그 후, 해리 버퍼에서 최종 1배 농도에 대한 프로테아제 및 인산 억제제를 추가한다. 티슈로 용액을 느슨한 핏 다운균제로 붓습니다. 시료당 약 30개의 느린 스트로크를 사용하여 조직을 부드럽게 해리시합니다.
그런 다음 해리된 조직 및 완충액을 50밀리리터 원판 튜브로 이송합니다. 500x g의 원심분리기와 5분간 섭씨 4도에서 세포와 나머지 섬유 또는 응집력 있는 조직 단편을 펠릿합니다. 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 2, 000x g, 섭씨 4도에서 10분 동안 펠릿과 큰 셀룰러 파편을 폐기합니다.
이 상체를 깨끗한 50 밀리리터 원전 튜브로 옮기고 원심분리기를 10, 000x g, 섭씨 40도에서 40분간 전달하여 원치 않는 큰 소포 나 작은 세포 사멸 체를 펠렛합니다. 0.45 마이크로미터 필터를 통해 깨끗한 12 밀리리터 초원심 분리 튜브에 초신수를 증정한다. 다음으로, 초원심분리기 샘플을 100, 000x g및 섭씨 4도에서 2시간 동안, 작은 전기 를 펠릿합니다.
상체를 데수제하고 5~10분 동안 반전된 초원심분리관을 두드리고, 튜브 측면에 잔류액체를 제거합니다. 이어서, EV 펠릿을 0.25 의 1.5 밀리리터에서 0.25 어금니 자당 버퍼로 재연한다. 파라필름으로 튜브를 덮은 다음 EV를 용액으로 소용돌이시다.
실온에서 10~15분 동안 초원심분리기 튜브를 흔들어 보냅니다. 그리고 다시 한 번 소용돌이. 튜브 의 바닥에 액체 현탁액을 복구하기 위해 1, 000x g 미만의 속도로 튜브를 간략하게 원심 분리합니다.
필요한 경우, 하룻밤 4섭씨에 서스펜션을 보관하십시오. 먼저, 전기자동차를 함유한 자당 트리스 버퍼의 1.5 밀리리터에 60%의 iodixanol의 1.5 밀리리터를 추가하여 30%iodixanol을 포함하는 최종 솔루션을 만듭니다. 용액을 완전히 혼합하기 위해 여러 번 파이펫을 위아래로 합니다.
이 솔루션을 5.5 밀리리터 초원심분리 튜브의 바닥으로 옮긴다. 다음으로 60%의 iodixanol 스톡을 초순수 수분과 혼합하여 20%와 10%의 iodixanol 용액의 최소 1.5밀리리터를 준비합니다. 주사기와 18 게이지 바늘을 사용하여 20%의 iodixanol 용액의 1.3 밀리리터를 측정하고 바닥 그라데이션 위에 조심스럽게 레이어링합니다.
바늘의 벨이 관 내부와 접촉하여 반월상 연골 바로 위에 있고 밀도 인터페이스에서 층을 혼합하지 않도록 현명하게 해결책을 추가하십시오. 이어서, 동일한 기술을 사용하여 20%층 위에 10%의 iodixanol 용액의 1.2 밀리리터를 층. 극심분리튜브를 로터 버킷에 신중하게 균형있게 조정합니다.
스윙 버킷 로터의 가속 및 감속 속도를 최소 속도로 설정하고 원심분리기는 268, 000x g, 섭씨 4도에서 50분 동안 설정합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 밀도 그라데이션의 1-10분획에 해당하는 각 샘플에 대해 10 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에 라벨을 부착하십시오. 원심분리가 완료되면 로터 버킷에서 튜브를 부드럽게 제거하고 안정된 홀더에 넣습니다.
파이펫 10 해당 튜브로 그라데이션의 상단에서 490 마이크로 리터의 직렬 분수. 굴절계를 사용하여 분수의 굴절률을 측정합니다. 그런 다음 각 분획을 깨끗한 12 밀리리터 초원심분리 튜브로 옮긴다.
각 튜브에 1x PBS의 5밀리리터를 넣고 천천히 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 튜브 상단에 1x PBS의 6 밀리리터를 추가하고 조심스럽게 다시 섞습니다. 초원심분리기튜브는 100, 000x g, 섭씨 4도에서 작은 소포를 다시 펠릿합니다.
상체를 데칭하고 단백질 분석을 위해 소포를 용해하거나 변성 분석을 위해 전기를 다시 중단하기 전에 튜브를 건조하게 누릅니다. 단백질 분석을 위해 EV를 lyse하려면 EV 펠릿에 프로테아제 억제제가 함유된 강력한 용해 완충제 40마이크로리터를 추가합니다. 각 튜브 위에 파라필름을 놓고 소용돌이를 적극적으로 배치합니다.
다음으로, 실내 온도와 소용돌이에서 20 분 동안 튜브를 다시 흔들어. 샘플을 1, 000x g에서 30~60초 동안 간략하게 원심분리하여 전체 샘플 부피를 회수합니다. 각 샘플을 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 추가 처리를 위해 준비될 때까지 섭씨 20~80도 사이의 온도에 보관하십시오.
면역블롯 분석을 위해 정제된 용액을 준비하려면 5x Laemmli 샘플 버퍼를 샘플에 추가하여 최종 농도를 1배 나늘게 합니다. 샘플을 섭씨 95도에서 5~10분간 끓입니다. 그런 다음 10% SDS 페이지 젤에 1-10의 동일한 분획을 로드합니다.
동일한 양의 조직 동종을 로드합니다. 전기 전도 및 서양 얼룩 분석을 수행하여 정제 된 용해에서 EV 단백질을 확인하고 상대 적인 EV 풍부를 분수로 비교합니다. 이 연구에서는 세포 외 소포를 추출하고 전체 조직에서 정제됩니다.
10~30%의 극심분리에 이어, 광전기자동차의 인구가 2분까지 이동하는 것을 볼 수 있으며, 조밀한 전기자동차의 집단은 조직 유형에 따라 최대 5개로 이동하는 것을 볼 수 있다. 그라데이션 분획의 대표적인 면역블롯은 작은 종양 유래 EV의 효율적인 분리 및 정제를 5분5로 나타낸다. 특히, 폐 종양 표본은 이전에 전체 뇌 조직에서 수확 한 빛 전기에 비해 조밀 한 전기 에 풍부 나타납니다.
분획을 함유하는 우세한 소포에서 조직 유래 소포의 대표적인 나노 입자 추적 분석 및 전자 현미경 검사는 전체 소포의 농축 및 보존을 입증한다. 작은 EV의 알려진 크기와 구조와 일치합니다. 간질 전기 는 새로운 진단 또는 예후 바이오 마커 분석의 개발을위한 유망한 목표를 나타냅니다.
이 기술은 연구원에게 다운스트림 유틸리티용 소포의 추출 및 정제를 위한 도구를 제공합니다. 전체 또는 lysed 조직 전기 의 추출 에 따라, 프로 테오믹을 포함 하 여 소포의 광범위 한 특성화, 유 전체, 그리고 lipidomic 분석 수행 될 수 있습니다. 또한 샘플은 더 많은 표적 접근 에 사용될 수 있습니다.
조직 견본에서 직접 분리된 소포는 종양 창세기를 포함하여 질병 기계장치에 추가 통찰력을 제공할 수 있고, 미래에 중요한 진단 또는 예후 공구를 제공할 수 있습니다.
