Name: ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb
Uploaded: 2014-08-04T23:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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, F30 DC011673 (GFH : NINDS, NIH)과 유타 남서부 시작 기금 (JPM) :이 연구는 R00 DC011780 (NINDS, NIH JPM)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 UT 요리 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행하였으며, 실험 동물에 의해 경험 한 스트레스, 불편과 고통을 최소화하도록 선택되었다. 1. 해부 상공 회의소 사용자 지정 해부 실 및 작은, 얇은 플라스틱 판자는 최상의 결과를 (그림 1)이 필요합니다. 이 프로토콜을 시도하기에 앞서 이러한 챔버를 구축 또는 구하십시오. 2. 해부 솔루션 <ol><li> 단계 3.22-5.4에 사용하기 위해 표준 인공 뇌척수 (ACSF)의 1 L를 준비합니다. 염화나트륨 125 밀리미터,의 KCl 2.5 밀리미터, 염화칼슘 2 ㎜, MgCl2를 1 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터,의 NaH 2 PO 4 1.25 밀리미터, 미오 이노시톨 3 mm의 나트륨 피루 베이트 2 ㎜, 아스 코르 빈산 나트륨 0.4 ㎜를 추가하고 25 포도당 mM의 발열 물질이없는 물 1 L에. </li><li> 에 대한 초기 해부 ACSF (200 ㎖) 준비단계 3.3-3.22에 사용합니다. 표준 ACSF 200 ㎖를 타고 MgCl2를 수화물 0.366 g을 추가하여 9 개 mm로 MgCl2를 농도를 높입니다. </li><li> 염화나트륨 115 밀리미터, KCl을 5 밀리미터, 염화칼슘, 2 ㎜, MgCl2를 2 ㎜, 탄산 수소 나트륨 25 밀리미터, HEPES 10 mM의를 포함하는 단계 4.11-5.4에 사용되는 정맥을 통해 VNO에 자극을 수행하는 표준 링어의 솔루션을 준비, 10 mM의 포도당. </li><li> 버블 사용할 때까지 15 분의 최소 37 ° C의 물을 욕조에 95 % O 2, 5 % CO 2 가스 표준 ACSF 및 링거의 0.5 L의 0.8 L. </li><li> 거품 95 % O 2 초기 해부 ACSF의 200 ㎖, 그것은 4 ° C를 15 ~ 20 분 동안 얼음에 5 % CO 2 가스에 도달 할 때까지 </li></ol> 3. 기본 해부 <ol><li> 해부 영역을 준비합니다. 세 35mm 페트리 접시를 놓고 산소 ACSF, 바로 가위, Adson 집게, # 11 두피를 해부 가위를 해부 곡선 잘린 가위,,엘 칼날과 손잡이와 얼음에 면도날. </li><li> 산소 ACSF 4 ° C로 냉각 한 후, 깊이 2 ~ 5 ㎖의 Isothesia (99.9 % 이소 플루오 란)를 사용하여 건조 챔버에서 동물을 마취. 동물이 깊은 마취를 보장하기 위해 꼬리와 발 핀치 테스트를 수행합니다. </li><li> 깊은 마취가 확인되면, 동물의 목을 벨 즉시 냉장 해부 ACSF 가득 페트리 접시에 머리를 놓습니다. 참고 : 사용하지 않을 때의 절차를 통해 시원한 곳에 보관하는 냉장 해부 ACSF의 조직을 담근다. </li><li> 곡선 가위로 낮은 측면 (복부 인두, 아래 턱, 혀)를 제거합니다. </li><li> Adson의 포셉 deglove (껍질) 표피와 두개골의 근육 첨부 파일을 사용하여. 껍질 주동이에 꼬리에서 두피 첨부 파일의 전용 사이트까지 앞니 이상이다. 곡선 가위를 사용하여 접속 지점에서 조직을 잘라. 집게로 잡고 눈을 제거하고 준비에서 떠나십시오. N귀 degloving 절차의 끝, 위턱 뼈없는 근육 첨부 파일 Adson의 집게를 사용하여 섬세한 코의 연골에 여분의 힘을 피하십시오. 참고 : 바로 가위로 두개골의 꼬리 부분에서 두피를 분리합니다. </li><li> 가위 팁 (직전 rhinal 동을) 정면 뼈에 몇 mm가 될 때까지 똑바로 가위, 주동이에 꼬리에서 두개골의 중간 선을 삭감. </li><li> Adson의 집게를 사용하여 두개골의 정수리와 정면 뼈를 제거합니다. 참고 : 정면 뼈의 조각은 종종 rhinal 동에 꼬리 코 뼈에 부착 된 상태로 유지됩니다. 후각 전구와 접촉하지 않도록주의하여이 조각을 제거합니다. </li><li> 부비동에 전두엽 2mm의 꼬리를 통해 관상 컷을 한 다음 컷으로 뇌의 꼬리를 제거하기 위해 메스를 사용합니다. 완전히 후방 조직을 절단하는 메스 연락처 복부 두개골의 뼈 윤곽의 끝을 확인합니다. 참고 :이 수측면 후각 책자 또는 후각 전구에 기계적 스트레스를주지 않고 뇌의 대부분을 제거. </li><li> 바로 가위로 복부 두개골의 노출 꼬리 부분을 제거합니다. 부비동과 남아있는 신경 조직을 남겨주세요. </li><li> 바로 가위를 사용하여 두개골의 해부학 오른쪽 광대뼈 아치와 얼굴 근육을 제거 </li><li> 입의 지붕을 노출 (복부 측면을 위로) 주둥이를 뒤집으십시오. </li><li> 잘라 앞니에 미각이 바로 꼬리 제거합니다. 입천장에 구개 병렬에서 메스 블레이드의 팁을 삽입하여이 작업을 수행 한 후 앞니를 향해 칼날을 이동합니다. </li><li> Adson 집게와 미각의 해제 (주동이의) 가장자리를 잡고 꼬리 쪽 잡아 당겨 제거합니다. </li><li> 두개골의 해부학 왼쪽에, 어금니 근처의 작은 난원에서 시작, 꼬리 쪽 팔 라틴 난원을 확장 메스 블레이드를 사용합니다. 메스 즐의 끝을 삽입하여이를 달성어금니 근처 무효로 해제하고 손목을 회전. 참고 : 블레이드의 팁만을 사용에 각별한주의를 기울이십시오 - 깊은 상처가 중격 조직을 손상시킬 수 있습니다. </li><li> 해부학 왼쪽 vomeronasal 기관에 주동이를 시작, 앞니를 통해 구개 난원에서 잘라 메스 블레이드의 팁을 사용. 여러 점수 인하를 사용합니다. 너무 깊이 블레이드를 삽입하여 중격 조직과 vomeronasal 신경을 손상하지 마십시오. </li><li> 그래서 지느러미 두개골가 직면하고있는 조직을 켠 다음 준비의 꼬리 가장자리에 수직으로 직선 면도날 (중간 선에 평행) 방향. </li><li> 조직의 복부 에지에서 즉시 정중선의 왼쪽 면도날의 절삭 날을 터치. 날을 부드럽게 바위와 왼쪽 팔 라틴 난원 (단계 3.14에 도입 된 지역을 절감)를 따라 이동합니다. </li><li> 조직의 지느러미 가장자리에서 즉시 정중선의 왼쪽 (1 mm 미만)에 면도기의 최첨단을 배치합니다. </li><li> 유지블레이드가 조직의 전방을 향해 압력을 서서히 면도날 바위, 중앙선에 평행. 소공 질의 플레이트에 저항을 알 수 있습니다. 이 저항을 돌파 한 후 즉시 중지합니다. NOTE :이 시점에서, 우반구가 좌반구에서 느슨하게된다. 유일하게 남아있는 연결은 소공 질의 플레이트 등의 주둥이 앞쪽에 따라 반구 사이에있다. </li><li> 장갑을 낀 손가락으로 꼬리 양쪽 근처를 잡고 부드럽게 옆으로와 전방을 회전하여 반구를 분리합니다. 참고 :이 단계는 특히 편향 또는 부서지기 쉬운 주둥이 (예를 들어, 이전 마우스)와 생쥐 실험 다양성의 원천입니다. 또한, 강한 저항이 결합 조직을 약화 등의 주둥이 (소공 질의 플레이트 앞쪽) 점수가 발생하는 경우, 서로 떨어져 반구를 회전하는 동안. 이렇게하는 동안, 중격 TI를 손상시킬 수있는, 깊이 메스를 삽입하지 세심한주의를 가지고ssue 및 vomeronasal 신경. </li><li> 판자에 조직 접착제의 소량 (50 ~ 100 μL)을 적용하고 부드럽게 Adson의 집게를 사용하여 접착제에 오른쪽 반구의 측면 가장자리를 놓습니다. 판자에 조기 접착제의 중합 및 느슨한 부착을 방지하기 위해 종이 타월을 사용하여 준비의 측면에서 과잉 수분을 제거합니다. 참고 : 조직이 접착제에 배치 된 후 접착제의 중합 반응을 가속화하기 위해 샘플에 냉장 해부 ACSF 몇 방울을 적용합니다. 이 조직은 판자에 단단히 개최 유지되도록합니다. </li><li> 보조 해부 실의 중간에 진공 그리스의 작은 금액 (3-5 mm 직경, 깊이 2mm)를 놓고 단단히 그리스에 대한 조직 맞은 판자의면을 배치합니다. 즉시 미세 해부 영역에 전송하고 산소 표준 ACSF와 관류를 시작, 냉장 해부 ACSF으로 해부 챔버를 입력합니다. 후각 망울이 직접 있도록 판자의 방향을갓 산소 표준 ACSF의 스트림. </li></ol> 4. 보조 해부 <ol><li> 미세 집게를 사용하여 준비에서 눈에 보이는 반대편 (왼쪽) 후각 망울 또는 대뇌 피질의 조직을 제거합니다. (세미 무딘 점을 형성하는) 미세 집게를 함께 꼬집어하고 중간 선 부근의 지느러미와 조직의 꼬리 부분에 배치합니다. 부드럽게 멀리 전방 움직임에 천천히 오른쪽 뇌의 조직을 박리, 중간 선을 따라 슬쩍 집게를 실행합니다. 반대측의 후각 망울의 조직을 포함하여 반대측의 조직을 모두 제거합니다. AOB 또는 vomeronasal 신경에 손상을 줄 수있는 조직을 찌르지 않도록 세심한주의를 기울입니다. </li><li> 후각 망울의 등 / 내측 표면을 따라 흰색 뇌경막을 준수하십시오. 미세 집게 두 쌍의 경질의 백인 부분에 잡고 후각 망울의 등 / 꼬리 가장자리를 따라이 경막 눈물 멀리 그 시점에서 그들을 잡아 당깁니다. 경질 단단히입니다후각 전구를 감싸, 그것을 제거하는 동안 쉽게 자체 조직을 통해 슬라이스 할 수 있습니다. 후각 망울과 AOB 자체의 내측 표면의 손상을 방지. 참고 : 경질이 시점에서 쉽게 찢어 저항하는 경우, 분리를 용이하게하기 좋은 봄 팁 해부 가위로 작은 상처를 소개합니다. </li><li> 차분히 기본 후각 전구를 손상시키지 않고 미세 집게와 정면 외피를 벗겨. AOB에 바로 꼬리 반투명 순으로 나타나는 혈관의 컬렉션을 준수하십시오. 전기 생리학 실험에서 전극의 침투를 용이하게하기 위해 미세 집게로이 그물을 제거합니다. 그것은 정면 피질 후퇴하는 동안 AOB에서 분리로 집게로 그물을 잡고 AOB을 만지지 않도록 조심하면서, 꼬리 쪽과 내측으로 잡아 당겨 제거합니다. 전두엽 피질의 후각 전구에서 분리되면, AOB에 복부와 뒤 집게로 절단하여 제거합니다. 참고 : 예를 가지고그것이 너무 크게 할 경우 그물 제거와 함께 치료를 트림에 대한 사구체 층이 손상 될 수 있습니다. </li><li> 노출 반대편 비강에서, 미세 집게를 사용하여 남아있는 반대측 중격 조직 (혈관을 포함하는 얇은 황색 시트)를 제거합니다. (중격 뼈 근처) 꼬리 / 등의 지역에서 조직을 파악하고 전방 측을 향해 조직을 리프트 / 당깁니다. 참고 : 반대측 중격 조직이 실수로 hemisection 단계 (단계 3.20) 동안 제거 할 수 있습니다. 이러한 경우에, 흰색, 무 혈관 중격 연골과 약간 투명, 혈관 중격 뼈를 관찰합니다. 이 경우, 스텝 8.8은 생략 될 수있다. </li><li> 조심스럽게 중격 연골과 VNO &quot;날개&quot;(두 VNOs의 지느러미 가장자리를 따라 실행 뼈 조직의 얇은 조각 사이의 미세 집게의 단일 지점을 실행하여 반대측 VNO를 제거합니다. <ol><li> 연골의 날개 분리 후, 배쪽으로 집게의 끝으로 이동중간 선 부근 반대측 VNO에. 집게로 잡고 멀리 들어 올려 제거 할 수 있도록, 그것을 풀어야 반대측 VNO의 주동이 / 꼬리 축을 따라 여러 위치에서이 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 미세 집게와 꼬리 / 복부 가장자리에 상처를 (그것이 중격 뼈의 복부 가장자리를 따라 흰색 무혈성 지구 실행에 좁은 곳)함으로써 중격 연골을 제거하기 위해 준비합니다. </li><li> 반 무딘 점을 만들기 위해 함께 미세 집게를 집어 중격 연골을 제거합니다. 단계 4.6에서 만든 컷을 확인, 해당 컷에 (측면) 뒤에 슬쩍 집게를 삽입 한 다음 천천히 중격 조직에서와 rostrally 진행 연골을 들어 올립니다. 참고 : 기본 중격 조직을 방해하지 마십시오. 연골 들어 올릴으로 인해 연골에 느슨하게 유착에 중격 조직 스트레칭의 기본 시트를 관찰합니다. 느슨한의 사이트를 따라 슬쩍 미세 집게의 정기 온화하고 안정된 움직임dhesion 크게 두 구조의 성공적인 분리를 용이하게 할 수있다. </li><li> 중격 뼈를 제거하기 위해 구부러진 팁 # 3 포셉 한 쌍을 사용합니다. 각도 중격 뼈 접근 거의 중격 뼈의 평면에 평행. 중격 조직과 중격 뼈 사이의 곡선 가지를 삽입합니다. 집게와 뼈를 잡고 부드럽게 소공 질의 플레이트 근처에 균열 때까지 앞뒤로 뼈를 이동합니다. NOTE : 일부 경우에, 중격 뼈 소공 질의 플레이트 근처 속보 레지스트 것이다. 이 경우, 부드럽게 단지 4.8 단계를 반복 한 다음, 소공 질의 판에 전방 지느러미 / 복부 축을 따라 중격 골을 득점하는 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 입구에 미세 집게 일쌍으로 곤란 및 미세 집게의 또 다른 쌍의 rostrally 당겨 단지 VNO에 주동이의 흰색 연골을 제거합니다. </li><li> 빠른 관류 장치에 폴리이 미드 정맥을 연결하고 폴리이 미드 캐 뉼러를 통해 링거액 (0.1 ~ 0.3 ㎖ / 분)의 흐름을 시작합니다.NOTE : 라인, 작은 양의 유량계 측정 유량. 컴퓨터 제어 공기 부양 스위칭 장치의 사용은 자극시 유량의 변화를 줄일 수 있습니다. 응답을 자극 특정 보장하기 위해 모의 자극 (링거액을 제어)에 대한 응답으로 자극을 테스트하는 신경 반응을 비교. </li><li> VNO 입구 정맥 평행의 방향. 캐 뉼러가 만족 VNO 입구 평행하면 출구 압력이 VNO이 원인으로, 혈관의 피난 선도 &quot;팽창&quot;본다. 바로이 VNO 개방 평행하게되도록 정맥 상수의 각도를 유지하는 VNO에 캐 뉼러를 삽입합니다. 참고 : 플라스틱 판자에 대한 미세 집게 일쌍과 정맥을 잡고 약간 위쪽 각도로 정맥의 끝을 미세 집게의 또 다른 쌍을 사용하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 하나의 실수 VNO 뒤에 뉼러를 배치하는 경우, 유출은 VNO 혈관에게 발생할 수대피, 적절한 삽관을 수행 한 인상을 선도. 적절한 위치는 링거 용액에 염료를 혼입에 의해 확인 될 수있다. 정맥이 제대로 배치되면, 염료 만해야 VNO 입구를 통해 종료합니다. 또한, 하나는 정맥이 VNO의 반투명 중간 부분을 통해 쉽게 볼 수 있음을 확인하여 적절한 위치를 확인할 수 있습니다. </li><li> AOB가 VNO에서 정맥을 제거하지 않도록주의하고, 표준 ACSF의 직접 교류가 될 때까지 천천히 플라스틱 판자를 이동합니다. 해부가 완료되고 생리 기능의 평가는 즉시 시작할 수 있습니다. 5 단계는 간단히 이러한 평가를 만들기위한 한 가지 방법에 대해 설명합니다. </li></ol> 5. 평가 <ol><li> 세포 증폭기 및 오실로스코프에 연결된 2-4 MΩ 붕규산 유리 미세 전극으로 AOB의 표면을 침투. </li><li> 천천히에서 100 ~ 200 ㎛의 깊이에 미세 전극을 사전50 ㎛ / 분의 속도로 표면. 참고 :이 조직의 깊이에, 하나는 미세 전압의 날카로운, 짧은 (~ 1 ~ 2 밀리 초) 편향에 의해 예시 가끔 자발적 활동 전위 파형을 발생합니다. </li><li> 활동 전위 파형을 발생하면, 미세 전극을 발전 정지. </li><li> 관찰 및 / 또는 VSN 활성의 공지 된 활성화 제 (예를 들어, 50 mM의 KCl을 함유 링거액)로 제어 링거에서 자극 전달 솔루션을 바꾸면서 활동 전위 속도를 기록한다. 해부에 성공하면, 활동 전위 속도 또는 지역 현장 잠재력 자극에 의​​존하는 변화는 관찰 할 수있다. 참고 : 모든 AOB 뉴런 (50 밀리미터의 KCl을 포함하는 링거액 등의) 발사 속도의 증가에 따라 모든 자극에 응답합니다. 발사 속도의 자극에 의​​존 감소는 또한 기능적인 연결 및 성공적인 절개를 나타냅니다. 두 개 이상의 뉴런가 발생하는 경우에 그VNO의 자극에 응답하지 않는, 또는 어떤 활동 전위가 여러 전극 침투 후 관찰되지 않은 경우,이 실패 절개를 제안합니다. 이 경우, 새로운 절개는 3 단계에서 시작될 수있다. </li></ol>

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이 프로토콜에서 설명하는 VNO-AOB 생체 준비는 생체 내 5-7 급성 라이브 슬라이스 AOB 기능의 17 실험에서 마취 할 수있는 유용한 대안이다. 또한 전기 생리학 및 광학 레코딩을위한 회로 소자를 노출 급성 AOB 슬라이스 실험과는 달리,이 혼합물은 모든 감각 구 심성과 내 AOB의 연결을 유지합니다. 이 또한 생체 방법에 마취라고 할 수 있지만, 마취제의 존재?...

포유류의 뇌에있는 감각 처리는 일반적으로 감각 입력에서 특정 기능을 추출하고, 각각의 다중 상호 연결의 연결 회로에 걸쳐있다. 감각 경로에서 초기 정보 처리는 정상적인 인식과 행동에 매우 중요합니다. 액세서리 후각 시스템 (AOS)에서 액세서리 후각 망울 (AOB)은 호르몬 균형, 2, 침략 3, 4 각성을 지시 다운 스트림 구조로 감각 주변을 연결하는 주요 신경 회로이다. 이와 같이,이 회로 내의 정보 처리 강하게 동물 행동의 변화에​​ 연계된다. 액세서리 후각 망울이 조밀 한 아래의 주요 후각 망울 (MOB)의 등 / 꼬리 / 후방 측면에서 생쥐와 쥐에 있으며 rhinal 부비동 혈관이. AOB는 vomeronasal 기관 (VNO)에있는 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN)의 축삭에서 구 심성 신경 지배를받는, 스말그냥 부드러운 구개 위의 앞쪽 주둥이에있는 L 블라인드 종단 관. 이 축삭은 비강의 내측 경계에서 중격 조직의 섬세한 시트를 통과. 몇몇 연구는 마취 된 쥐 5-7 자유로이 탐험 동물 8을 사용하여 생체 내에서 (예 : 마우스 소변 등) AOS 냄새의 근원에 AOB 신경 반응을 탐색 할있다. 영웅은 () tracheotomies 비 휘발성 냄새를 소개하는 깊은 마취를 보장하고 액체 자극 5-7의 구토물이기도를 막는 것을 방지, 교감 자궁 경부 신경절 6 vomeronasal 기관 5,7 직접 삽관의 (b)의 자극에 참여 생체 내 연구에서 마취 및 (c) 전두엽 절제 유무에 관계없이 craniotomies는 AOB (6)에 전극의 발전을 허용합니다. 깨어 / 연구에게 마이크로 드라이브 8-10 참여 외과 주입을 행동. 결론적으로,이 실험 패러다임은 강력하지만 매우 어려운 종종 마취를 필요로합니다. 11-15로 신체 (생체) 외부 살아 감각 구조 및 다운 스트림 신경 회로를 유지하려고했습니다. VNO와 AOB 간의 연결은 동측 남아 있고, 정중선 중격 티슈는 단일 반구 산소화 superfusate에 노출 될 수 있기 때문에, 우리는 자신의 기능적 연결성을 유지하면서, 이러한 구조를 분리하는 이러한 단일 반구 생체 외 접근법을 개발하기 위해 노력하기 때문에. 우리는 최근에 이러한 목표 16 달성에 성공했다. (중간 선 소프트 중격 조직을 따라) 축삭과 AOB 모두 산소 인공 뇌척수를 (superfused에 액세스 할 수있는 600 μm의 기능 &lt;비교적 얕은 때문에 6 시간 -이 준비 VNO과 AOB 살아 기능적 최소 4에 대한 연결을 모두 유지 ACSF). 이 VNO-AOB 생체 준비 얇은 캐 뉼러를 통해 VNO에 제어 자극의 도입을 허용하고,대상 전극 배치 및 / 또는 라이브 형광 현미경의 작은 AOB에 직접 시각적으로 액세스 할 수 있습니다. 하나는 마취제의 부재에서 이러한 회로를 공부하기를 원하는 경우,이 메소드는 장점이있다. 이 방법은 원심 연결을 끊고이므로, 잘 AOB 기능의 원심 변조에 문의에 적합하지 않다. VNO-AOB 생체 준비는 배우기 어렵지만, 한 번 달성이 강력한 감각 회로 회로 조직, 정보 처리 및 신경 가소성을 조사 할 때 신뢰할 수있는 플랫폼을 생산하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Straight Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors-Straight</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors-Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>#3 Scalpel Handle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>#11 Scalpel Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>Straight Carbon Steel Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-21</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Chamber</td><td>Custom&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>See &lt;strong&gt;Figure 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm</td><td>Custom&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Silicon Vacuum grease</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps, Student</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps, Biologie Tip</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>#5 Forceps, Student</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; Male Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45505-00</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; Tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td></td></tr><tr><td>Two ton epoxy</td><td>Grainger</td><td>5E157</td><td></td></tr><tr><td>ValveBank Pressurized Perfusion Kit</td><td>AutoMate Scientific</td><td>09-16</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink digital/manual controller</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; dihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;myo&lt;/em&gt;-inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Na-ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>various</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo preparations of the intact vomeronasal organ and accessory olfactory bulb

마우스 액세서리 후각 시스템 (AOS)는 비 휘발성 사회 냄새, 페로몬, 및 kairomones을 검출하는 전문적인 감각의 통로입니다. AOS 경로의 첫 번째 신경 회로는, 액세서리 후각 망울 (AOB)가, 같은 영토 침략과 짝짓기 같은 섹스의 전형적인 행동을 수립에 중요한 역할을했다. 이 작은 (&lt;1mm 3) 회로는 동종의 분비물과 배설물에 화학 감각 신호의 성별, 긴장, 스트레스 등의 독특한 행동 상태를 구별 할 수있는 능력을 가지고 있습니다. 이 시스템의 컴팩트 한 조직이 동시에 회로의 많은 부분에서 기록에 대한 독특한 기회를 제공하는 동안, AOB에있는 감각 처리의 조사는 크게 인해 뇌의 실험적으로 불리한 위치에 도전 남아있다. 여기, 우리는 연결 떠나, 전방 마우스 두개골의 단일 반구 안에 그대로 AOB를 제거하는 다단계 해부을 보여모두 주변 vomeronasal 감각 뉴런 (하여 VSN) 지역 신경 회로 손상에 이온. 절차는 마취제의 부재 및 전기 생리 AOB 회로 소자로부터 광 기록을 용이하게 외관 검사를 지시하는 AOB 표면을 노출. AOB 다운 스트림 활동을 기록하는 동안하여 VSN을 수용하는 vomeronasal 기관 (VNO)로가는 캐뉼라를 삽입하면, 하나는 직접 사회 냄새와 페로몬에 주위를 노출 할 수 있습니다. 이 절차는 행동의 변화에​​ 페로몬에 노출을 연결하는 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 AOS 정보 처리에 제어 문의 할 수 있습니다.

이러한 준비와 성공을 달성하는 것은 광범위한 연습이 필요하고, 실패 할 수있는 몇 가지 단계가 있습니다. 하나는 성공을 달성하기 전에 많은 시도를 필요로 할 것으로 예상해야한다. 사용자 지정 해부 실이 프로토콜의 성공적인 완료를 위해 필요하며, 이전에 절개의 이후 단계를 시작하기 얻어야한다. 도 1에 제시된 챔버 설계는이 목적을 위해 충분하며, 최소의 가공 요구에 비교적...

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Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

10.7K 조회수.  UT Southwestern Medical Center.  마우스 액세서리 후각 전구 (AOB)는 감각 코딩의 맥락에서 공부하기 어렵다. 여기, 우리는 AOB 신경 마우스 페로몬과 kairomones의 정보 처리에 대한 연구를 촉진, 자신의 주변 입력에 기능적으로 연결되어있는 한 생체 준비를 생산하는 절개를 보여줍니다. 

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Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Vomeronasal 상피의 Multielectrode 배열 레코딩

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

연구

신경과학

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

이미징 페로몬은 마우스 Vomeronasal 급성 조직 슬라이스 준비에 감지

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

Imaging Odor-Evoked Activities in the Mouse Olfactory Bulb using Optical Reflectance and Autofluorescence Signals

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. Functional optical imaging techniques are advantageous to visualize the activation of these modules in sensory cortices with high spatial resolution. In this context, endogenous optical signals that arise from molecular mechanisms linked to neuroenergetics are valuable sources of contrast to record spatial maps of sensory stimuli over wide fields in the rodent brain.
Here, we present two techniques based on changes of endogenous optical properties of the brain tissue during activation. First the intrinsic optical signals (IOS) are produced by a local alteration in red light reflectance due to: (i) absorption by changes in blood oxygenation level and blood volume (ii) photon scattering. The use of in vivo IOS to record spatial maps started in the mid 1980's with the observation of optical maps of whisker barrels in the rat and the orientation columns in the cat visual cortex1. IOS imaging of the surface of the rodent main olfactory bulb (OB) in response to odorants was later demonstrated by Larry Katz's group2. The second approach relies on flavoprotein autofluorescence signals (FAS) due to changes in the redox state of these mitochondrial metabolic intermediates. More precisely, the technique is based on the green fluorescence due to oxidized state of flavoproteins when the tissue is excited with blue light. Although such signals were probably among the first fluorescent molecules recorded for the study of brain activity by the pioneer studies of Britton Chances and colleagues3, it was not until recently that they have been used for mapping of brain activation in vivo. FAS imaging was first applied to the somatosensory cortex in rodents in response to hindpaw stimulation by Katsuei Shibuki's group4.
The olfactory system is of central importance for the survival of the vast majority of living species because it allows efficient detection and identification of chemical substances in the environment (food, predators). The OB is the first relay of olfactory information processing in the brain. It receives afferent projections from the olfactory primary sensory neurons that detect volatile odorant molecules. Each sensory neuron expresses only one type of odorant receptor and neurons carrying the same type of receptor send their nerve processes to the same well-defined microregions of &tilde;100&mu;m3 constituted of discrete neuropil, the olfactory glomerulus (Fig. 1). In the last decade, IOS imaging has fostered the functional exploration of the OB5, 6, 7 which has become one of the most studied sensory structures. The mapping of OB activity with FAS imaging has not been performed yet.
Here, we show the successive steps of an efficient protocol for IOS and FAS imaging to map odor-evoked activities in the mouse OB.

This article presents the protocols of intrinsic optical signals and flavoproteins autofluorescence signals imaging to map odor-evoked activities at the surface of the olfactory bulb in mice.

광 반사율과 Autofluorescence 신호를 사용하여 마우스 후각 망울에서 이미징 냄새 Evoked 활동

In the brain, sensory stimulation activates distributed populations of neurons among functional modules which participate to the coding of the stimulus. ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

영상의 연결 응답 Vomeronasal 조직의 슬라이스 준비에 유전적으로 인코딩된 칼슘 센서를 표현

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

An Effective Manual Deboning Method To Prepare Intact Mouse Nasal Tissue With Preserved Anatomical Organization

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures. The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, respiratory, and squamous epithelia which differ markedly in anatomical locations, morphology, and functions. In adult mice, the nose is covered with various skull bones, limiting experimental access to internal structures, especially those in the posterior such as the main olfactory epithelium (MOE). Here we describe an effective method for obtaining almost the entire and intact nasal tissues with preserved anatomical organization. Using surgical tools under a dissecting microscope, we sequentially remove the skull bones surrounding the nasal tissue. This procedure can be performed on both paraformaldehyde-fixed and freshly dissected, skinned mouse heads. The entire deboning procedure takes about 20-30 min, which is significantly shorter than the experimental time required for conventional chemical-based decalcification. In addition, we present an easy method to remove air bubbles trapped between turbinates, which is critical for obtaining intact thin horizontal or coronal or sagittal sections from the nasal tissue preparation. Nasal tissue prepared using our method can be used for whole mount observation of the entire epithelia, as well as morphological, immunocytochemical, RNA in situ hybridization, and physiological studies, especially in studies where region-specific examination and comparison are of interest.

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

The mammalian nose is a multi-functional organ with intricate internal structures.  The nasal cavity is lined with various epithelia such as olfactory, ...

생물학

Establishing a Whole-Cell Patch Clamp for Electrophysiological Recording from Vomeronasal Sensory Neurons

Source: Ackels, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54517">In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ.</a> J. Vis. Exp. (2016)
The protocol video describes establishing a whole-cell patch clamp for electrophysiological recording from the sensory neurons of the vomeronasal organ (VNO) in mice. A coronal VNO slice with fluorescently labeled sensory neurons is placed in a recording setup. A labeled neuron is patched with a recording pipette in a whole-cell configuration for electrophysiological recording in response to chemical stimuli.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Solution Preparation

	Prepare ...