노화와 예쁜꼬마선충을 연구할 때 우리는 일반적으로 시간이 지남에 따라 동물 개체군을 추적합니다. 이것은 당신이 연구하고 있는 그 과정이 각 시점에서 개체군에서 무엇을 하고 있는지 엿볼 수 있게 해주지만 시간이 지남에 따라 개별 동물에서 그 과정이 어떻게 변하고 있는지는 알려주지 않습니다. 이러한 단일 동물 배양 환경을 통해 우리는 수백 마리의 동물에 대해 시간이 지남에 따라 개별 동물의 분자 과정과 생리적 과정의 역동적인 변화를 동시에 추적할 수 있습니다.
우리는 이러한 다중 우물 배양 시스템의 품질에 실제로 영향을 미칠 수 있는 두 가지 주요 사항이 있음을 발견했습니다. 하나는 우물을 건조시키는 것 이상이거나 건조하는 것이고 두 번째는 오염입니다. 그리고 프로토콜 전반에 걸쳐 이러한 문제를 완화할 수 있는 특정 단계를 기록하려고 합니다.
오늘 프로토콜을 시연하는 것은 Emily Gardea가 될 것입니다. 그녀는 내 연구실의 기술자이며 이 프로토콜을 최적화하기 위해 많은 작업을 수행했습니다. 모든 시약을 준비한 후, 일회용 주걱을 사용하여 대형 일회용 보트에 금형 당 60 그램의 PDMS 염기와 6 그램의 경화제를 혼합한다.
PDMS 혼합물을 마이너스 0.08메가파스칼의 진공 챔버에 30분 동안 넣어 기포를 제거합니다. PDMS 혼합물을 각 3D 프린팅 몰드에 붓고 채웁니다. 채워진 몰드와 여분의 PDMS 혼합물을 진공 챔버에 마이너스 0.08메가파스칼로 25분 동안 넣습니다.
진공 챔버에서 채워진 몰드를 제거하고 일회용 주걱으로 남아 있는 기포를 터뜨립니다. 한쪽 가장자리부터 시작하여 PDMS로 채워진 금형 위에 평평한 아크릴 시트를 천천히 내립니다. 기포 형성이 발생하면 원고에 설명 된대로 진행하십시오.
아크릴에 2.5파운드의 추를 놓고 무게가 있는 틀을 오븐에 넣습니다. 하룻밤 동안 섭씨 55도에서 경화시키십시오. 배양이 끝나면 오븐에서 추와 틀을 제거합니다.
다음으로 아크릴과 경화된 PDMS 사이에 면도날을 끼우십시오 봉인을 깨려면 면도기 또는 금속 주걱을 사용하여 경화된 PDMS의 측면을 조심스럽게 풀고 금형에서 제거합니다. PDMS 장치를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 오토클레이브 테이프로 밀봉하고 섭씨 15도 및 제곱인치당 121파운드 게이지 압력에서 최소 15분 동안 건조 주기로 오토클레이빙하여 멸균합니다.
멀티웰 장치를 준비하기 위해, 건식 비드 배스 인큐베이터를 섭씨 90도로 예열한다. 오토클레이브 멀티웰 장치의 포장을 풀고 장치의 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 홈을 자릅니다. 웰이 위를 향하도록 하여 최대 3개의 포장을 뜯지 않은 장치를 플라즈마 클리너에 넣고 플라즈마 클리너를 실행합니다.
트레이 내부에 70% 에탄올을 뿌리고 작업 물티슈로 닦아서 장치당 하나의 웰 폴리스티렌 트레이를 소독합니다. 장갑을 낀 손으로 플라즈마 클리너에서 각 장치를 제거하고 깨끗한 트레이에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 90도로 예열된 비드 배스 인큐베이터에 25밀리리터의 일회용 피펫 대야를 놓습니다.
장치당 응고된 LMNGM 예비 혼합물 튜브 하나를 채울 수 있도록 200밀리리터 유리 비커에 넣습니다. 캡과 파라필름을 제거하고 미디어가 부어질 만큼 충분히 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 용융된 LMNGM 예비 혼합물을 다른 멸균된 200밀리리터 비커에 붓습니다.
한 번에 두 개 이상의 장치를 채우는 경우 이 비커에 여러 테스트 튜브를 결합할 수 있습니다. LMNGM 사전 혼합물을 추가로 20초 동안 전자레인지에 돌립니다. 미리 혼합물이 끓기 시작하면 전자레인지를 멈추고 가라앉히십시오.
용융된 LMNGM 예비 혼합물을 전자레인지에서 꺼내 섭씨 60도까지 식힙니다. 나머지 LMNGM 성분을 사전 혼합물에 첨가하고 용융된 LMNGM을 비드 배스의 25밀리리터 분지에 붓습니다. 200마이크로리터 다중 채널 리피터 피펫을 사용하여 장치 웰을 채웁니다.
리피터가 14마이크로리터의 분취량을 분배하고 5개의 피펫 팁을 장착하도록 설정합니다. 용융된 LMNGM으로 팁을 로드하고 처음 14마이크로리터를 LMNGM 포함 수조에 다시 분배합니다. 빠르지만 조심스럽게 움직여 14마이크로리터를 장치의 내부 웰에 분배하고 나머지 LMNGM을 최종 분취량이 일반적으로 14마이크로리터 미만이므로 수조에 다시 분배합니다.
다음으로, 15마이크로리터의 분취량을 분배하고 웰의 가장 바깥쪽 링을 채우도록 리피터를 설정합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 황산구리 용액을 각 모서리의 장치 해자에 분배합니다. 해자를 과도하게 채우지 말고 황산구리가 우물의 상단 표면에 닿지 않도록하십시오.
황산구리가 전체 해자를 통해 쉽게 흐르지 않으면 짧은 백금 와이어 픽을 사용하여 장력을 끊고 해자를 통해 황산구리를 끌 수 있습니다. 황산구리가 전체 해자를 통과 한 후 200 마이크로 리터 피펫 또는 진공 흡입을 사용하여 가능한 한 많은 황산구리를 제거하십시오. 스퀴즈 병을 사용하여 장치와 트레이 벽 사이의 공간에 물 결정을 추가합니다.
트레이 뚜껑을 닫고 4면을 모두 파라필름으로 감쌉니다. 플레이트를 완전히 밀봉하기 위해 두 개의 추가 파라필름 조각을 추가합니다. 리피터 피펫을 사용하여 5마이크로리터의 농축 박테리아가 있는 각 웰을 발견합니다.
LMNGM 표면과의 직접적인 접촉을 피하십시오. 컴퓨터 케이스 팬과 HEPA 필터를 사용하여 최소한의 비용으로 구성할 수 있는 맞춤형 건조 상자를 사용하여 장치를 건조하십시오. 해부 범위 내에서 우물을 검사하여 모든 우물이 성공적으로 건조되었는지 확인합니다.
플래티넘 픽을 사용하여 준비된 웜 플레이트에서 동물을 옮기고 우물 당 하나의 웜을 추가합니다. 준비된 세제 용액을 트레이 뚜껑 안쪽에 한 방울 떨어뜨리고 세제 용액이 마를 때까지 작업용 물티슈로 문지릅니다. 원고에 설명 된대로 세 조각의 파라 필름으로 트레이를 감 쌉니다.
daf-2(RNAi)의 수명 연장은 daf-16 null 돌연변이에 의해 차단됩니다. daf-2(RNAi)의 존재 하에서 건강 기간도 감소했습니다.daf-16 돌연변이 및 daf-2(RNAi)에 의해 수명 전반에 걸친 3일 롤링 평균 활동이 감소합니다. 개별 동물의 수명 전반에 걸친 누적 활동은 수명 전반에 걸쳐 특정 날짜의 개별 동물 활동보다 수명과 더 나은 상관 관계가 있습니다.
우물을 채우고 가능한 한 빨리 벌레를 추가하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 우물이 마르고 벌레가 살아남지 못할 수 있습니다. 이 시스템은 수명, 활동, 신체 크기 또는 모양과 같은 높은 처리량의 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있는 자동 이미징과 호환됩니다.
