이 연구는 NIH DC052256 DC006015하고, 그리고 QG 및 BS에 T32 - DC008072에 NSF 0,324,769에 의해 지원됩니다.

1. 준비 이 절차는 biosafety 레벨 2 따라서 다음과 같은 모든 준비는 microinjection 절차가 수행되는 생물 학적 후드에 만들어집니다. <ol><li> 준비하고 앞서 열을 가하다 37 ° C 물침 : 물로 플라스틱 저장 가방에 담아 - 비운 가열 블록 인큐베이터에 도장 및 설정합니다. 이 생쥐는 다음과 같은 주사를 복구할 수 있습니다. </li><li> 이 절차에서 모든 폐기물의 침수에 적합한 볼륨 10 % 표백제와 생물 학적 폐기물 컨테이너를 채웁니다. </li><li> 70 % 에탄올의 작은 열 접시와 생물 학적 안전 캐비닛에 소독 ddH2O 장소와 두 번째 접시를 준비합니다. </li><li> 플런저 모든 방법을 꺼내와 70 %의 에탄올과 함께 신체와 바늘을 아래로 분사하여 33 게이지 바늘로 5μL 용량 해밀턴 주사기를 소독. 반복적으로 요리에서 에탄올을 대기음 최소한 5 번 그 모든 방법을 꺼냅니다. </li><li> aspirating 및 꺼내기 멸균 물을 적어도 5 배 주사기 카트리지를 씻어. 문화 후드에 안전하게 따로 주사기를 삽입하고 건조 수 있습니다. </li><li> 얼음 ° C의 냉동고 저장 및 장소 융해 수 있도록 -80에서 바이러스 주식을 제거합니다. Microinjection은 10 9 전염성 단위 / ML의 titre에서 마우스마다 바이러스 주식 2μL 필요합니다. Lentiviruses는 기존 프로토콜 (로이스 외., 2002)에 따르면 실험실에서 상용 소스에서 얻은 또는 생산 수 있습니다. </li><li> 후드의 표면 위에서 제기된 영역을 제공하는 사출 단계를 준비​​ - Kimwipe의 시트로 덮여 10cm 문화 요리를 사용할 수 있습니다. </li><li> 사출 역 근처 알코올 잎사귀 마련. </li></ol> 2. 후각 상피에 lentiviral 입자의 Microinjection 이 방법에서 수행한 모든 동물 절차 IACUC 승인 지침에 따라 수행됩니다. 뮤스 musculus 긴장 C57BL/6J 모든 실험에 사용되는 동물 모델이 여기에 증명합니다. <ol><li> 밖으로 새장의 새끼 마우스 (P0 - P3)을 복용하고 5 분 얼음에 절단 - 열린 장갑에 강아지를 넣어 저체온증으로 마우스 새끼를 마취시키다. </li><li> 강아지가 살균 해밀턴 주사기로 바이러스 재고 완전히 anesthetized, 기음 2μL 수 기다리는 동안. </li><li> 사출 무대 위에 새끼 마우스를 놓습니다. 부드럽게 목의 상단쪽으로 귀의 머리 위로 떨어져 피부를 당기십시오. 이것은 비강을 통해 가르쳐 피부 표면을 제공해야하고 주사를 쉽게합니다. </li><li> 후각 상피를 도달하는 피부 표면 아래 3mm에 대한 비강의 정상을 통해 바늘을 삽입합니다. 왼쪽과 오른쪽 양쪽마다 두 사이트 (마우스마다 총 네 주사 필요한 바이러스 = 2μL)을 선택, 촬영마다 바이러스 솔루션의 0.5μL Microinject. 사출 사이트는 서로 떨어져 비틀 거렸다해야합니다. 적절한 사출 사이트 타겟팅은 후각 망울의 개요에 대한 지느러미 두개골 표면을 검색합니다. 이 줄은 반 투명한 피부와 두개골을 통해 출생시 거의 표시됩니다. 측면마다이 주사를하려면 중간 축에 하나의 전구 개요 단 주동이의 한 주사를 목표로하고 있습니다. 전구 개요에 가로 두 번째 삽입을 만들고, 아직 medially 있도​​록 전구 아래 ventrally있는 후각 상피에 도달할 수있는 주사 각도 있는지 확인하십시오. 후각 망울을 관통하지 마십시오! </li><li> 잔여 바이러스 솔루션이나 Kimwipe를 사용하여 주사 사이트 또는 코에 구멍에서 탈출 수도 혈액을 건조 얼룩. 즉시 희석 액체 표백제 생물 학적 컨테이너에 Kimwipes 처분. </li><li> 물침 인큐베이터에 주입 마우스를 놓습니다. </li><li> 반복은 마우스마다 바이러스 주식 2μL에 대해 필요합니다 기억, 주입하는 모든 마우스에 대해 1-4 단계를 반복합니다. </li><li> 원래 둥지 케이지에게 돌아가기 전에 쥐가 30 분 물침 인큐베이터에서 복구하자. </li><li> 액체 표백제 생물 학적 처리에 microinjection 무대, 살균 잎사귀와 별도의 청소 종이 제품의 폐기. </li><li> 으로 준비 단계에서 수행 반복 열망과 에탄올의 배출 후 물로 해밀턴 주사기를 청소합니다. 주사기가 건조 수 있습니다. </li><li> 최대 전달 효율을위한 4 시간 만에 다시이 절차를 반복합니다. 감염 OSNs 사흘 같은 몇 가지로 세포의 길이에 걸쳐 시각 수 있습니다. </li></ol> 3. 부동 후각 망울 섹션의 Immunohistochemistry <ol><li> 원하는 시점에 주입 마우스를 희생과 재관류는 4 % paraformaldehyde로 조직을 수정. OB를 해부하다. 하룻밤 숙박 후 paraformaldehyde의 PBS에서 30 % 자당을 품어. 드라이 아이스에서 OCT의 포함 매체에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 코로나 OB 섹션은 그라 이오 스탯을 사용하여 두께 60μm에서 얻을 수 있습니다. 5mL 1X PBS (산도 7.4)와 10cm 문화 요리에 전구 섹션을 지나간다. 제는 D에 OCT를 허용하도록 PBS에 떠 보관해야합니다issolve. 50mL 원뿔 유리병에 떠있는 섹션과 PBS를 전송합니다. </li><li> 섹션 유리병의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 어떤 부분을 빨아하지 않고 PBS에서 진공. 20mL PBS로 조직 섹션 린스. 정착하고 진공 청소기로 청소하는 단계를 반복합니다. 10mL PBS과 immunostaining을위한 15mL 원뿔 유리병로 전송 부동 섹션 Resuspend 조직. 일단 조직 섹션 조직을 방해하지 않고, PBS 뜨는에서 진공을 해결했습니다. 와 Resuspend 섹션 0.3 % 트리톤 1X PBS, 세제는 세포 세포막을 구멍 수 있도록 산도 7.4 (PBS - TX)에 X - 100. 실온에서 10 분 알을 품다. 두 번 PBS - TX로 뜨는 반복 보육에서 진공. </li><li> 상온에서 두 시간 동안 차단 솔루션의 10mL (PBS - TX의 5 % 목마 ​​혈청)에 조직 섹션을 품어. </li><li> 십오분 상온에서 각각 PBS - TX로 적어도 두 번 차단 솔루션을 씻어. </li><li> PBS - TX에 프라이 머리 항체 솔루션의 2mL를 준비합니다. 시약이 실험에 사용된 항체에 대한 장비 섹션을 참조하십시오. </li><li> 기본 항체 솔루션 초 PBS - TX 차단 세차를 교체하십시오. ° C 24-48시간에 대한 60μm 부동 섹션으로 철저한 침투력을 보장하기 위해 4 천천히 락을 플랫폼 (~ 30rpm)에 품어. </li><li> 부화 후, 기본 항체 솔루션은 4 조심스럽게 피펫을 사용하여 검색하고 저장할 수 있습니다 ° 얼룩 강도의 큰 손실없이 2 주 이내에 두 번 더 최대 재사용을위한 C. </li><li> 이십분 부드러운 회전 (~ 30rpm)로 실온에서 각 섹션에게 PBS - TX에 세 번 씻으십시오. </li><li> PBS - TX에서 이차 항체 희석의 2mL를 준비합니다. 마지막 세척을 진공 및 조직 섹션 차 항체 솔루션을 추가합니다. 형광단의 photobleaching가 발생할 수 있습니다 빛을 차단하기 위해 알루미늄 호일에있는 얼룩의 약병의 바깥쪽을 바꿈. 장소는 4 ° C 하룻밤에 천천히 락을 플랫폼과 부화에 병을 감쌌다. </li><li> 거리 청소에 의해 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS - TX로 한 섹션을 씻으십시오. 이십분 상온에서 각각 PBS와 함께 두 개의 추가 회 (산도 7.4)을 씻어. Fluoromount G.를 사용하여 유리 슬라이드에 스테인드 조직 섹션 마운트 </li><li> 형광 현미경으로 적극적으로 감염된 OSN의 axons 및 축삭의 테르 미니에 대한 스테인드 섹션을 통해 화면. </li><li> 표시 OSN 축삭 터미널 아버의 3 차원보기를 구성하려면 공촛점 현미경을 사용하여 대상 OB 조직 슬라이스 (Z 축 따라)의 60μm 깊이를 통해 광학 섹션 일련의합니다. </li><li> Z - 섹션 영상이 스택은 이후 전체 터미널 아버 세부 사항을 포함하여 단일 레이블 OSN 축삭의 360 ° 회전 관점을 재구성 함께 예상하실 수 있습니다. 어떤 하나의 회전 각도를 캡처 및 2D 형식으로 프레 젠 테이션을위한 이미지 파일 (예 : JPG, TIFF)로 내보낼 수 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 방법이 여기에 설명된로, 우리는 생체내에 lentivirus의 후각 감각 뉴런을 transduce 수 있습니다. 우리는 따라서 GFP와 mCherry 형광 기자까지 시각 감염 OSNs뿐만과 immunocytochemistry를 통해 myc - 태그 융합 단백질 있습니다. 이 기술은 감염 OSNs의 풍부를 제공합니다. 그래도, 형질 도입 따라서 단일 세포 형태의 분석을 위해 수 있도록 개별적으로 표시된 OSNs를 제공하기 위해 산발적으로 충분히 발생합니다. Axons 및 축삭 터미널은 공촛점 현미경 (그림 1)에 의해 자신의 기본 환경 가운데 OB 조직 섹션 내에 몇 군데 있습니다. 전체 OSN 축삭 터미널 아버은 일반적으로 40 - 50μm 광 섹션 매료 수 있습니다. 감염 OSN의 축삭 터미널 높은 배율은 사구체 계층에서 axonal 아버 형태의 상세 분석을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> 그림 1. 하나의 후각 감각 뉴런 축삭과 터미널 아버의 탄도.) 후각 신경 층 (ONL)를 보여주는 P7 마우스의 후각 망울의 코로나 섹션 OMP (적색)에 대한 immunostained과 사구체 층 (GL)는 OMP 모두 immunostained 그리고 Vglut2 (회색). GFP (녹색)를 표현하는 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭은 ONL 내의 여행과 사구체 구조로 침투. B) glomerulus 내에 축삭 터미널 아버 형태 명확하게 GFP 표현으로 강조했다. 회색 Vglut2 공동 얼룩은 GFP 양성 축삭은 터미널 에이버을 elaborates하는 시간 전체 glomular 지역을 조명. C) Lentiviral 감염 OSNs는 OE에서 GFP (녹색)를 표현. 후각 상피의 cytostructure는 DAPI의 얼룩 (파란색)과 함께 표시됩니다. GFP 표현은 OE에서 OSN 세포 기관과 세포 프로세스의 시각화 수 있습니다. D) Rap1GAP2 표정으로 OSN의 축삭과 터미널 형태 노크 다운 shRNA로. 아래 마우스 U6업자와 GFP 이하 Rap1GAP2 shRNA와 듀얼 표현 카세트를 들고 LentivirusesCMV 프로 모터는 OE에 적용되었습니다. GFP 전용 제어의 비교 감염 후각 축삭 터미널보다 단순 터미널 아버을 전시. 바 = 20μm.

<ol>
	<li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor.">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li><li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb:+a+long-term+study.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li><li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors.">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li><li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo.">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li></ol>

이 프로토콜은 생물 안전 수준이 호환됩니다. 모든 적절한 작업 공간, 개인 보호 및 바이러스성 폐기물 억제 대책이 따라 설립되었습니다. 모든 동물의 절차 IACUC 지침에 따라 수행되었다.

OSN의 게놈의 DNA에 유전자 구조의 영구 양도에 lentivirus 결과의 Microinjection. 이러한 접근 방식은 우리가 overexpression 또는 shRNA의 중재 노크 다운을 통해 후보 유전자의 단기 또는 장기 조작을 수행할 수 있습니다. 또한, 우리는 찬란 odorant 수용체 집단의 공동 현지화을 관찰하기 위해 기존의 유전자 변형 마우스 라인에서 단일 OSNs 레이블을하실 수 있습니다. Microinjection은 OSNs의 lentiviral 도입이 필요합?...

Microinjection : 신생아 생쥐는 33 게이지 바늘 (해밀턴 # 7762-06)가 장착되어 5μL 해밀턴 주사기 (해밀턴 # 7647-01)를 사용하여 microinjected되었습니다. Immunocytochemistry의 시약 : 차 항체 : 토끼 polyclonal 항체 GFP (분자 프로브 # A - 6455), OMP에 대한 polyclonal 항체 닭 (사용자 정의) (첸 외, 2005.) VGlut2에 대한 기니피그 polyclonal 항체 (Millipore # AB2251). 차 항체 : Cy2 - 복합 당나귀 안티 - 토끼 (잭슨 Immunolab # 711-225-152), Cy3 - 복합 당나귀 안티 - 닭고기 (잭슨 Immunolab # 703-165-155)와 Cy5 - 복합 염소 안티 기니피그 (잭슨 Immunolab # 106-175-008). 섹션이 50ng/mL DAPI 얼룩 염색질 솔루션 Fluoromount G (남부 바이오 # 0010-01)와 유리 슬라이드에 장착했다. 공촛점 이미징 : Z - 스택 이미지는 올림푸스 Flouview FV1000 공촛점 현미경과 올림푸스 FV10 - ASW 2.01 공촛점 수집 및 분석 소프트웨어를 사용하여 3 차원 투영으로 수집 및 처리 이미지를 사용하여 촬영되었다.

lentivirus-mediated genetic manipulation and visualization of olfactory sensory neurons in vivo

정확한 후각 회로의 개발은 후각 망울 (OB)에서 시냅스 대상으로 후각 감각 뉴런 (OSN) axons의 정확한 예측에 의존하고 있습니다. OSN 축삭의 성장과 대상의 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 조작 유전자 발현 및 단일 OSN의 axons과 터미널 아버 형태의 시각 이후는 지금까지 도전했습니다. 지정된 시간 프레임 내에 단일 세포 수준에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 우리는 생체내에 OSNs의 유전자 발현을 조작하는 lentiviral 기반 기술을 개발했습니다. Lentiviral 입자가 후각 상피 (OE)에 microinjection하여 OSNs로 전달됩니다. 표현 카세트는 다음 영구적으로 transduced OSNs의 게놈에 통합됩니다. 그린 형광 단백질 표현이 감염된 OSNs를 식별하고 축삭 터미널 아버 포함한 전체 형태를 설명합니다. microinjection 및 기자 탐지 사이의 짧은 처리 시간으로 인해, 유전자 기능 연구 개발의 아주 좁은 기간 내에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법을 통해, 우리는 몇 셋처럼 일 이내에 GFP 발현을 감지하고 한 셋처럼 개월 주사를 다음과. 우리는 노크를 다운 lentiviral microinjection하여 중재를 통해 표현과 shRNA를 모두 달성했습니다. 이 방법은 생체내에있는 단일 세포 수준에서 OSN 세포 기관과 axons 자세한 morphologies을 제공하므로 후각 개발하는 동안 후보 유전자 기능의 특성을 허용합니다.

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Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시<em&gt; 생체내에</em&gt;.

강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

15.5K 조회수.  University of California, Davis. 우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시 생체내에.

비디오: Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

연구

신경과학

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific regions of developing embryos, including those of C. elegans, chick, Xenopus, zebrafish, and mouse 1. In zebrafish, in vivo electroporation has been shown to have excellent spatial and temporal resolution for the delivery of these reagents 2-7. The temporal resolution of this method is important because it allows for incorporation of these reagents at specific stages in development. Furthermore, because expression from electroporated vectors occurs within 6 hours 7, this method is more timely than transgenic approaches. While the spatial resolution can be extremely precise when targeting a single cell 2, 6, it is often preferable to incorporate reagents into a specific cell population within a tissue or structure. When targeting multiple cells, in vivo electroporation is efficient for delivery to a specific region of the embryo; however, particularly within the developing nervous system, it is difficult to target specific cell types solely through spatially discrete electroporation. Alternatively, enhancer trap transgenic lines offer excellent cell type-specific expression of transgenes 8. Here we describe an approach that combines transgenic Gal4-based enhancer trap lines 8 with spatially discrete in vivo electroporation 7, 9 to specifically target developing neurons of the zebrafish olfactory bulb. The Et(zic4:Gal4TA4,UAS:mCherry)hzm5 (formerly GA80_9) enhancer trap line previously described 8, displays targeted transgenic expression of mCherry mediated by a zebrafish optimized Gal4 (KalTA4) transcriptional activator in multiple regions of the developing brain including hindbrain, cerebellum, forebrain, and the olfactory bulb. To target GFP expression specifically to the olfactory bulb, a plasmid with the coding sequence of GFP under control of multiple Gal4 binding sites (UAS) was electroporated into the anterior end of the forebrain at 24-28 hours post-fertilization (hpf). Although this method incorporates plasmid DNA into multiple regions of the forebrain, GFP expression is only induced in cells transgenically expressing the KalTA4 transcription factor. Thus, by using the GA080_9 transgenic line, this approach led to GFP expression exclusively in the developing olfactory bulb. GFP expressing cells targeted through this approach showed typical axonal projections, as previously described for mitral cells of the olfactory bulb 10. This method could also be used for targeted delivery of other reagents including short-hairpin RNA interference expression plasmids, which would provide a method for spatially and temporally discrete loss-of-function analysis.

Targeting Olfactory Bulb Neurons Using Combined In Vivo Electroporation and Gal4-Based Enhancer Trap Zebrafish Lines

The temporal and spatial resolution of genetic manipulations determines the spectrum of biological phenomena that they can perturb. Here we use temporally and spatially discrete in vivo electroporation, combined with transgenic lines of zebrafish, to induce expression of a GFP transgene specifically in neurons of the developing olfactory bulb.

결합을 사용하여 타겟팅 후각 망울의 뉴런 VIVO에서 Electroporation 및 Gal4 기반 향상제 트랩 Zebrafish 라인

In vivo electroporation is a powerful method for delivering DNA expression plasmids, RNAi reagents, and morpholino anti-sense oligonucleotides to specific ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

강한 감각 뉴런의 속눈썹에 갇힌 화합물의 플래시 광분해

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

만성에 대한 성인 태어나 강한 뉴런의 선택 바이러스성 전달 생체내에 Optogenetic의 자극

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

에있는 후각 수용체 뉴런의 전체 마운트 Immunolabeling<em&gt; 초파리</em&gt; 안테나

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

본래 Vomeronasal 기관 및 액세서리 후각 망울의 생체 준비

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.