Name: static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes
Uploaded: 2014-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Hirschil 신뢰, 마이클 Saperstein 의료 학자 연구 자금 및 NYU 화이트 헤드의 교제는이 작업을 지원했다.

1. 마이크로 웰스에게 코팅 참고 :이 단계의 목표는 T 세포 LFA-1에 대한 리간드 역할을하는 ICAM-1과 코트 폴리스티렌 표면에 있습니다. <ol><li> 다음과 같은 솔루션을 준비 : <ol><li> 재현 탁하여 코팅액을 제조 재조합 ICAM-1 칼슘 (1 mm의 풍부한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, 산도 7.4)와 염화칼슘), 마그네슘 (MgCl2를 2 nm의 2). ICAM-1의 최종 농도가 0.7 ㎎ / ㎖의 원액으로 만든 및 -80 ° C 냉동고에 보관 10 ㎍ / ㎖, 있는지 확인하십시오. </li><li> 0.5 %의 인간 (또는 소) 혈청 알부민 (HSA / BSA), 2 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘과 PBS를 풍부하게하여 접착 솔루션을 준비합니다. </li><li> PBS에 2 mM의 MgCl2를 1 mM의 염화칼슘을 추가하여 세척 솔루션을 준비합니다. 37 모든 솔루션을 따뜻하게사용하기 전에 C를 °. </li></ol></li><li> 세척 용액 50 μL와 24 우물을 씻으십시오. 이 씻지 않은 우물, 긍정적 인 (PMA 처리 된 세포), 마이너스 (코팅 우물) 컨트롤이 포함됩니다. 각 조건은 적어도 세 개의 우물 (세중)을 설정하십시오. </li><li> 각 웰에 코팅 용액 50 μl를 추가합니다. 코팅되지 않은 제어 우물에 추가하지 마십시오. 37 ° C의 배양기 안에서 한 시간 동안 배양한다. </li><li> 팁은 웰의 바닥을 터치 할 수 있도록하지 않고, 부드럽게 도포 액을 대기음. 세척 용액을 50 μL로 한 번 씻는다. </li><li> 접착 액의 50 μl를 추가하고 37 ° C의 배양기 내에서 한 시간 동안 마이크로 플레이트를 품어. </li><li> 대기음 부드럽게 50 μL 세척 용액을 한 번 씻어. 그러나 그것은 하룻밤 4 ℃에서 보관하는 것이 가능하고, 같은 날에 플레이트를 사용하고, 다음 날을 사용합니다. </li></ol> 혈액에서 2. T 세포 분리 <ol><li> 50 μL / ㎖ O에 인간의 T 세포 농축 칵테일을 추가F 전체 혈액 (항응고제 3 ㎖ (헤파린, EDTA 또는 구연산) 전체 혈액에 대한 예를 들어, 칵테일 150 μl를 추가합니다). 잘 섞는다. </li><li> 실온에서 20 분 배양한다. </li><li> 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 3 ㎖의 혈액을 처리하고 실온에서 1 % D-글루코스와 충실 (칼슘 및 마그네슘)없이 PBS의 동일 부피를 추가한다. 파스퇴르 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 원심 분리 관에 15 ㎖의 피콜-Paque PLUS를 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 림프구 분리 매체에 혈액 샘플을 희석 6 ㎖의 레이어. </li><li> 휴식 떨어져 20 ° C에서 20 분 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 인터페이스에 방해받지 림프구 계층을 떠나 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 상위 계층을 그립니다. 플라즈마의 상위 계층은 나중에 사용하기 위해 저장 될 수 있습니다. 깨끗한 파스퇴르 피펫 깨끗한 원심 분리기 튜브에 림프구 층을 전송 사용. </li><li> 림프구에 PBS의 3 권 (9 ㎖)에 추가합니다. 부드럽게하여 세포를 일시 DRA날개 그들과 파스​​퇴르 피펫 중. </li><li> 20 ℃에서 5 분 400 XG에 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 제거합니다. 림프구는 이제 응용 프로그램에 적합한 매체에서 일시 중단해야합니다. 20 ㎖의 T-75 플라스크에 배양 세포를 이동 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 RPMI 1640 매체. </li></ol> 세포의 3. 준비 참고 : 세포가 형광 시약으로 표시되어야하는 전제 조건이다. 이 프로토콜에서 발현하는 세포가 수용 가능한 대안 카르복시 플루오 레세 인 숙신 에스테르 (CFSE), 그러나 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용합니다. <ol><li> 혈구를 사용하여 2.4 × 10 6 T 세포 (각 웰에 1 × 10 5)를 계산합니다. </li><li> 혈청 (혈청 기아) 부족 배양 배지에서 세포를 Resuspend. 37 ° C의 배양기에서 2 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 5 분 (400 XG)에 대한 세포를 원심 분리기. 미디어를 대기음1 ml의 PBS에 재현 탁. </li><li> 1:1000 희석 (5 mm로 만들어 주)에 CFSE를 추가합니다. 빛으로부터 덮고 실온에서 13 분 동안 배양한다. </li><li> 37 ° C PBS 10 ㎖를 첨가하여 반응을 중지하고 5 분 400 XG에 스핀. </li><li> 예열 접착 용액 (50 μL 당 1 × 10 5 세포)의 1.2 ml의 세포 펠렛을 다시하면 일시 중지합니다. </li></ol> 셀의 4. 자극 주 : 접착을 개시하기 위해, 세포가 자극되어야한다. 다음 실험에서 세포를 항-CD3 항체를 사용하여 가교 결합 TCR을 통해 자극 그러나 수용성 SDF-1의 대안이 될 수있다. 실험의 목적에 따라 다양한 약리 시약은 세포 접착에 미치는 영향을 연구하기 위해 자극 전 또는 동안 첨가 될 수있다. 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)는 두 번째 메신저 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사하고, 따라서 여러 키나제를 활성화 포르 볼 에스테르입니다하류 TCR (주로 단백질 키나제 C)들; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다. <ol><li> 37 ° C로 마이크로 따뜻하게 </li><li> 8 빈 1.5 ML 튜브 (각 튜브에 150 μL), 각 조건에 대해 하나의 튜브에 세포를 나눈다. </li><li> 그에 따라 세포 치료 : <ol><li> 긍정적 인 제어를 제공하기 위해 10 NG / ML에서 PMA와 함께 하나의 튜브를 자극한다. 자극에 대한 제어 ( &quot;자극 없음&quot;), 씻지 않은 컨트롤을로드 ( &quot;아니오 세척&quot;), 및 ICAM-1 코팅 제어 ( &quot;코팅&quot;) 역할을하는, 처리되지 않은 세 개의 튜브를 유지합니다. </li><li> 항-CD3 항체의 다양한 농도 (0.1, 1, 5, 10 ㎍ / ml)로 네 개의 튜브를 자극한다. 지연하지 않고 다음 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 또한 각 빈에 자극을 세포 믹스의 나누어지는 50 μL. 웰 당 세포의 마지막 수는 1 × 10 5이다. </li><li> 15 분 동안 37 ° C의 배양기에서 마이크로 플레이트를 놓습니다. 참고 : 일부 T 세포 라인이 짧은 stimula을 필요로<html> 기 시간. 이 시간 동안, 세포는 웰의 바닥에 정착되고 표적 리간드에 밀착. </li></ol> 5. 세탁 멀리 비 부착 세포 주 :이 단계의 목적은 리간드 - 코팅 표면과 단단히 접촉을 형성 할 수 없었던 세포를 제거하는 것이다. 같은 물리적 힘이 모든 우물에 적용되어 있는지 확인하기 위해이 단계를위한 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 이는 부착 세포의 비율의 계산을 돕기 위해 씻지 표시된 대조군 웰을 유지하는 것이 중요하다. <ol><li> 각 우물에 따뜻한 접착 용액 150 μl를 추가합니다. 우물에서 매체를 제거하기 전에 몇 초 동안 부드럽게 판을 흔들어. 끝으로 우물의 바닥을 만지​​지 마십시오. </li><li> 이 과정을 세 번 반복합니다. 버퍼를 안팎으로 피펫 팅 할 때 피펫의 방향을 변경합니다. </li></ol> 6. 자기편 세포의 비율을 결정 _content &quot;&gt; 주 :이 단계에서 형광 플레이트 판독기 내에서 각 웰의 형광 강도를 측정하기 위해 사용되는 강도가 부착 세포의 수와 직접적인 상관 관계에있다.. <ol><li> 플레이트 리더를 켭니다. 바탕 화면에 바로 가기 아이콘을 클릭하여 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다. <ol><li> &quot;작업&quot;메뉴에서 새로운 프로토콜을 설정하는 &quot;새&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;작업&quot;메뉴에서 &quot;읽기&quot;옵션을 선택합니다. &quot;형광 강도&quot;를 클릭하고 &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. </li><li> 드롭 다운 메뉴에서 &quot;여기 파장 485&quot;과 &quot;방출 파장 528&quot;를 선택합니다. &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. </li><li> &quot;눈&quot;옵션 메뉴에서 &quot;바닥&quot;을 선택하고 &quot;확인&quot;탭을 누르십시오. 다시 &quot;작업&quot;메뉴로 이동하여 37 ° C로 온도를 설정하고 &quot;확인&quot;을 클릭합니다. </li><li> 플레이트 리더로 ​​마이크로 플레이트를 삽입하고&quot;실행&quot;을 클릭합니다. 결과는 엑셀 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음과 같은 공식을 사용하여 부착 세포의 비율을 계산 : 자기편 세포의 백분율 = (세척 우물에서 읽을 평균 형광 강도) / (씻지 않은 세포에서 읽을 평균 형광 강도) × 100 %. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 (12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 &#39;갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을?...

T 림프구의 접착은 면역 반응 1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 (2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 &#39;프론트 엔드&#39;에서 유착의 형성과 &#39;후부&#39;에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 6에 그대로 유지해야합니다. 흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) - 1,이 모든 과정 5 필수적이다. LFA-1가 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 다양한 구성원과의 상호 작용을 통해 부착을 매개한다. LFA-1로 가장 높은 선호도가 가장 광범위하게 연구 리간드는 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1입니다. 비 활성화 순환 림프구 따라서 세포 표면에 LFA-1 및 ICAM-1-코팅 된 표면에 부착 할 수없는 낮은 선호도를 표현한다. LFA-1 궁합 변수와 같은 G 단백질 결합 수용체 활성화, 사이토킨 자극 및 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개되는 신호와 같은 여러 시그널링 이벤트에 의해 조절된다. LFA-1은 세포 외 공간에 세포 내 활성을 전달의 결과 선호도가 높은 포름 티ICAM-1의 hrough의 상호 작용. 이 통로는 7 신호 내부 아웃이라고한다. 마찬가지로, 세포 외 공간에서 LFA-1을 통해 신호는 외부에서 신호라고합니다. 인사이드 - 아웃 및 신호 외부 -에 참여 폭포 신호 세포는 현재의 연구의 주요 초점이다. 작은 GTPase의 RAP1는 최근 그 TCR 내고 8 신호 사이토 카인의 공통 신호 내부 아웃의 핵심 구성 요소로 떠오르고있다. T 세포 접착이 지배적 부정적인 RAP1 9의 발현에 의해 차단되는 반면 인테 활성화에 RAP1의 중요한 역할은, RAP1의 과발현은 T 세포의 인테 의존 접착을 자극 발견에 의해 강조 표시됩니다. RAP1으로 인테 규제에 대한 우리의 이해의 이러한 발전은 체외 도구로 사용하여 수행되었다. 그 중 여기에 설명 된 정적 접착 분석이다. 이 방법의 전반적인 목표는 T를 연구하는 것입니다ICAM-1 코팅 표면에 세포 접착. 구체적으로는 객관적으로 측정하고 다른 조건에서 실시간으로 살아있는 세포에서의 카운터 리간드쪽으로 LFA-1 친화력을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 기술은 T 세포와 상호 작용하는 세포 표면을 모방하는 ICAM-1로 코팅 폴리스티렌 웰을 사용한다. 많은 전술 정적 T 세포 부착 분석법 실험적 복잡한되었습니다. 주로 T 세포에 필요한 이러한 분석은 방사성 레이블 T 세포 접착 용 기판 등의 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 만들 배양 소 각막 세포를 이용, 또는 T 세포 접착 (10)을 촉진하기 위해 확장 된 기간 동안 비 생리적 인 T 세포 자극을 요구한다. 많은 다른 분석 시스템 (11)에서 이용되는 것처럼, 계측법 및 현미경 흐르게 비해 접착 배양 다음 T 세포를 정량화하는 형광 측정의 사용은 정량보다 민감하고 정확한 방법이다. 또한, 단일 세포 microscop인테그린 지역화 IC 분석은 형광 측정과 동일한 방식으로 광범위한 인구 기반 분석을 허용하지 않는다. 활성화 상태 별 LFA-1 항체가 상업적으로 사용할 수 있지만,이 항체는 여기에 설명 된 방법에 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 대체 기술을 통해 가장 큰 장점은 단순하고 동시에 여러 실험 조건을 검사 할 수있는 기능입니다. 특정 응용 프로그램에 대해이 방법을 고려할 때, 하나는 T 세포가 부정적으로 선택한 갓 격리 및 형광 마커로 표시되어야 함을 고려한다.

<table><tbody><tr><td>Plate reader</td><td>BioTek</td><td>Synergy H1 Hybrid</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Fisher</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>96-well microplate with optical bottom</td><td>Corning Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant ICAM-1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>ADP4-050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD3 antibodies</td><td>Ancell</td><td>144-020</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS containing calcium and magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Peripheral lymphocytes</td><td>&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; mouse or human</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td></td></tr><tr><td>Open Gen 5 software</td><td>BioTek</td><td>Version 2.01</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00</td><td></td></tr><tr><td>15 and 50 ml centrifuge tubes</td><td>Fisher</td><td>352099, 352070</td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic Pasteur pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>T-75 culture flasks</td><td>Fisher</td><td>50-754-1366</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep T cell enricment kit</td><td>StemCell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr></tbody></table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는​​ T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 - ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.

아래의 항-CD3 항체의 다양한 농도로 자극 일차 T 세포를 사용하여 접착 분석의 예이다. 그것은 씻지 않은 세포의 형광 (즉, 전체로드)를 알고 있으면 유용합니다. 비자극 세포는 대조군 역할을하고 PMA 처리 된 세포는 항-CD3 항체에 대한 양성 대조군 있습니다. 코팅되지 않은 우물에서 도금 세포는 ICAM-1에 대한 제어 역할을합니다. 비자극 세포의 비율은 10 % ~ 5 % 사이에있는 동안 전형적인 실?...

Watch this Scientific Journal Video about Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes at JoVE.com

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Matrix Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

15.9K 조회수.  New York University School of Medicine.  정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다. 

비디오: Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

생체공학

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a crucial step in this process and therapeutic strategies interfering with adhesion have been successfully established. The anti-&#945;4&#946;7 integrin antibody, vedolizumab, is used for the clinical treatment of Crohn&#39;s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) and further compounds are likely to follow.
The details of the adhesion procedure and the action mechanisms of anti-integrin antibodies are still unclear in many regards due to the limited available techniques for the functional research in this field.
Here, we present a dynamic adhesion assay for the functional analysis of human cell adhesion under flow conditions and the impact of anti-integrin therapies in the context of IBD. It is based on the perfusion of primary human cells through addressin-coated ultrathin glass capillaries with real-time microscopic analysis. The assay offers a variety of opportunities for refinements and modifications and holds potentials for mechanistic discoveries and translational applications.

Dynamic adhesion of immune cells to the vessel wall is a prerequisite for gut homing. Here, we present a protocol for a functional in vitro assay for the impact analysis of anti-integrin antibodies, chemokines or other factors on the dynamic cell adhesion of human cells using addressin-coated capillaries.

Gut homing of immune cells is important for the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (IBD). Integrin-dependent cell adhesion to addressins is a ...

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

Leishmania is an intracellular protozoan parasite that causes a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from self-resolving localized cutaneous lesions to a highly fatal visceral form of the disease. An estimated 12 million people worldwide are currently infected, and another 350 million face risk of infection. It is known that host cells infected by Leishmania parasites, such as macrophages or dendritic cells, can migrate to different host tissues, yet how migration contributes to parasite dissemination and homing remains poorly understood. Therefore, assessing these parasites' ability to modulate host cell response, adhesion, and migration will shed light on mechanisms involved in disease dissemination and visceralization. Cellular migration is a complex process in which cells undergo polarization and protrusion, allowing them to migrate. This process, regulated by actin and tubulin-based microtubule dynamics, involves different factors, including the modulation of cellular adhesion to the substrate. Cellular adhesion and migration processes have been investigated using several models. Here, we describe a method to characterize the migratory aspects of host cells during Leishmania infection. This detailed protocol presents the differentiation and infection of dendritic cells, the analysis of host cell motility and migration, and the formation of adhesion complexes and actin dynamics. This in vitro protocol aims to further elucidate mechanisms involved in Leishmania dissemination within vertebrate host tissues and can also be modified and applied to other cell migration studies.

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

Here we study implications of Leishmania-host interaction by exploring Leishmania-infected dendritic cells migration. The differentiation and infection of dendritic cells, migration analysis, and the evaluation of adhesion complexes and actin dynamics are described. This method can be applied to other host cell migration studies when infected with Leishmania or other intracellular parasite species.

Leishmania is an intracellular protozoan parasite that causes a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from self-resolving localized cutaneous ...

인간 호중구에서 β2 Integrin Activation Inhibitors의 스크리닝

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

저자 스포트라이트: β2 Integrin 활성화의 소분자 길항제를 식별하는 방법 개발 

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서 속도론 해석

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

Dynamic Adhesion Assay for the Functional Analysis of Anti-adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease

Cell Migration and Cell Adhesion Assays to Investigate Leishmania-Host Cell Interaction

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

인테그린 억제 약물 스크리닝을 위한 유세포 분석 기반 고처리량 기법

성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브