이 작품은 HealthGrants DK85035 및 DK074797 (IH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

1. 웜 변종 <ol><li> C. 구하는 엘레은 Caenorhabditis의 유전학 센터 (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc)에서 브리스톨 N2 균주를 야생형과 NGM 플레이트에 그들을 유지 E. 시드 대장균 균주 OP50 7. 참고 : 유전자 변형 웜은 IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) 이전 11 기술로 활용이 생성 된 종자는. IQ6011는 해당 저자의 요청하실 수 있습니다. </li></ol> 수정 C. 2. 준비 엘레 해비 및 재생 매체 (mCeHR) 12 아래에 설명 된대로 mCeHR 액체 매체를 준비합니다. 이 무균 액체 매체는 벌레가 추가 음식 소스없이 증가 할 수 있습니다. 이러한 층류 후드로 엄격히 멸균 조건을 사용하여 무균 액체 매질 및 무균 벌레의 모든 조작을 수행한다. <ol><li> 식료품 점에서 매우 저온 살균 무 지방 우유를 얻습니다. 냉장 프로를 사용덕트 아닌 실온 품. mCeHR 매체 행진에 판 한천 뇌 심장 주입 (BHI)에 우유를 사용하고 무균 상태를 확인하기 위해 30 ° C, 37 ° C에서 3 일 동안 배양하기 전에. -80 ° C에서 50 ㎖ 멸균 튜브 및 저장소에 우유를 이동 </li><li> 다음과 같은 구성 요소를 각각 준비하고 순서와 mCeHR 1 L를 준비하기 위해 주어진 양 (표 1A)의 결합 : 2 mM의 콜린 이산 구연산 10 ㎖, 비타민과 성장 인자 믹스 10 ㎖ (표 1B의 레시피 참조) 2.4 MM의 미오 - 이노시톨 10 ㎖, 10 ㎖의 2 mM의 헤민 클로라이드, 탈 이온수 250 ㎖. 0.22 μm의 필터 장치를 통해 흡입하고 필터를 적용합니다. </li><li> 핵산 혼합물을 20 ㎖ (표 1c에 레시피), 미네랄 믹스 100 ㎖ (표 1d에 레시피), 170 ㎎ / ㎖ 락트 알부민 가수 분해물 20 ㎖의 필수 아미노산을 20 ㎖, 비 필수 아미노산 10 ㎖를 추가 산, 450 mM의 KH 2 PO 4 20 ㎖,1.45 M D-글루코스, 1 M HEPES 10 ㎖, 나트륨 염, 250 ㎖의 탈 이온수 50 ㎖. </li><li> 구성 요소를 살균 필터링 흡입을 적용합니다. 필터를 제거하고 5 ㎎ / ㎖ 콜레스테롤의 1 ML을 추가합니다. 미디어의 pH는 약 6-6.5 있는지 확인합니다. 참고 :이 솔루션은 최대 1 년 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 사용하기 전에 mCeHR 매체에 20 % (V / V) 매우 저온 살균 유기 탈지 우유를 추가합니다. 우유를 열고 분취 때 (층류 후드 예를 들면) 양심적으로 멸균 기술을 사용합니다. 4 ℃에서 미디어를 저장 </li></ol> 3. C.에게 준비 무균 mCeHR 액체 배지에서 문화 엘레 <ol><li> 많은 임신하는 웜과 OP50 E. 최소한의 양이 될 때까지 열 60mm NGM 플레이트에 벌레를 성장 접시에 대장균. </li><li> M9 버퍼 (표 1 층에있는 레시피) 5 ㎖로 세척하여 각 판에서 벌레를 제거하고 50 ML 원뿔 튜브에 결합한다. </li><li> s의 벌레를 허용ettle 5 ~ 10 분 동안 서 튜브를 남겨 조심스럽게 E.를 포함 뜨는을 제거 대장균. </li><li> 반복 절차를 계속 진행하기 전에 가능한 잔여 박테리아의 많은을 제거하기 위해 3.2 및 3.3 배 단계를 반복합니다. </li><li> 세의 배수 부피 0.1 N 염화나트륨있는 웜에 resuspend 예컨대 1.5 ㎖, 3 ㎖ 또는 10 ㎖를되는 개별 웜 튜브에서 볼 수있다. </li><li> 5 N NaOH를 5 % 차아 염소산 나트륨 웜 현탁액 1시 2분 6초 비율 (표백) 용액을 첨가함으로써 웜 표백. 예를 들어, 1 ml의 5 N NaOH를 2 ml의 5 % 차아 염소산 나트륨 : 웜 현탁액 6 ㎖. 웜 현탁액에 추가하기 전에 수산화 나트륨과 표백제를 혼합. </li><li> 소용돌이 솔루션을 적극적으로 임신하는 웜이 용해 될 때까지 만 계란 서스펜션 (약 5 ~ 10 분) 내에서 볼 수 있습니다. 10X 대물 렌즈와 위상차 현미경을 사용하여 프로세스를 모니터링. </li><li> 벌레가 완전히 용해 된 후, 즉시 펠렛계란 45 초 동안 800 XG에 4 ° C에서 뜨는을 제거하고 4 ℃에서 45 초 동안 800 XG에서 펠렛을 원심 분리하여 멸균 물 10 ㎖로 두 번 펠릿을 씻어 </li><li> 표백 후, 100 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 보충 mCeHR 미디어 10 ㎖를 포함하는 25cm 2 조직 문화 플라스크에 계란 펠렛을 전송합니다. 무균 기술을 사용하여이 절차를 수행합니다. 원하는 경우, 무균 액체 배양에서 박테리아의 성장을 방지하기 위해, 250 ㎍ / ㎖의 날 리딕 산 등 추가적인 항균제를 추가한다. </li><li> 약 70 rpm으로 진탕 배양기에서 20 ° C에서 액체 문화를 품다. </li><li> 개발 단계 및 성장 속도에 유의 매일 벌레를 확인합니다. 참고 : 웜은 처음에 천천히 성장하고 임신하는가 7 10 일이다이 필요합니다. 벌레가 액체 매질에 순응 그러나, 생성 시간은 야생형 (N2) 웜 약로부터 4 일 감소합니다. </li><li> 벌레는 deve을이 후원뿔 튜브에 웜 문화를 전송하고 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ° C에서 5 분 800 XG에 벌레를 펠렛, 액체 매체에서 임신하는 단계로 loped. </li><li> 뜨는을 제거하고 부드럽게 0.1 M의 NaCl의 동일한 볼륨 웜 펠렛을 재현 탁. 예를 들어, mCeHR 10 ㎖에서 배양 벌레를 0.1 M의 NaCl 10 ㎖를 사용합니다. 벌레가 얼음에 5 분 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 3.5-3.8 단계에서 전술 한 바와 같이 표백 절차를 수행하고, 웜 무균 액체 매질에 2 대째 성장하는 것을 허용한다. 필요한 경우, 세균의 성장을 억제하기 위해 다시 항생제를 추가합니다. </li><li> 다시 동기화 인구를 생산하는 단계 3.5-3.8에 설명 된대로 다시 표백 단계 3.12 및 3.13에 설명 된대로 다음 0.1 M의 NaCl에 벌레를 펠렛 및 재현 탁 웜은 임신이 될 수 있습니다. 지금부터 항생제없이 액체 매체의 L1 애벌레 벌레를 성장. </li></ol> 액체에서 4. 동기화 웜문화 <ol><li> 펠렛 및 단계 3.12 및 3.13에서 상술 한 바와 같이 0.1 M의 NaCl에있는 벌레를 재현 탁. 단계 3.5-3.8에서 상술 한 바와 같이 블리치. </li><li> M9 버퍼 10 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 유충이 회전 플랫폼 통에 20 ° C에서 O / N을 부화 할 수 있습니다. 참고 : 계란 L1 애벌레로 부화하지만, 추가로 개발하지 않을 것이다, L1 단계에서 벌레를 동기화. </li><li> 유지 및 배양 웜, 5 분 800 XG에 펠릿 L1 유충, 다음 10 mCeHR ml의 25cm 2 플라스크로 전송의 유충을 재현 탁합니다. 벌레가 회전 플랫폼에서 20 ° C로 증가 할 수 있습니다. 벌레에 충분한 영양을 보장하기 위해 3000 웜 / ㎖ / ㎠의 최대 밀도를 유지한다. 주의 :이 단계에서, 항생 물질이 절차는 층류 후드에서 무균 기술을 사용하여 수행 될 때 무균 상태를 유지하기 위해 요구되지 않는다. 웜은 성장을 모니터링하기 위해 매일 점검해야한다. </li></ol> 5. 무료무균 중간 문화에 대한 쌩쌩 및 해동 웜 <ol><li> 무균 비동기 웜 문화 또는 액체 질소에 동기화 L1 유충을 동결. 5 분 800 XG에 펠렛 웜은 각각의 병에 대한 0.5 ㎖를 사용하여 S 버퍼 (6.45 mM의 KHPO 4, 43.55 mM의 KHPO 4, 146.25 mM의 염화나트륨)을 재현 탁. 각각의 병에 30 % V / V 글리세롤과 S 버퍼의 동일한 볼륨을 추가 및 액체 N 2의 장기 보관하기 전에 -80 ° C로 웜을 전송합니다. 각각의 병에 ML 당 약 1 × 10 6 벌레를 동결. </li><li> 거의 모든 얼음이 녹을 때까지 약 2 분 동안 37 ° C에서 튜브를 배양하여 벌레를 해동. 층류 후드에서 mCeHR을 포함하는 멸균 플라스크에 웜을 전송하고 20 ℃에서 그들을 배치 </li></ol> 6. mCeHR의 성장과 재생에 헤민 농도의 효과를 결정 <ol><li> C.의 영양소에 의존 성장을 검정 무균 mCeHR 미디어를 사용 엘레. 효과 (을)를 확인하려면벌레의 성장과 발전에 F 헤민 농도는 무균 N2 웜 또는 관심의 다른 변종을 동기화 사용합니다. 4 장에서 상술 한 바와 같이 L1 애벌레를 동기화합니다. </li><li> 다음 날, 펠릿 및 동기화 L1 애벌레를 계산하고 무균 미디어 μL 당 1 웜에 희석에. 0.3 M NH 4 OH 10 ㎜ 헤민 염화을 확인하고 진한 염산을 사용하여 pH를 8로 조정합니다. </li><li> 24 웰 플레이트에 mCeHR 매체 800 μl를 추가합니다. 미디어의 100 ㎕를 각 웰에 100 벌레를 추가합니다. 0 μM에서 1.5 μM 세중 1,000 μM까지의 농도로 각 웰에 헤민 염화을 추가합니다. 모든 우물이 0.3 M NH 4 OH의 동일한 농도가 포함되어 있는지 확인합니다. 조심스럽게 100 L1 유충이 각 웰에 첨가되는 것을 보장하기 위해 피펫 팅 전에 벌레를 재현 탁. </li><li> 매일 벌레를 검사하고 각 웰의 각 농도의 성장을 확인합니다. 배양 9 일 후에 벌레의 수를 계산하고 각 헴에 해당하는 웜 / ㎖의 수를 음모농도 (그림 1). </li></ol> 헴 센서 웜에 헤민 농도의 7. 효과 <ol><li> 4를 포함 mCeHR에 동기화 L1 헴 센서 웜 (Phrg-1 :: GFP)을 품다 μM, 13 μM, 10 μM, 20 μM 헤민. </li><li> 형광 공 초점 현미경, 48 시간 포스트 배양 (그림 2)를 사용하여 이미지 웜. </li></ol> 8. 형질 전환 C.를 생성 할 mCeHR 활용 엘레 미세 사격을 사용하여 참고 : 그림 3 (13)에 설명되어 생성 및 UNC-119 (ED3) mCeHR에서 자란 벌레를 사용하여 미세 충격을 수행하기위한 절차를. <ol><li> 웜 준비 <ol><li> 175cm 2 플라스크 일주 전에 폭격에 mCeHR 미디어의 90 ㎖에 약 1 × 10 6 비동기 UNC-119 (ED3) 웜을 전송합니다. 벌레가 20 ° C의 O로 성장 할 수 있도록 허용NA는 70 분당 회전 수 (그림 3-1) ~에 플랫폼을 흔들어. 참고 : 일주일 후, 벌레 밀도가 많은 성인 임신하는 벌레와 상당히 커야합니다. 약 3 × 10 7 웜은 미세 충격에 필요합니다. </li><li> 칠 JM109 E. 대장균 얼음에 10cm의 NGM 플레이트 시드. </li><li> 두 50 ML 원뿔 튜브에 무균 웜을 전송하고 2 분 동안 800 XG에서 벌레를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 M9 버퍼 (그림 3-2) 50 ㎖에 각 관 벌레를 재현 탁. </li><li> 어른 벌레가 얼음에 10 ~ 15 분 동안 중력에 의해 펠릿 할 수 있습니다. 참고 : 2 ㎖ 펠릿은 지금&gt; 90 %의 성인 벌레를 포함해야합니다. 이 2 ㎖ 펠릿은 약 5 × 10 6 웜이 하나의 미세 충격에 충분해야합니다. </li><li> 코트는 냉장 JM109의 전체 표면은 웜의 2 ㎖ 펠릿과 NGM 플레이트를 시드. 완전히 흡수 될 수있는 액체가 다음 판을 남길 수 있습니다(그림 3-3)를 진행하기 전에 얼음에 30 분. </li></ol></li><li> 금 입자의 제조 <ol><li> 실리콘 처리 microcentrifuge 관에 금 입자의 30 밀리그램 무게. 1 ㎖의 70 % 에탄올을 추가하고 5 분 동안 튜브를 소용돌이. </li><li> 관은 금 입자를 펠렛 10 초 동안 6,000 XG에서 원심 분리 한 후, 15 분 동안 앉아 수 있습니다. 주의 깊게 금 입자에 튜브 반대의 측면에 끝을 터치하여 피펫 팁을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 1 분 동안 멸균 물 1 ㎖, 소용돌이와 금 입자를 세척하고 짧게 10 초 동안 6,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. 다음 멸균 50 % 글리세롤 0.5 ㎖에 금 입자를 재현 탁, 두 번 세척 단계를 반복합니다. 참고 : 금 입자의 최종 농도는 60 ㎎ / ㎖이있을 것이고, 4 ℃에서 1~2개월 저장할 수 있습니다 </li></ol></li><li> DNA - 금 입자 믹스를 준비합니다 <ol><li> 10 &amp;으로 원하는 플라스미드 DNA의 10 μg을 결합# 956; 실리콘 처리 1.5 ML microcentrifuge 관에서 UNC-119 구조 플라스미드의 g. DI 물 50 μL 잘 재현 탁 금 입자 용액 1 분 후 소용돌이의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 2.5 M 염화칼슘 150 μl를 추가하고 1 분 동안 솔루션을 다시 소용돌이. 이 용액에 3 ~ 5 분 동안 0.1 M 스퍼 미딘과 소용돌이의 60 μl를 추가합니다. </li><li> 펄스는 10 초 동안 6,000 XG에서 솔루션을 원심 분리, 상층 액을 제거하고 70 % 에탄올 300 μl를 추가합니다. 소용돌이 아니라 1 분 동안 6,000 XG에 펄스 원심 분리기는, 100 % 에탄올 170 μL에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 적극적으로 5 ~ 10 분 후 원심 분리기를 펄스와 뜨는을 제거하기위한 솔루션을 소용돌이. </li></ol></li><li> 사격 (그림 3-3) 주 :이 프로토콜은 자재 / 장비의 표에 지정된 입자 전달 시스템으로 수행된다. 사용할 수있는 입자 전달 기기에 대한 지침을 따르십시오. <ol> &lt;리&gt; 15cm 접시에 조직의 용지를 넣습니다. 핀셋을 사용하여, 각각 100 % 에탄올에 일곱 macrocarriers을 찍어 건조 조직에 그들을 배치. </li><li> 철저하게 70 % 에탄올로 biolistic 실, 마크로 캐리어 홀더 및 대상 플레​​이트를 청소합니다. 깨끗하고 각각의 폭격 절차 이전에 정지 화면을 압력솥. </li><li> 좌석 도구를 사용하여 홀더에 핀셋과 프레스를 사용하여 홀더에 macrocarrriers를 넣습니다. </li><li> 균등하게 각 마크로 캐리어의 중심에있는 DNA 코팅 된 금 입자의 20 μl를 확산하고 용액이 완전히 건조 할 수 있습니다. </li><li> 에탄올 압력 분배의 두 부분을 청소하고 에탄올 청소 파열 디스크를 조립합니다. 사격 실에 조립 된 압력 분배기 및 파열 디스크를 고정합니다. </li><li> 마크로 캐리어 홀더 멸균 정지 화면을 조립하고 금속 필요한 선반과 장소에 잠금에 장치를 배치합니다. </li><li> 조립 MACR를 삽입ocarrier 압력 분배기 아래에 할당 된 슬롯에 biolistic 실에 장치 및 압력주기에 맞 춥니 다. </li><li> 표적 판 선반 위에 벌레와 오픈 NGM 플레이트를 테이프와 실의 문을 닫습니다. </li><li> , 웜 도배 파열 디스크를 파괴하는 데 필요한 그에게 압력을 조정합니다. , 수은 압력 28 인치에 진공을 켭니다 디스크가 파열 될 때까지 화재 버튼을 누릅니다. </li><li> 진공을 해제하고 장치에서 NGM 플레이트를 제거합니다. 접시에서 벌레를 씻어 JM109 E. 시드 스물 10cm의 NGM 플레이트에 다시 배포 대장균 (그림 3-4). </li><li> 벌레가 25 ° C에 최대 10 내지 14 일 동안 성장하고 판을 굶어 수 있습니다. UNC-119의 결함에서 구출 웜은 보통 운동을하고이 시간에 식별 할 수 있습니다. 이러한 독립적 인 유전자 변형 라인 (Figur를 대표로 추가 분석을 위해 별도의 플레이트에서 적어도 10 &quot;야생형&quot;벌레를 선택전자 3-5). </li></ol></li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation.">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic acids research. 32, e40 (2004).</li><li>Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+transgenic+nematodes+by+bombardment+and+antibiotic+selection.">Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection.</a> Nature Methods. 9, 118-119 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익 또는 이익의 충돌이없는 선언합니다.

이 프로토콜에서 우리는 빠른 C.를 허용하는 수정 된 무균 액체 미디어 mCeHR을 제시 웜의 다수의 생산 elegans의 생성. 벌레가 E.을 오염하지 않고 재배로이 매체는 몇 가지 장점을 보여줍니다 대장균이나 세균의 부산물 및 영양 및 독성 학적 연구에 이용 될 수있다. E.의 사용 대장균 또는 연구에서 다른 박테리아는 몇 가지 단점이있다. 예를 들어, 박테리아의 ...

토양 선충은 예쁜 꼬마 선충은 독극물에 유전학에서 많은 연구에 사용되는 강력한 모델 생물이다. 그 1mm 크기, 사일, 배양 용이성의 신속한 생성 시간 및 큰 자손 번호 따라서 이러한 선충 유전자 및 약리학 화면 1, 2의 호에 이용되어왔다. 연구팀은 척추 시스템에서 보존 분자 경로를 식별하기 위해이 웜을 활용. 이러한 경로는 세포 죽음 신호, 노화 및 대사 경로, 신경계 3-6 (가) 있습니다. 또한, C.의 투명성 엘레 직접 유전자 발현 패턴과 단백질의 현지화를 분석하기 위해 시각화 할 수있는 형광 단백질 기자를 사용하여 유전자 변형 라인의 생성 할 수 있습니다. 많은 연구에서이 선충은 선충의 성장 배지 (NGM) 판을 사용하여 고체 한천 기반 표면 또는 L에서 배양iquid 문화는 음식 소스 7,8로 대장균 시드. 이러한 세균의 음식 소스는 부산물 결과의 해석에 영향을 미치는 세균의 간섭과 생화학 및 독성학 연구를 혼동 할 수 있습니다. , C. 이러한 배합 효과를 피하기 위하여 엘레 음식 소스로 세균없는 상태입니다 무균 액체 매체에서 배양 할 수있다. 이 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 많은 표준 C에 대한 높은 동기 웜의 수백만을 배양 C.에 차등 규제 유전자의 마이크로 어레이 분석을 포함한 엘레 프로토콜 엘레 다른 헴 농도에 노출, 및 유전자 폭격을 이용한 형질 전환 웜의 제작. 이 매체는 화학적으로 박사 에릭 클레 9 공식화 원래 레시피에서 수정됩니다. 이 mCeHR 미디어를 사용하여, 우리는 성공적으로 헴 항상성에 관여하는 유전자를 발견했습니다, 10 (HRG의)와 같은 헴 반응 유전자를 언급하는 것E. 시드 NGM 한천 플레이트를 사용 정규 성장 조건에서 불가능했다 대장균. 이 프로토콜에서 우리는 C.를 도입하고 유지하기위한 절차를 설명 E. 성장 엘레 콜라이 무균 mCeHR 및 트랜스 제닉 C. 제조 웜의 다수를 구하는 방법이 활용 미세 충격을 사용하여 엘레 라인. C.의 영양 소요량을 결정하기위한 무균 매체 사용의 실용성을 보여 우리 또한 본 연구 엘레 예로 헴을 사용. 이러한 연구는 mCeHR 매체를 사용하여 C. 다수의 급속한 성장을 허용한다는 것을 보여 웜 연구자에 의해 사용 많은 다운 스트림 애플리케이션을위한 엘레.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">MgCl2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">M-2393</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">S-4641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium citrate.H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-1722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CuCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C455-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MnCl2.4H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">M87-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">ZnCl2</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">Z-0152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-1018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2.2H2O</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td style="width:121px;">C70-500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5 -phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine 2 - and3&#160; -monophosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uridine 5 -phosphate, disodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">U-6375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thymine&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T0376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">N-Acetylglucosamine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>A3286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-Alanine</td>
			<td style="width:108px;">Fisher</td>
			<td>S25648&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">p-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">A-9878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Biotin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">B-4639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cyanocobalamine (B-12)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">V-2876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Folinate (Ca)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">F-7878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacin</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-0761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Niacinamide</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">N-3376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantetheine</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pantothenate (Ca)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pteroylglutamic Acid (Folic Acid)</td>
			<td style="width:108px;">ACRCS</td>
			<td style="width:121px;">21663-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxal 5&#39;-phosphate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-3657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxamine.2HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-9158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Pyridoxine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-6280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">Riboflavin 5-PO4(Na)</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">R-7774</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Thiamine.HCl</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">DL-6,8-Thioctic Acid</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">T-1395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:359px;">KH2PO4</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">P-5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Choline di-acid citrate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">C-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">myo-Inositol</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">I-5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">G-7520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lactalbumin enzymatic hydrolysate</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">L-9010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Brain Heart Infusion</td>
			<td style="width:108px;">BD</td>
			<td style="width:121px;">211065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:359px;">Hemin chloride</td>
			<td style="width:108px;">Frontier Scientific</td>
			<td style="width:121px;">H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">HEPES, Na salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td style="width:121px;">H-3784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Cholesterol</td>
			<td style="width:108px;">J.T. Baker</td>
			<td style="width:121px;">F676-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11140-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids Solution</td>
			<td style="width:108px;">Invitrogen</td>
			<td>11130-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nalidixic acid sodium salt</td>
			<td style="width:108px;">Sigma</td>
			<td>N4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetracycline Hydrochloride</td>
			<td style="width:108px;">MP Biomedicals</td>
			<td>2194542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biolistic Delivery System</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>165-2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">Gold particles (Au Powder)&#160;</td>
			<td style="width:108px;">&#160;Ferro Electronic Material Systems</td>
			<td style="width:121px;">6420 2504, JZP01010KM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">or</td>
			<td style="width:108px;"></td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gold Particles 1.0 &#956;m</td>
			<td style="width:108px;">BioRad</td>
			<td>&#160;165-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing caenorhabditis elegans in axenic liquid media and creation of transgenic worms by microparticle bombardment

이 프로토콜에서는, 우리는 필요한 자료를 제시하고 수정 C를 만들기위한 절차. 전자 legans 요법 이니 및 재생 미디어 (mCeHR). 또한, C.를 노출하고 순응하는 단계 E. 성장 엘레 액체 매체를 무균하는 대장균이 설명되어 있습니다. 무균 C.를 활용 마지막으로, 하류 실험 엘레이 절차의 장점을 설명한다. C.를 분석하고 결정하는 능력 엘레 영양소의 요구 사항은 다양한 헴 농도와 무균 액체 미디어에 N2 야생 형 웜 성장에 의해 설명되었다. 이 절차는 웜의 성장과 발전을위한 최적 농도를 결정하거나, 약물 치료의 독성 학적 효과를 결정하기 위해 다른 영양소와 함께 복제 할 수 있습니다. 야생 형 웜의 성장에 대한 다양한 헴 농도의 효과는 질적 현미경 관찰을 통해 T를 정량 측정 하였다각 헴 농도에서 성장 웜 그는 수. 또, 다양한 영양소 농도의 효과는 또한 영양소의 변화에​​ 대응 형광 센서를 표현 웜을 이용하여 정량 할 수있다. 또한, 웜의 다수 용이 미립자 포격을 사용하여 트랜스 제닉 C. elegans의 생성을 위해 제작 하였다.

C.를 배양 E.에 의해 생산 차 대사 산물의 간섭없이, 웜에 필요한 영양소의 결정에 무균 액체 배지 에이즈 엘레 대장균. 야생형 N2 웜은 세 세대 내 mCeHR 미디어에 순응하고 NGM 박테리아 접시에서 자란 벌레에 비해 성장을 보여줍니다. 사실, 이러한 웜은 OP50 박테리아 성장 웜 3.5 일에 비해 4 일 안에 임신하는이된다. mCeHR 사용의 한 가지 이점은이 웜 (14)의...

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Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다.

배양<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em &gt; 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

culturing-caenorhabditis-elegans-axenic-liquid-media-creation

Research

JoVE Journal

Biology

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

16.9K 조회수.  University of Maryland.  C. elegans의는 일반적으로 고체 한천 플레이트에 성장 또는 액체 문화에서 E. 씨앗을 품고있다 대장균. 독성 및 영양 연구를 혼동에서 세균의 부산물을 방지하기 위해, 우리는 다운 스트림 응용 프로그램의 범위에 대한 웜의 수가 증가하고 동기화, 무균 액체 배지, CeHR을 이용했다. 

비디오: Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

연구

생물학

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

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In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

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Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

We present a simple method to construct 3D nematode cultivation systems called NGT-3D and NGB-3D. These can be used to study nematode fitness and behaviors in habitats that are more similar to natural Caenorhabditis elegans habitats than the standard 2D laboratory C. elegans culture plates.

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The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

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A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous system and muscle. Consistent with this, mitochondrial dysfunction has been associated with a myriad of neurodegenerative diseases and aging in general. Caenorhabditis elegans have been a powerful model system for elucidating the many intricacies of mitochondrial function. Mitochondrial respiration is a strong indicator of mitochondrial function and recently developed respirometers offer a state-of-the-art platform to measure respiration in cells. In this protocol, we provide a technique to analyze live, intact C. elegans. This protocol spans a period of ~7 days and includes steps for (1) growing and synchronization of C. elegans, (2) preparation&#160;of compounds to be injected and hydration of probes, (3) drug loading and cartridge equilibration, (4) preparation of worm assay plate and assay run, and (5) post-experiment data analysis.

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Mitochondrial respiration is critical for organismal survival; therefore, oxygen consumption rate is an excellent indicator of mitochondrial health. In this protocol, we describe the use of a commercially available respirometer to measure basal and maximal oxygen consumption rates in live, intact, and freely-motile Caenorhabditis elegans.

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Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

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The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their detrimental effects on the human life quality and the healthcare system, the majority of human neurodegenerative disorders still remain incurable and non-preventable. Therefore, the development of novel therapeutic interventions against such maladies is becoming a pressing urgency. Age-associated deterioration of neuronal circuits and function is evolutionarily conserved in organisms as diverse as the lowly worm Caenorhabditis elegans and humans, signifying similarities in the underlying cellular and molecular mechanisms. C. elegans is a highly malleable genetic model, which offers a well-characterized nervous system, body transparency and a diverse repertoire of genetic and imaging techniques to assess neuronal activity and quality control during ageing. Here, we introduce and describe methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis (e.g., deg-3(d) and mec-4(d)) and protein aggregate (e.g., &#945;-syunclein and poly-glutamate)-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-related neuronal breakdown. A combination of these animal neurodegeneration models, together with genetic and pharmacological screens for cell death modulators will lead to an unprecedented understanding of age-related breakdown of neuronal function and will provide critical insights with broad relevance to human health and quality of life.

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

Here, we introduce and describe widely accessible methodologies utilizing some versatile nematode models, including hyperactivated ion channel-induced necrosis and protein aggregate-induced neurotoxicity, to monitor and dissect the cellular and molecular underpinnings of age-associated neurodegenerative diseases.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

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