이 프로토콜은 EGFR-인테그린 누화를 연구하는 데 사용되는 TGT 센서 플랫폼의 단순성과 세포 기계적 힘에 미치는 영향 때문에 중요합니다. 라오는 세포 역학의 EGF 의존성 조절을 조사하기 위해 개략적으로 설명했다. 상기 프로토콜은 상이한 리간드, 세포 유형, 자극 패러다임에 대해 적응가능하고, 다양한 장력 역치의 TGTs와 결합될 수 있다.
표면 합성은 처음에는 위협적으로 보일 수 있습니다. 핵심은 시약 준비 및 계산을위한 체크리스트를 사용하여 복잡한 단계를 정확하게 수행 할 수 있도록 준비하고 조직하는 것입니다. 첫날에는 최대 여덟 개의 25mm 유리 커버 슬립을 폴리테트라플루오로에틸렌 랙에 넣습니다.
랙을 40밀리리터의 200 방지 에탄올이 들어있는 50밀리리터 붕규산 비커에 넣으십시오. 실온에서 10 ~ 15 분 동안 35 킬로헤르츠의 작동 주파수에서 초음파 처리. 파이렉스 비이커에서 황산과 과산화수소를 3:1 비율로 혼합하고 유리 피펫으로 교반하여 갓 제조한 피라냐 용액 40밀리리터를 50밀리리터 비이커에 채운다.
커버 슬립 랙을 비이커로 옮기고 흄 후드에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 커버 슬립 표면을 에칭한다. 에칭 후 커버 슬립 랙을 핀셋이 있는 초순수로 비이커로 옮깁니다. 커버 슬립을 육안으로 검사하여 유리 표면에 패턴이나 먼지 입자가 없어 표면이 깨끗하게 보이는지 확인합니다.
커버 슬립 랙을 200 프루프 에탄올로 비이커로 옮기고 15 초 동안 두 번 세척하여 표면을 유기 용매로 평형화시킵니다. 커버 슬립 랙을 실온에서 한 시간 동안 3%APTES가 있는 200 방지 에탄올 용액으로 옮겨 커버 슬립을 실란화합니다. 랙을 200 방지 에탄올 용액으로 깨끗한 비이커에 담그십시오.
낮은 출구 압력의 질소 가스를 사용하여 커버 슬립을 건조시킵니다. 커버 슬립을 10 센티미터 폴리스티렌 접시에 넣고 그 안에 파라핀 필름 조각을 평평하게 놓습니다. DMSO에 밀리리터 NHS-비오틴 용액 당 두 밀리그램의 100 마이크로 리터를 파라핀 필름에 놓인 네 개의 커버 슬립에 첨가하십시오.
다른 네 개의 커버 슬립이 위에 있는 샌드위치를 놓고, 두 개의 커버 슬립이 서로 향하도록 하고 그 사이에 기능화 솔루션을 장착합니다. 둘째 날에는 섭씨 네 도에서 접시를 꺼내고 샌드위치 커버 슬립을 분리하십시오. 샌드위치를 분리하는 동안 기능화 된 표면을 긁거나 손상시키지 마십시오.
그런 다음 덮개 슬립을 코팅된 표면이 서로 향하도록 랙에 맞춥니다. 질소 가스로 건조하십시오. 커버 슬립을 그 안에 파라핀 필름이있는 새 접시에 넣으십시오.
800 마이크로리터의 0.1%소 혈청 알부민을 1X PBS에 첨가하여 각 커버슬립에 첨가한다. 커버 슬립을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 표면을 패시베이션하고 후속 기능화 시약의 비특이적 결합을 차단한다. 커버 슬립을 기능화하려면 실온에서 45 ~ 60 분 동안 1X PBS에 스트렙타비딘 밀리리터 당 1 마이크로 그램의 800 마이크로 리터를 첨가하십시오.
TGT 프로브를 열순환기를 사용하여 PCR 튜브에 조립한다. 인큐베이션 후, 커버 슬립을 1X PBS로 세 번 세척한다. 사전 조립된 TGT 프로브 100마이크로리터를 네 개의 커버 슬립에 추가하고 기능화된 면이 프로브를 향하도록 나머지 네 개의 커버 슬립을 사용하여 샌드위치를 만듭니다.
알루미늄 호일로 덮으십시오. 인큐베이션 후, 샌드위치를 분리하고 커버 슬립을 1X PBS로 세 번 세척한다. 커버 슬립을 미리 청소한 이미징 챔버에 조심스럽게 조립하십시오.
표피 성장 인자 자극이 Cos-7 역학, 부착 및 세포 확산에 미치는 영향을 조사하기 위해 Cos-7 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 2분 동안 트립신화합니다. HBSS로 세척하고 800 G에서 5분 동안 원심분리하여 트립신을 중화시킨다. 플레이트 세포는 EGF 없이 밀리리터 EGF 또는 DMEM 당 50 나노그램으로 보충된 DMEM에서 조립된 TGT 표면 상의 40, 000 세포의 밀도로 세포이다.
인큐베이션 후, 세포를 1X PBS로 세 번 세척하였다. 실온에서 12 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 2 밀리리터로 고정하십시오. 커버 슬립을 실온에서 5분 간격으로 1X PBS로 다섯 번 세척한다.
임의로, 커버슬립을 섭씨 37도에서 30분 동안 1X PBS 중의 50-밀리몰 염화암모늄으로 인큐베이션한다. 버퍼 A를 추가하고 커버 슬립이 있는 이미징 챔버를 습도 용기에 넣습니다. 섭씨 37도에서 30분 동안 배양하여 세포를 차단하고 투과시킨다.
1차 항-팍실린 항체를 블로킹 완충액에서 1:250 희석액으로 희석한다. 커버 슬립 당 200 마이크로리터의 일차 항체 용액과 함께 섭씨 37도에서 두 시간 동안 인큐베이션한다. 세포를 1:800 희석액에서 이접합된 염소/항토끼 이차 항체의 혼합물과 커버 슬립당 블로킹 버퍼 200마이크로리터의 1:400 희석액에서 디컨쥬게이션된 팔로이드인의 혼합물과 동시에 라벨링한다.
표면을 5분 간격으로 1X PBS로 다섯 번 세척한다. 시작하려면 목표에 오일을 넣고 샘플 챔버의 커버 슬립 바닥을 청소하고 샘플을 무대에 놓습니다. 세포에 집중하고 완벽한 초점을 맞춥니다.
에피 조명 조리개 다이어프램을 닫고 가운데에 배치하여 RICM을 정렬합니다. 488나노미터 레이저를 실내의 천장에 있는 작은 지점에 초점을 맞추고 임계 각도를 지나갈 때까지 입사각을 높이면서 라이브 모드에서 카메라의 형광을 모니터링합니다. 임계 각도를 초과할 때 배경 형광의 급격한 감소와 단일 초점 평면을 관찰하십시오.
RICM을 사용하여 카메라의 라이브 모드를 사용하여 이미징할 셀을 식별합니다. 488나노미터 여기, 561나노미터 여기에서의 인테그린 장력, 647나노미터 여기에서 팍실린의 RICM 및 TIRF 이미지를 획득한다. 200밀리초의 노출 시간을 사용하여 순차적으로 이미지를 가져옵니다.
커버 슬립을 변경하고 초점을 맞추고 반복하십시오. Cos-7 세포를 인테그린 역학에 대한 리간드 자극과 함께 EGFR 활성화가 미치는 영향을 연구하기 위해 EGF 자극 유무에 관계없이 이러한 TGT 표면 상에 플레이팅하였다. 인테그린이 리간드에 결합하고 프로브의 장력 역치 총합보다 큰 힘을 가하면 DNA 듀플렉스가 분리되어 형광을 유발합니다.
기계적 힘이 파열되지 않은 TGT 프로브는 형광이 아닌 상태로 유지됩니다. 세포를 TGT 표면 상에서 EGF와 함께 또는 없이 60분 동안 인큐베이션하고, 고정시키고, 면역염색하여 세포골격의 초점 부착 분포 및 조직을 표시하였다. RICM 이미지에서, 56-피코네웬톤 TGT 표면 상의 Cos-7 세포 확산은 자극 없이 비하여 EGF 자극으로 유의하게 향상되었다.
EGF에 의한 자극은 Cos-7 세포 확산 및 성장을 나타내는 보다 원형 형태를 가져왔다. 개방 프로브로부터의 형광은 또한 장력 형광 이미지에서 관찰된 바와 같이 EGF 자극과 함께 더 높다. 개방 프로브의 수에 비례하는 개방 프로브의 통합 강도는 자극이 없는 경우보다 EGF 자극으로 훨씬 더 높았다.
커버 슬립의 방향을 항상 기억하고 기능화 된 표면을 위쪽으로 향하게하십시오. 샌드위치를 분리 할 때 표면이 긁히거나 손상되지 않도록 부드럽게하십시오. 표면 합성 후, 세포 부착 또는 기계적 형질도입을 조절하는 세포질 단백질을 프로브할 수 있다.
이를 통해 원형질막에서 세포 역학을 조율하는 데 관여하는 하류 신호 전달 분자를 확인할 수 있습니다.
