우리 모두는 콜드 웰 연구소 회원의 협력 정신을 인정하고 싶습니다. 연구실에 운동 장애 연구는 바흐만 - 스트라우스 Dystonia &amp; 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨병 재단, 미국 파킨슨 질병 협회, 앨라배마 파킨슨병 협회, 파킨슨병 연구에 대한 마이클 J. 폭스 재단과 대학 연​​구소에 의해 지원되었습니다.

표현 플라스미드 건설 두 plasmids이 필요합니다 : 조직 특정 관심의 유전자의 표현과 선택 전환 표시로 두 번째 한. 실험 플라스미드 <ol><li> 예를 들어 관심의 조직 / 세포 유형, 신경이나 근육 특정 발기인 표현하는 발기인을 선택합니다. 하나는 같은 조직 내에서 여러 개의 유전자를 표현하는 경우, 게이트웨이 시스템 (Invitrogen)에 플라스미드 발기인 카세트를 사용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 recombinational 복제 4에 의해 모터의 관심 하류의 유전자의 삽입을 허용합니다. 일반적으로 상류 시퀀스의 2-5킬로바이트가 정확하고 정확한 표현을 가지고 충분하다. </li><li> 관심 유전자의 cDNA는 두 가지 방법으로 복제하실 수 있습니다 <ol><li> 제한 효소를 사용하여 기존 복제. </li><li> 게이트웨이 복제의 경우, PCR은 게이트웨이 AT &amp; T B recombinational 시퀀스를 포함하는 primers를 사용하여 증폭됩니다. 증폭된 cDNA 먼저 입력 벡터를 만들 수있는 기증자 벡터 pDONR201에 recombined 후 E.으로 변화됩니다 콜리 변형 DH5a. 성공 recombinants과 DNA의 미니 준비 고립의 선택에 따라, 입력 벡터는 표현식이 플라스미드 만들 수있는 프로 모터 함유 대상 벡터에 recombined입니다. recombinational 복제에 대한 자세한 내용은 Invitrogen 게이트웨이 설명서 중 또는 콜드웰 외에서 사용할 수 있습니다. 5. </li></ol></li></ol> 플라스미드 선택 마커 형질 마커 plasmids의 예로는 rol - 6 또는 형광 단백질 발현을 유발하는 신체 벽 근육업자 UNC - 54의 사용을 포함합니다. 이러한 마커 plasmids 요청에 따라 연구 공동체 내에서 일반적으로 사용할 수 있습니다. C. 엘레간스의 Microinjection 준비 <ol><li> 주입 수있는 두 plasmids DNA의 격리를 수행합니다. 그들을 Quantitate 50 μl / NG 각 1:1 비율에 함께 섞는다. </li><li> 한천 패드 준비 : <ol><li> 녹아 때까지 가열하거나 전자 레인지, 2 % 아가로 오스의 물 솔루션을 확인하십시오. </li><li> benchtop 여러 22 X 50mm 커버 유리를 설정합니다. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용 하나의 커버 유리에 녹인 아가로 오스의 드롭을 배치하고 바로 첫 번째 90 각도에서 드롭을 통해 두 번째 덮개 유리를 놓습니다. 여러 표지 안경에 대해 반복합니다. 아가로 오스의 평평 디스크의 직경은 15~20mm 사이 여야합니다. </li><li> 아가로 오스가 (이 순간 밖에 걸리지 않습니다) 확정 후 덮개 유리를 제거하고 (야간에 몇 시간) 패드가 완전히 건조 공기 수 있습니다. </li><li> 상온에서 커버 유리 상자에 패드를 저장합니다. </li></ol></li><li> DNA 솔루션에 대한 바늘 로더를 만들기 : 니들 로더는 개방 불꽃을 통해 중간에서 온수 빠르게 두 번 정도 자신의 길이로 행진 100 μl 모세관 튜브에서 만들어집니다. 모세관이 냉각되면 두 개의 반쪽이 떨어져 먹습니다. 주사 바늘 10-20 로더를 비축. microcentrifuge 튜브 랙에 똑바로 보관하십시오. 사용 포인트에 자신을 찌르려고 않는 등주의하십시오. </li><li> microinjection의 바늘 만들기 : 바늘은 내부 유리 필라멘트를 포함하는 특수 모세관에서 만든,이 필라멘트는 DNA 솔루션 심지 역할을합니다. 이러한 바늘 풀러 컴퓨터에 뽑아 있습니다. 우리는 24.8의 열 설정 Narishige PP - 830 풀러를 사용합니다. 몇 바늘은 한 번에 뽑아 있으며 작은 플라스틱 상자에 저장됩니다. 여러 개의 바늘이 쉽게 장기 저장을위한 모델링 점토의 스트립에 &quot;마운트&quot;가 될 수 있습니다. </li><li> 니들 팁 &quot;차단기&quot; microinjection 니들의 끝 그것은 실제로 그것을 결국 폐쇄되도록 잘 뽑아이며 커버 유리의 작은 파편을 사용하여 열고 깨진해야합니다. 이들은 종이 타월에 18 X 18mm 커버 유리를 포장하고 여러 조각으로 나누기까지 부드럽게 압력을 적용하여 준비가되어 있습니다. 유용한 크기의 파편은 약 3 X 4mm입니다. </li><li> 표준 절차 6을 사용하여 사출을위한 초기 성인 무대에 야생 유형 (N2) 벌레를 성장. 약 100 준비가 제대로 벌레를 연출 / 주입 구축. </li></ol> 절차 <ol><li> microinjection의 바늘 팔과 홀더에 연결된 헬륨 탱크의 주요 밸브를 엽니다. 가스 35 PSI로 압력을 가져, 라인을 입력 수 있도록 조절 밸브를 닫습니다. 가스가 발 페달을 사용하여 릴리스 될 수있다는 사실을 알아야한다. </li><li> 표준 입 pipetter 튜빙 (유리 모세관 튜브의 용기에서 발견)로 바늘 로더를 삽입하고 플라스미드 혼합물 (~ 1 μl)의 소량을 그립니다. </li><li> 바늘 로더는 신중하게 주사 바늘의 백 엔드에 위치하고 부드럽게의 길이 처음부터 끝까지 삽입저항까지 바늘이 느껴집니다. 부드럽게 불어하여 ​​DNA 솔루션을 추방 다음 로더를 제거합니다. </li><li> 작은 내부 고무 가스켓 내에 배치주의하고, microinjection 암에 바늘을 삽입합니다. </li><li> 한천 패드 중 하나를 가장자리에 커버 유리 바늘 파괴 조각을 놓으십시오. 할로 카본 오일, 조각뿐만 아니라 한천 패드의 전체 표면을 커버. 거꾸로 현미경의 무대에 한천 패드를 놓습니다. </li><li> 4X 객관적이고 명시야 조명을 사용하여 볼 필드의 중앙에 바늘을 위치하지만, 아직 기름으로 낮은하지 않습니다. 또한, 중앙에 커버 유리 조각의 내부 가장자리에 위치 다음에 초점을 (여전히 4X 목표를 사용하여). 커버 유리 조각 같은 초점 비행기로 데려, 기름에 바늘을 낮춥니다. 40X 목표로 전환하여 배율을 올려. 조각의 가장자리에 집중할 필요한 경우, 바늘의 팁을 변경합니다. </li><li> 발 페달을 통해 가스의 짧은 펄스를 적용하는 동시에 동안 주입 바늘 끝을 열려면, 부드럽게, 커버 유리 조각의 가장자리에 대한 바늘을 찔러. 액체의 작은 방울이 바늘의 끝을 벗어날 때 주사 바늘을 충분히 개방 고장 것입니다. 그것은 동물을 죽일 수 있으므로 너무 큰 개방으로 인한 초과 액체 흐름은 바람직하지 않습니다. </li><li> 바늘을 높여 무대에서 한천 패드를 제거하지만, X 또는 Y 축 위치를 변경하지 마십시오. 바늘 아래에서 무대를 슬라이드, 한천 패드를 제거하고 해부 현미경에 그것을 놓으십시오. 기름의 표면 아래에 패드로 웜을 전송합니다. 웜 wriggles, 부드럽게 스트로크 경우는 연락처 한천 패드까지. 습한 웜은 건조 아가로 오스을 준수해야합니다. </li><li> 주사 <ol><li> 빠르게보기의 분야에서 벌레를 중심 무대로 한천 패드를 다시 넣으십시오. </li><li> 웜으로 초점 동일한 비행기에 바늘을 낮춥니다. </li><li> 호프만 조명 (콘트라스트 필터의 종류)에 필터를 전환합니다. 이것은 벌레의 형태학의 세부 사항이 표시 될 수 있습니다. Nomarski / DIC 광학은 잘 작동됩니다 거꾸로 범위에서 사용할 수있는 경우. 40X 목표를 사용하여 세균의 핵의 &quot;벌집&quot;패턴 아래 웜 생식선의 &quot;낟알&quot;syncytial 센터 (바늘을 직면하고있는 웜의 측면에 위치 중에서 생식선 선택)에 중점을두고 있습니다. </li><li> 미세 조정 끝 (생식선 &quot;graininess&quot;같은 비행기) 초점 또한 때까지 바늘의 위치. </li><li> 부드럽게 생식선의 중앙에 바늘을 삽입하고 생식선 팔로 DNA의 비말 또는 두 추방하는 가스 압력의 간단한 펄스를 적용합니다. 당신은 말초 생식선에 걸쳐 액체 확산의 물결을 준수해야합니다. 너무 많은 액체가 oocyte 생산​​을 종료할 수있는 생식선 팔 근위 구부로 흘러 수 있기 때문에 더 많은 액체가 더 좋은 가정하지 마십시오. 가능하다면, 웜의 위치에 따라 같은 방식으로 다른 생식선의 팔을 주입. </li><li> 그것이 쉽게 건조시키다 수있는 그것은 벌레를 주입하면서 신속하게 작업하는 것이 중요합니다. 두 번째 생식선의 팔을 투입하기로 한 결정은 바늘과 벌레를 다시 배치할 수 있습니다 얼마나 빨리에 의존적일 수 밖에 없습니다. 전체 과정은 이상적으로 1~2분 미만 정도 소요됩니다. </li></ol></li><li> 무대에서 커버 유리를 제거하고 해부 범위에 놓으십시오. 직접 주입 벌레에 M9 버퍼의 1μl를 (22mM KH 2 PO 4, 42mM 나 2 HPO 4, 85mM NaCl, 1mM MgSO 4) (이것은 할로 카본 오일의 표면 아래에 피펫 팁을 잠수함이 잠수 수반 수도 있습니다)이 적용됩니다. 버퍼 벌레를 rehydrate해야한다 그것은 다음 아가로 오스 패드 표면을 부유합니다. 웜 선택을 사용하여 일반 접시로 웜을 전송합니다. 이 버퍼와 웜 더 이상 준수하지와도 포화 상태가 될 때까지 아가로 오스 패드는 몇 번 더 활용할 수 있습니다. </li></ol> 형질 선택 <ol><li> 주입 웜, P 0 세대, 개별 신선한 bacterially 씨앗 접시 (60 ㎜)로 전송하고 재현 사용할 수 있습니다. 자식이 나타날 때까지 일반적으로 주입 동물은 2-3 일동안은 20 ° C에서 incubated입니다. </li><li> F 1 아기는 형광 stereomicroscope를 사용하여 형질 마커 (예 : 형광 등)의 증거를 관찰하고 있습니다. 각 형광, 캐리어 F 1, 동물은 별도 (각 F 1부터 자손이 서로 다른 라인을 간주됩니다 이후) 새 접시에 복제됩니다. F 1 나온것은 재현할 수 있습니다. 자식이 나타날 때까지 다시, 이것은 일반적으로 20 ° C 2-3 일동안은에서 수행됩니다. </li><li> F 2 세대뿐만 아니라 유전자 변형 동물에 대한 관찰이다. 상속 및 유전자 변형 배열을 표현하는가 F 2 동물은 &quot;안정적인&quot;라인 간주됩니다. 참고 : F 1 일에나이가 많은 유전자 변형 동물이있을 수 있지만, 그들은 안정되지 않습니다. F 1 유전자 변형 동물의 대부분은 F 2 안정적인 라인에 전파되지 않습니다. 참고 : 유전자 사본 번호 다양성에 대한 제어하려면, 주입 구조 지당 3 독립 안정적인 라인의 최소를 생성합니다. </li><li> 각 독립적인 안정 라인 웜 별도의 라인으로 유지 관리해야합니다. 각 라인은 각 세대에서 새 접시에 여러 유전자 변형 동물을 전송하여 전파 될 수 있으며, 선택 마커가 형광면 이것은 형광 stereomicroscope를 사용하여 수행되어야합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extrachromosomal+DNA+transformation+of+Caenorhabditis+elegans.">Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).</li><li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+in+C.elegans:+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences.">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li><li>Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+somatic+and+germline+expression+of+a+generally+expressed+Caenorhabditis+elegans+gene.">Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene.</a> Genetics. 146, 227-238 (1997).</li><li>Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Torsin-mediated+neuroprotection+from+cellular+stresses+to+dopaminergic+neurons+of+C.+elegans.">Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans.</a> J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).</li><li>Caldwell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. , (2006).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li></ol>

이 절차를 수행할 때, 그것은 기억하는 것이 중요합니다 : - 생식선의 중심에 직접 주입 - 너무 많은 액체를 주입하지 - dessication을 방지하기 위해 신속하게 작동합니다. 당신이 너무 큰 고장 등 바늘과 문제에 실행하는 경우, 그것은 오히려 이상적인 바늘보다 적은 비용으로 주입하는 것보다, 신선한 바늘을 리메이크하는 것이 좋습니다. 유전자 변형 벌레의 생성과 같은 다양한 애플 리...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Ultrapure</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halocarbon Oil, Voltalef</td>
<td>Hulle 10S</td>
<td>elfatochem, France</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 18x18 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 20x30 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-548-5A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Coverglass 22x50 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-545-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 ul Capillary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53432-921</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Capillary for Needles</td>
<td>"Kwik-Fil"</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>1B100F-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Needle Puller</td>
<td>Tool</td>
<td>Narishige</td>
<td>Model PP-830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>microINJECTOR System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tritech Research</td>
<td>MINJ-1000</td>
<td>Scope, Stage, Manipulator</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting, with Fluorescence</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>SMZ645</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generation of stable transgenic c. elegans using microinjection

유전자 변형 Caenorhabditis의 엘레간스는 즉시 생식선 하나에 DNA 플라스미드 솔루션의 microinjection을 통해 만들 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 염색체 안정 실제이 같은 효율성과 함께하지만,하지 상속됩니다 extrachromosomal concatamers을 형성 다시 배열. 관심 유전자는 해부 현미경으로 유전자 변형 동물의 선택을 허용하는 등 rol - 6 GFP와 같은 명백한 phenotypic 마커와 공동 주입이다. 외인성 유전자는 세포의 현지화 연구에 대한 기본 발기인의 표현 수 있습니다. 또는, transgene은 그 특정 세포 또는 조직에있는 유전자 산물의 역할을 평가하는 다른 조직에 특정한 모터에 의해 구동 수 있습니다. 이 기술은 효율적으로 germline 또는 초기 배아 3 제외한 C. 엘레간스의 모든 조직에서 유전자 발현을시킵니다. 유전자 변형 동물의 창조는 광범위하게 실험 패러다임의 다양한 활용합니다. 이 동영상은 유전자 변형 벌레를 생성하는 microinjection 절차를 보여줍니다. 또한, 안정적인 형질 C. 엘레간스 라인의 선정 및 유지 보수가 설명되어 있습니다.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

이 동영상은 유전자 변형 동물을 만들 C. 엘레간스의 생식선에 microinjection의 기법을 보여줍니다.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

52.7K 조회수.  University of Alabama. 이 동영상은 유전자 변형 동물을 만들 C. 엘레간스의 생식선에 microinjection의 기법을 보여줍니다.

비디오: Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

트렌스 제닉 모기를 구하는 A. aegypti의 태아의 Microinjection

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

연구

생물학

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

시토크롬의 세포질 Microinjection 의한 Apoptosis의 활성화 C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

형질 전환의 세대<em&gt; 히드라</em&gt; 배아 미세 주입에 의해

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스 제닉 C. 엘레간스의 생성