이 작품은 ALF에 피츠버그, NIH 교부금 AG028977 대학에서 씨앗 기금에 의해 지원되었다

개요 전통적으로 유전자 변형 벌레는 C.에 transgene DNA를 microinjecting에 의해 생성되었습니다 엘레간스 germline 1,2,3,4. 성공하는 동안,이 방식은 전문적인 장비와 웜 해부학과 microinjection 기술과 경험의 개발이 필요합니다. 최근 biolistic 폭격은 germline 5,6로 외국의 DNA를 소개하는 DNA - 코팅 금 입자를 사용하는 다른 접근법으로 개발되었습니다. 이러한 접근 방식을 지배할 수 있도록 실천의 관점에서 적은 시간 투자를 필요로합니다. C.의 biolistic 충격 성공 동물의 대량이 필요하므로 유전자 변형 벌레를 생성하는 엘레간스은 개별 웜의 수준 낮은 효율성있다. 이러한 여러 가지 방법으로 성장하지만, 우리는 참여 접시의 작품과 전화 번호를 줄이기 위해 계란 접시를 사용하실 수 있습니다. 우리 프로토콜은 계란 접시 및 웜의 준비로 시작하고 다음 바이오 래드 PDS-1000/He Hepta 시스템을 사용하여 충격 프로토콜에 중점을 둡니다. 우리는 Berezikov 외 7 직장에서 일부의 프로토콜을 적응. 폭격으로 UNC - 119 유전자는 일반적으로 유전자 변형 동물에 대한 표지로 사용됩니다. 이 변이를 가지고 웜 변종이 심각하게 uncoordinated하고 거의 이동 외모 땅딸막한하고 있으며, dauer의 애벌레 8 양식 수 없습니다. dauer은 불리한 조건에서 생식 성인에 개발을 지연하는 데 사용되는 대체 애벌레 단계이며, dauer에 항목이 여러 유전자 ​​9 규제입니다. UNC - 119 유전자를 가지고 몇 가지 계통 C.에서 구할 수 있습니다 엘레간스 유전학 센터 (CGC, 미네 아 폴리스, MN). 원래 DP38 스트레인 (UNC - 119 (ed3)가)도 하류 실험에 영향을 미칠 수있는 관련이없는 dauer - 형성 제정 (DAF - C) 변이를 수행합니다. 여러 실험실이 변이를 outcrossed 있고, HT1593 긴장이 CGC에서 구할 수 있습니다. 우리는 유전자 변형 동물이 다소 DP38 변형들과 자신을 동일시하기 쉽게하고 유전자 변형 동물을 만드는이 변형을 사용하는 경향이 것을 발견했습니다. 필요한 경우, 우리는 DAF - C 변이를 제거하는 유전자 변형 벌레를 outcross하는 HT1593을 사용합니다. transgenes을 준비하는 동안 우리는 성장 접시의 재고를 유지하므로 DP38 벌레가 성장하기 것은 프로토콜에 가장 느린 단계 중 하나입니다. 관심의 유전자와 함께 UNC - 119 마커의 표현이 정상적인 운동성 및 신체 크기 5 구조에 따라 transgene을 표현하는 동물을 쉽게 확인하실 수 있습니다. UNC - 119 유전자는 작은 C. 여러 소스와 벡터 UNC - 119 게놈 DNA를 사용하여 UNC - 119 발기인 및 cDNA, 그리고 게놈 DNA에서 얻을 수 있습니다 briggsiae 유전자는 8,10를 사용하고 있습니다. 우리는 최근 동종 재조합 11 유전자 변형 동물에게 12을 생성하는 Cre 호텔 - 훈제 연어의 재조합에 의해 UNC - 119 유전자를 수행하는 웜 fosmids를 수정하는 방법으로 암피실린 저항 유전자를 포함하는 플라스미드에 UNC - 119 카세트를 추가하는 간단한 프로토콜을 설명했다. plasmids은 Addgene 주식 회사 (캠브리지, MA)에서 사용할 수 있습니다. 하나의 폭격을 수행 관련된 노력이 중요하지만, 관리하는 동안, 하루에 여러 bombardments 수행에 관련된 추가 작업을 최소화합니다. 따라서, 우리는 정기적으로 각 생성에 관련된 작업을 감소하기 위해 유전자 변형 벌레의 생산 클러스터. 1. 에그 플레이트 준비 UNC - 119 돌연변이 웜 때문에 그들은 접시의 다른 부분은 여전히 음식을 포함하는 동안 접시의 부품에 굶어하는 경향들이 장애인 이동성 표준 NGM 접시에 성장 어렵습니다. 계란 접시에 두꺼운 식품 레이어가 UNC - 119 웜보다 쉽게 크롤 링하고 모든 접시 7 대신할 수로 에그 번호판이 문제를 해결. 계란 접시는 또한 적은 접시가 13 필요하므로 벌레 다수의 성장을 지원하는 혜택을했습니다. 보통 5 계란 접시 하나 폭격을 위해 벌레를 성장하기에 충분합니다. 아래의 제조법은 약 50 접시하게하지만, 원하는 경우에는 적은 수 있도록 halved 수 있습니다. 우리가 접시에 항생제와 antifungal 약물 모두를 사용하고 오직 접시 시딩에 대한 차아 염소 산염 처리에 의해 생성된 계란을 사용하므로 계란 접시 쉽게 오염이 될 수 있습니다. 1 일 : <ol><li> 500mL 병 속에 LB (400 ML)를 준비합니다. 20 분 대한 압력솥. </li><li> 2 % 한천과 1리터 팡가를 사용하여 ~ 50 10cm 팡가 번호판을 붓고. 우리는 200 μg / ML 13 리터와 스트렙토 마이신 당 nystatin 10 ML를 추가합니다. </li><li> 200 μg / ML 스트렙토 마이신과 LB에 OP50 - 1의 40 ML 야간 문화를 성장. 이 변형은 스트렙토 마이신 저항과 CGC에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 의 500mL 병 압력솥다음날. </li></ol> 일 2 : <ol><li> 멸균 병에 10 닭고기 계란 별도의 yolks. 우리는 노른자 구분 (대상을 포함한 가정용 매장에서 사용 가능)을 사용합니다. 흔들어. </li><li> LB와 400mL에 볼륨을 가져와. 악수 </li><li> 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다. </li><li> 실내 온도 쿨. </li><li> OP50 - 1 40mL를 추가합니다. 악수 </li><li> 판 당 혼합물의 5-8 ML를 배포합니다. </li><li> 접시가 하룻밤 실온에서 정착하도록 허용합니다. </li></ol> 3 일 : <ol><li> 부드럽게 접시에 남아있는 액체를 부어. 하룻밤 상온에서에서 뚜껑과 건조하도록 허용합니다. </li></ol> 일 4 : <ol><li> 필요한 ° C까지 4 상자나 비닐 봉지와 가게에 접시를 넣어. 이 번호판은 1-2 개월 동안 사용하도록 확인하는 나타납니다. </li></ol> 2. 에그 플레이트을 심는 <ol><li> 최근에 굶주린 접시에 집중 OP50을 추가하여 6cm 팡가 플레이트에 DP38 벌레를 확장합니다. 하나의 충격에 대해서는 종자 5 계란 접시에 작은 접시 ~ 6을 사용합니다. 여러 bombardments을 위해, 우리는 계란 접시을 심는 전에 대신 씨앗이 풍부한 펩톤 플레이트에있는 작은 접시를 사용합니다. </li><li> 차아 염소 산염 13,14의 사용을 통해 DP38 웜에서 계란을 분리. 무균 S - 기초 또는 M9 버퍼 13,14에 계란을 Resuspend. </li><li> 계란 접시의 해당 번호로 달걀 (플레이트 당&gt; 10,000) 추가합니다. 충격에 사용할 7-10일 20 ° C에서 계란 접시에있는 벌레를 성장. 번호판이 벌레는 접시에서 음식을 취소하고 일단 시작되면 사용할 수 있습니다. 이 번호판은 굶어과 이상에 대한 기간이 증가하면 웜 수율을 개선하는 것입니다 정말 열심히하고 있습니다. </li></ol> 충격 우리는 미리 황금 주식을 준비하고 ° C 사용을위한 4 저장되어 유지. 또한 필요는 얼룩이없는 그리고 10cm 팡가 번호판을 발견하고 있습니다. 얼룩이없는 접시는 사전에 잘 붓고 철저하게 벌레와 함께 추가된 액체의 흡수를 용이하게하기 위해 건조 허용해야합니다. 처음엔 DNA - 코팅 금 입자를 준비 시작 폭격의 날, 우리는 벌레를 씻어. 우리는 다음 얼룩이없는 팡가 플레이트에 벌레를 추가하고 금 입자를 세척하고 macrocarriers에게 전송 완료. 골드 입자 준비 : <ol><li> 1.7mL 튜브에 금 입자의 60mg을 무게와 15에 대한 70 %의 에탄올에 만끽해보세요. 금 입자를 침전하기 위해 간단히 스핀. </li><li> 무균 물에 3 번 세척하고 금괴를 수집하기 위해 간단히 때마다 스핀. </li><li> 50% 무균 글리세롤의 1mL에 금을 Resuspend. 이것은 주식 골드 입자 솔루션이며, 4 개월 동안 저장할 수 있습니다 ° C. </li></ol> 웜 : <ol><li> S - 기초 또는 M9 버퍼와 함께 계란 접시에서 DP38 벌레를 플로트와 50mL 원뿔 관에게 전송할 수 있습니다. </li><li> 웜은 아래에까지 벤치에 튜브를 유지. 다음 버퍼를 대기음 신선한 S - 기초 또는 M9를 추가합니다. 버퍼 조각이 비교적 명확 때까지, 2 또는 3 번 씻으십시오. DNA를 코팅이 완료될 때까지이 단계에서 웜 보관하십시오. </li><li> 기음과 폭격 당 버퍼에 벌레 약 2-3 ML 두십시오. 얼음 10cm 얼룩이없는 팡가 플레이트로 전송. 팡가 플레이트가 충돌하기 전에 완전히 건조해야합니다로 전송 볼륨을 최소화 중요합니다. 벌레와 함께 접시의 전체 표면을 커버해야합니다. </li><li> 접시 얼음 건조하도록 허용합니다. 얼음이 건조하는 동안 clumping에서 벌레를 방지할 수 있습니다. </li></ol> 이 단계는 중요합니다 : 접시는 건조해야하며 벌레가 균일하게 팡가 판에 분산. 얼음 벌레를 유지하면 접시 더미로 이동하고 통합에서 그들을 방지합니다. DNA 준비 (한 충격에 대한) <ol><li> 1.7mL 튜브에 혼합 : <ul><li> 50μl 금 입자. 추가하기 전에 철저히 Resuspend. </li><li> 50μl DNA (10 - 15ug). 우리는 원형 또는 선형의 DNA 사이의 작은 차이를 참조하십시오. 보통 우리는 (Qiagen 주식 회사, 발렌시아, CA) DNA의 정화를 위해 Qiagen midiprep 카트리지를 사용합니다. </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. 이 솔루션은 실온에서 몇 주 동안 안정합니다. </li><li> 20μl 0.1M spermidine. spermidine은 수용액에서 불안정합니다. 우리는 -20 ° C.에 70μl spermidine의 aliquots 및 저장을 우리는 다음 0.1M 솔루션을 얻기 위해 바로 사용하기 전에 물을 1mL 추가할 수 있습니다. 이 솔루션은 각 폭격 신선한 준비하셔야합니다. vortexing하면서 우리는 일반적으로 와동 다음 골드 낮은 속도로 1.7mL 튜브 입자 및 CaCl 2, DNA와 spermidine / 프로타민 dropwise를 추가합니다. 인산 칼슘과 transfected 가지고있는 사람들에게이 기술은 잘됩니다. 우리는 아주 좋은 결과를 15 대신 spermidine의 프로타민에도 사용합니다. 우리는 물 속에 새로운 솔루션 (1mg/mL)를 준비하고 우리가E 50μl 대신 spermidine의 20μl. 우리가 프로타민 사용하는 경우, 우리는 일반적으로 대신 얼음에 넣어 10 분 동안 상온에서 혼합을 품어. 프로타민는 냉동 보관을하지 않아도 및 분말 액체 대신합니다. </li></ul></li><li> 30 분 대한 얼음 혼합물을 품어하고, 주기적으로 정지에서 금 입자를 유지 섞는다. 그렇다면 간단히 회전 및 뜨는을 대기음. </li><li> 300μl 70 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀. </li><li> 1mL 100 % 에탄올로 씻으십시오. 간단히 스핀. </li><li> 170μl 100 % 에탄올에 Resuspend. </li></ol> macrocarriers의 준비 : <ol><li> 2 프로파놀 7 macrocarriers을 (바이오 - 래드 연구소, 헤라클레스, CA) 린스. 조직 종이에 넣고 실온에서 그들을 말리면. </li><li> 각 macrocarrier의 중심에 DNA / 골드 혼합의 20μl를 추가합니다. 정지에있는 금괴를 유지하는 pipetting 전에 와동 오른쪽해야합니다. </li><li> 에탄올이 증발하자. </li></ol> 3. 충격 실험 시스템을 통해 헬륨을 내리려고하기 전에 빈 폭격을 수행할 수 있어야합니다. <ol><li> 진공 펌프와 가까운 진공 펌프 트랩을 켜십시오. 우리는 석유가없는 진공 펌프를 사용합니다. </li><li> 헬륨 탱크를 켜십시오. 그 압력이 2200psi입니다 ≥ 확인하십시오. </li><li> 2 프로파놀에 젖은 파열 디스크가 (1350 PSI), hepta 어댑터에 뚜껑을 유지에 배치. </li><li> PDS - 1000 시스템에 어댑터를 나사와 공급 토크 렌치로 조입니다. </li><li> 홀더 및 좌석 그들 제공된 도구로 7 macrocarriers를 놓습니다. 다음 소유자에 hepta 정지 화면과 바닥을 넣어. 위에서 두 번째 선반에 이상 홀더와 장소를 뒤집기. macrocarriers의 황금 발견 측면이 시점에서 아래로 향하게해야합니다. </li><li> hepta 어댑터의 콘센트와 macrocarrier 홀더의 상단에있는 구멍을 맞춥니다. </li><li> 충격 챔버에서 가장 낮은 선반에 벌레 (덮개 해제)로 코팅 팡가 접시를 놓습니다. </li><li> 완전히 PDS - 1000에 진공 흐름 속도 노브를 엽니다. 챔버는 HG 26에 도달할 때까지 VAC 버튼을 누르십시오. 다음 진공을 유지하기 위해 위치를 고수로 전환합니다. </li><li> 디스크 파열까지 화재 버튼을 누르고 있습니다. 압력이 1350psi에 도달하면 이런 현상이 발생합니다. 때로는 이것이 발생하는 5-20초 걸립니다. 단추를 놓습니다. </li><li> 챔버 (환기 위치)에서 진공을 출시하고, 플레이트를 제거합니다. </li><li> 진공 및 헬륨 꺼. </li><li> 라인 헬륨 (헬륨 게이지가 0 PSI를 표시한다)가 포함되어 있지 않습니다 때까지 여러 번 화재. </li><li> PDS - 1000 시스템을 끄십시오. </li></ol> 충격 후 웜 복구 : <ol><li> ° C 20 분 20 포격 접시를 남겨주세요. </li><li> 10 ML S - 기초 또는 M9 버퍼 접시에서 벌레를 플로트. </li><li> 10cm 발견 팡가 플레이트 - 20 0.5mL 벌레를 넣어. </li><li> 약 2 주 동안 ° C 또는 객실 온도 (22-24 ° C) 구조 벌레에 대한 확인하기 전에 20 둡니다. </li><li> 해부 현미경으로 UNC - 119 (+) 표현형과 벌레에 대한 화면. 구조 웜이 아닌 구조의 웜 이상 생존 이점을 가지고 이후 플레이트가 굶어 죽었 후 심사를위한 최적의 시간입니다. </li><li> 구조 벌레를 포함된 각 10cm 접시에서 한 개인의 라인을 생성합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 유전자 변형 동물을 얻기에 관해서와 프로토콜의 성공은 특정 transgene에 따라 달라집니다. 발기인의 경우 : GFP의 기자 transgenes 우리 20 라인까지 취득했습니다. 보다 일반적인 결과는 3-10 행이다. 최대 형질 라인의 30 %에 통합 라인은 있지만, 이것은 임의이며 통합된 라인이 특히 필요한 경우 우리가 하루에 여러 bombardments을 수행합니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Biolistic 폭격 C. 포함한 많은 생물에 외국의 DNA를 소개하는 간단한 방법입니다 엘레간스 1,5,6,7,16. 그것은 CaCl 2의 면전에서 DNA와 복잡한를 형성 금 입자에 의존하고 있습니다. 같은 spermidine과 같은 양이온 polyamines은 생체내의 nuclease 저하로부터 DNA를 보호합니다. spermidine는 불안 정한 분자이기 때문에, 그것은 -20 ° C에서 작은 aliquots에 저장하고, 바로 폭격을 수행하기 ?...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Gold particles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Inbio gold</td>
<td>BD021</td>
<td>1micron</td>
</tr>
<tr>
<td>Midiprep kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12143</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spermidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S4139</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td> P4505</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Macrocarriers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2335</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PDS-1000/He Hepta System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2257</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rupture disk</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biorad</td>
<td>165-2330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nystatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>N1638</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP</td>
<td>100556</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of transgenic c. elegans by biolistic transformation

무료 생활 선충류의 C.를 사용하는 실험실의 개수 엘레간스이 급속도로 성장하고있다. 이 생물 학적 모델의 인기는 빠른 세대 시간과 짧은 수명, 간단하고 저렴한 유지 보수, 완전 합성 게놈과 RNAi 자원과 돌연변이 동물의 배열에 따라 결정됩니다. C.의 또한, 분석 엘레간스 게놈은 벌레의 연구는 전체 생쥐이나 교양 세포에서 수행한 연구에 중요한 부가 될 수 있다고 제안 웜 이상의 척추 동물 사이 좋은 유사를 공개했다. 웜 연구의 강력하고 중요한 부분은 유전자 현지화 및 기능을 연구하기 위해 유전자 변형 동물을 사용하는 능력입니다. 유전자 변형 동물 중 웜 germline의 microinjection을 통해 또는 biolistic 폭격의 사용을 통해 만들 수 있습니다. 폭격 새로운 기술이며, 실험실의 숫자로 덜 익숙한 것입니다. 여기서 우리는 바이오 래드 PDS - 1000 시스템을 사용 금 입자와 충돌하여 biolistic 유전자 변형 벌레를 생성하는 간단한 프로토콜을 설명합니다. 남녀 추니 germline로의 DNA microinjection에 비해,이 프로토콜은 웜 해부학을 식별하거나 microinjection을 수행 관련하여 운영자로부터 특별한 기술을 필요로하지 않는 장점이 있습니다. 또한 여러 형질 라인은 일반적으로 하나의 충격에서 얻을 수 있습니다. 또한 microinjection에 대조적으로, biolistic 폭격 extrachromosomal 배열과 통합 transgenes 모두 유전자 변형 동물을 생산하고 있습니다. 통합 형질 라인을 얻을 수있는 능력은 외국 DNA를 통합하는 mutagenic 프로토콜의 사용을 피할 수 있습니다. 결론적으로, biolistic 폭격 특히 microinjection에 숙련되기 위해 필요한 시간과 노력을 투자에 관심이없는 조사에 대해, 유전자 변형 동물의 생성을 위해 매력적인 방법으로하실 수 있습니다.

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Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

유전자 변형 벌레는 일반적으로 사용됩니다<em&gt; C. 엘레간스</em&gt; 연구. 설명은 DNA - 코팅 금 입자와 biolistic 폭격을 사용하여 웜로 transgenes을 소개, 효과 아직 간단한 프로토콜입니다. 참여 노력과 폭격의 결과는 유전자 변형 동물의 생성을 위해 microinjection과 호의를 비교합니다.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

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Biology

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

21.8K 조회수.  University of Pittsburgh. 유전자 변형 벌레는 일반적으로 사용됩니다 C. 엘레간스 연구. 설명은 DNA - 코팅 금 입자와 biolistic 폭격을 사용하여 웜로 transgenes을 소개, 효과 아직 간단한 프로토콜입니다. 참여 노력과 폭격의 결과는 유전자 변형 동물의 생성을 위해 microinjection과 호의를 비교합니다.

비디오: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

RNA 함유 Oligonucleotides를 사용하여 변환하여 게놈 DNA에서 RNA / DNA 하이브리드의 생성

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

배양<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em &gt; 미세 폭격에 의한 무균 액체 미디어 및 형질 전환 웜의 생성에

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Methods Article

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해