We gratefully acknowledge funding from the Wellcome Trust Affordable Healthcare for India and an EPSRC Landscape Fellowship for Ilida Ortega as well as contributions from The Electrospinning Company Ltd.

윤리 진술 : 본 연구에 사용 된 눈은 동물 연구에 대한 개방성의 선언에 따라 사용 하였다 : Micropockets 장착 PLGA 생분해 성 멤브레인의 1 제작 <ol><li> 링 발판은 마이크로 광과 전기 방사 기술 (31)의 조합에 의해 만들어졌습니다. 본질적으로, 프로세스는 마이크로 광 및 (ⅱ) 기본 PEGDA 구조의 재생을위한 템플릿 상에 전기 방사 (이 경우 미세 가공 된 링)에 의하여 PEGDA 템플릿 2 부 (I)의 생성에 요약 될 수있다. 이러한 두 단계 (도 1 및 2)보다 상세히 설명된다. <ol><li> 마이크로 광에 의해 PEGDA 템플릿 제작 (microSL) <ol><li> 제 층 (L1)의 구조 및 기본 말굽 morphologi 6 micropockets 제시 번째 층 (L2)로 되,이 레이어 모델을 사용하여 고리를 제작300 ~ 500 μm의에서 크기의 범위에서 말이지. PEGDA 반지의 제작은 최근이 그룹 (22)에 의해 설명되었다. <ol><li> 적당한 그리기 프로그램을 사용하여 1.2 cm 검은 색 원을 그려 L1을 만듭니다. </li><li> 같은 방법으로 L2를 작성하지만, 8 흰색 0.5 × 0.35 mm의 말굽 모양의 구조를 포함한다. 검은 색 원이 구조 내에서 작은 흰색 말굽 모양을 배포합니다. </li><li> JPEG 형식으로 저장 L1 및 L2. </li></ol></li><li> 어두운 유리 병에서 20 분 동안 자기 교반기에, 캄 포르 퀴논, 광개시제 w / w 1 % 폴리에틸렌 글리콜 디 아크릴 레이트 (PEGDA 미네소타 = 250g / 몰)을 혼합한다. </li><li> 셋업 망원 렌즈 배열을 사용하여 마이크로 광의 레이저 빔을 확장 한 다음 컴퓨터 프로그램 디지털 multimirror 장치 (UV 사용 DMD 스타터 키트)에이를 전망이다. 주 : DMD는 초점 길이 10cm의 렌즈를 통하여 튜브 거울 상 (이 경우에는 환) 이미지를 반영한​​다. 화상이어서 실버 COA로 지향테드는 광경 화성 폴리머 (PEGDA)를 포함하는 유리 병에 반영. </li><li> 조정하고 신중하게 설정 한 마이크로 광의 광학을 청소합니다. </li><li> 12 - 웰 조직 배양 플레이트로 잘 PEGDA 혼합물의 300 μL를 넣어. 우물이 경화 후 구조의 쉬운 제거를위한 테프론 또는 다른 비 스틱 재료로 미리 코팅되어 있는지 확인합니다. </li><li> 블루 레이저에 스위치 (MBL-III 473 nm의 150 MW) ALP3 - 기본 소프트웨어로 및 L1 업로드 이전에 PC에 설치되어 있어야합니다. 60 초 동안 제 1 층에 조사. NOTE : ALP3 염기성가 PC와 디지털 마이크로 미러 장치들 사이의 링크를 제공하는 USB 인터페이스이다. </li><li> , PEGDA의 250 μl를 더 잘 담기 상기 한 바와 60 초 동안 L2를 조사로 L2를 업로드 할 수 있습니다. </li><li> 경화 폴리머를 제거하고 이소프로판올 O / N과 함께 반지를 씻는다. </li></ol></li><li> 생분해 성 PLGA의 제조는 전기 방사를 사용하여 막 참고 : PEGDA 반지를 템플릿으로 사용되었다들하는 동안 PLGA는 이러한 템플릿을 통해 회전 될 때 PLGA가 기본 지형을 재생으로 전기 방사 하였다. 스피닝 후, PLGA 중합체 시트는 컬렉터로부터 박리 하였다. 최종 PLGA 막은 금속 집 전체에 부착 남았다 PEGDA 고리를 포함하지 않았다. <ol><li> 정적 전기 방사 수집기를 만들기위한 전기 도금 알루미늄 시트에 PEGDA 링 (12cm X 20cm)를 배포합니다. </li><li> 도전성 카본 테이프를 사용하여 고리를 연결합니다. 참고 : 한 번 전기 방사를위한 템플릿으로 재사용 할 수 형성이 반지. </li><li> 회전의 고분자 용액을 준비합니다. 농도는 w / w 20 %의 디클로로 메탄 (DCM)에서 : PLGA (글리콜 (48 몰 %), 44kg / 몰 50:50 DL-락 티드 (52 몰 %))에 녹인다. </li><li> 저어 O / N 사용하기 전에. </li><li> 주사기 펌프에 찾는 4 인슐린 주사기 (종단, 0.8 cm의 내경을 무딘 바늘). 주 : 네 개의 주사기가 하나의 주사기로 작업보다 더 빠른 전기 방사를 확보. </li><li> 각 주사기에 PLGA 용액 2.5 ㎖에 넣습니다. </li><li> Electrospin 사용하여 30 μL / 분의 유량과 12에서 15 kV의 전압에 이르기까지. 바늘과 15cm의 콜렉터 사이의 거리를 둡니다. </li><li> 1 시간 30 분 동안 Electrospin하고 마침내 신중 PEGDA 링지지 콜렉터로부터 PLGA의 전기 방사 시트를 벗겨. </li><li> 원형 펀치 구멍을 사용하고 중앙에 고리 구조를 떠나는 22mm 직경의 원형으로 전기 방사 발판을 잘라. </li></ol></li></ol></li></ol> PLGA 미세 멤브레인의 2 장기 보관 참고 : PLGA 반지 제작 및 공인 된 외부 회사에 의해 멸균 하였다 샘플은 25 ~ 40 kGy의의 외부 용량 범위에서 조사 하였다. <ol><li> 작은 용기에 멤브레인 (플라스틱 페트리 접시)를 마운트하고 의료용 가방 안에 넣습니다. </li><li> 건조제를위한 작은 필터 백을 만들 필터 용지를 사용하십시오. TO, 잡화를 작성 여과지 (직경 125mm)를 반으로 접어 얻어진 반원 컷; 다음 테이프를 사용하여 함께 끝을 밀봉하십시오. <ol><li> 각각 실리카 오렌지, 코발트 (II), 염화 구리 (II) 황산 1g으로 3 필터 종이 가방을 채 웁니다. </li><li> 전기 방사 막과 함께 의료용 가방 안에 방습제의 세 가방을 넣습니다. </li></ol></li><li> 저장 기간 중에 수분의 축적을 검출하기 위해 가방 시판 여섯 자리 습도 표시 카드를 추가한다. </li><li> 진공 청소기 가방을 밀봉하는 진공 열 밀봉 장치를 사용합니다. </li><li> γ-조사를 위해 외부 회사에 링 세포막을 보냅니다. </li><li> 상점 5 % CO 2를 포함하는 배양기 내에서 습한 환경에서 +37 ° C에서 -20 ° C에서 넓은 범위의 온도에서 PLGA 막을 γ는 조사 된. </li><li> 포스트 스토리지, 습도 수준이 30 % 아래에 있는지 확인하기 위해 습도 표시 등을 확인합니다. </li><li> U자체 주사 전자 현미경 (SEM)은 섬유의 무결성을 평가한다. </li></ol> 각막 윤부의 Explants의 3 분리 토끼 윤부 이식편은 (토끼가 소비를 위해 사육하는 농장에서 얻은) 토끼 눈에서 고립되었다. <ol><li> 소독액 (3 %)를 사용하여 토끼 눈 소독. </li><li> 각막을 둘러싼 초과 조직을 제거하여 눈을 청소합니다. </li><li> 해부 현미경을 이용하여 각막의 나머지 부분에서 (각막 (투명)과 공막 (흰색) 사이의 얇은 원형 영역으로 식별) 윤부 영역을 분리합니다. </li><li> 해부 현미경 (약 1.5 cm 길이) 세그먼트로 잘라. </li><li> 1 분 동안 1.5 % 소독액에 윤부 세그먼트 소독. </li><li> 메스 블레이드와 작은 조각 (100 ~ 500 μm의)로 각막 윤부 세그먼트를 잘라. </li><li> 배양 배지에서 조직의 작은 조각을 저장 (DMEM + Glutamax : Ham&#39;s의 F12 (1 : 1), 10 % 소 태아 혈청, 1 U / ㎖ 펜icillin, 100 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 2.5 μg / ml의 암포 테리 신, EGF의 10 겨 / ㎖, 37 ° C에서 인슐린의 5 ㎍ / ㎖), 5 % CO 2 사용할 때까지 (이하 60 분). </li></ol> 각막 윤부의 Explants에서 세포의 4 파생물 토끼 윤부 이식편은 진공 포장 및 -20 ° C에서 6 개월 저장했다 두 갓 회전 미세 막과 막에 배치했다. <ol><li> 코트 피브린 접착제 15 μL와 링 지지체 : 피브린를 유포 셀 스크레이퍼를 사용하여 (1 2.5 U / ㎖의 농도에서 인간 혈장에서 18.75 ㎎ / ㎖와 트롬빈 농도에서 인간 혈장으로부터 피브리노겐 1 혼합물) 균등. </li><li> 25 G 바늘과 해부 현미경을 사용하여 PLGA의 micropockets에서 직접 조직 절편을 놓습니다. </li><li> 외식을 분리 피하기 위해 매우 조심스럽게 세포 배양 배지를 추가합니다. <ol><li> 모든 삼일 (미디어 3.7 절에 설명 된 레시피)와 케이 미디어 변경37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 이주를위한 문화 EEP 5 % CO 2. </li></ol></li><li> PBS로 3 세척 한 다음 10 분 동안 3.7 % 버퍼링 포름 알데히드 샘플을 수정합니다. </li><li> (4)의 1 μg / ㎖ &#39;에서 인큐베이션 Counterstain, 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 또는 RT에서 10 분간 요오드화 프로피 듐 (PI). </li><li> PBS로 3 회 세척하고 호일로 덮여 샘플을 저장합니다. </li><li> 콘텐츠 543 nm 내지 800 nm의 (이광자)의 파장에서 형광 현미경을 사용하는 샘플. </li></ol> 5 설정 - 최대 토끼 부상 각막 3D 모델 <ol><li> 깨끗하고 전술 한 바와 같이 토끼 눈 소독. </li><li> 5 분 동안 0.14 % 암모늄 하이드 록 사이드에서 그들을 침지 가토 상처. </li><li> PBS에 눈을 씻어 sclerotome 칼로 상피를 쳤어요. </li><li> 잘라 남아있는 조직을 제거하는 각막 공막 버튼을 격리 할 것. </li><li> 에 각막 실망 상피면을 배치멸균 컵과는 DMEM에서 만든 0.5 % 한천로 입력합니다. </li><li> 일단 작은 배양 접시에서 최대 각막 상피​​면을 넣고 윤부 영역까지 배양 배지 (위에서 설명한 레시피)를 추가, 설정합니다. 참고 : 전체 각막을 포함하지 마십시오 공기 - 액체 계면에서 기관 배양 물을 유지한다. </li></ol> 각막 윤부의 Explants와 토끼의 각막 3D 모델의 반지 공사장 공중 발판의 포함의 6 격리 <ol><li> 코트는 피브린 글루 15 μL와 링 막 : 상기 셀 스크레이퍼 .Use (1 2.5 U / ㎖의 농도에서 18.75 ㎎ / ㎖ 및 트롬빈의 피브리노겐 농도의 혼합물 일) 한 바와 같이. </li><li> 25 G 바늘과 해부 현미경을 사용하여 PLGA의 micropockets에서 직접 조직 절편을 놓습니다. </li><li> 이 위를 향하도록 외식와 공기 - 액체 인터페이스 조건에서 무 결함 각막의 조직 절편과 함께 반지를 놓습니다. (이 조건은 이전에 22을 설명되었다). </li><li> 위한 기관 배양 모델을 유지37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 사주와 5 % CO 2 매 이일 미디어를 변경. </li></ol> 평가 각막 재생의 7 및 세포 유지 보수 줄기 <ol><li> 사주 후, 3.7 % 포름 알데히드를 사용하여 각막을 고정합니다. </li><li> 기존의 조직 검사가 6 μm의 파라핀 섹션을 생산하는 각막을 처리합니다. </li><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E)으로 얼룩. </li><li> 면역 세포 화학, 크실렌 (3 분)에서 섹션을 탈 왁스 및 100 % 에탄올 (약 1 분), 70 % 에탄올 (1 분), 및 증류수 (2 분)에서 재수. </li><li> 작은 영역을 구분하고 항체의 과도한 사용을 피하도록 다코 펜을 사용하는 부분의 윤곽. <ol><li> 20 분 (37 ° C에서) 0.05 % 트립신 (100 μL)로 묘사 영역을 취급합니다. </li></ol></li><li> PBS로 충분히 세척하고 1 시간 동안 10 % 염소 혈청 (차단)의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 마우스 단일 클론 항체 cytokera 100 ㎕로 샘플을 품어주석 3 (CK3)와 4 ° C에서 1 % 염소 혈청 O / N에서 P63 100 ㎕. </li><li> PBS로 세척하고 바이오틴 차 항 마우스 항체 100 ㎕로 처리 (1 : 1000 1 %의 염소 혈청) 실온에서 1 시간 동안. </li><li> 실온에서 30 분 동안 : (100 1 % 염소 혈청 1) FITC-스트렙 타비 딘의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 상술 한 바와 같이 DAPI로 샘플을 처리합니다. </li><li> 800 nm의 콘텐츠 (이광자) 및 488 nm의 파장에서의 형광 현미경을 사용하는 샘플. </li></ol>

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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structural+niches+engineered+via+two-photon+laser+polymerization+promote+stem+cell+homing.">Three-dimensional structural niches engineered via two-photon laser polymerization promote stem cell homing.</a> Acta Biomaterialia. 9, 4579-4584 (2013).</li><li>Gobaa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+niche+microarrays+for+probing+single+stem+cell+fate+in+high+throughput.">Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput.</a> Nat Meth. 8, 949-955 (2011).</li><li>Truckenm&#252;ller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+cell+container+arrays+with+overlaid+surface+topographies.">Fabrication of cell container arrays with overlaid surface topographies.</a> Biomedical Microdevices. 14, 95-107 (2012).</li><li>Ortega, &. #. 2. 0. 5. ;., Ryan, A. J., Deshpande, P., MacNeil, S., Claeyssens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+microfabrication+and+electrospinning+to+produce+3-D+architectures+for+corneal+repair.">Combined microfabrication and electrospinning to produce 3-D architectures for corneal repair.</a> Acta Biomaterialia. 9, 5511-5520 (2013).</li><li>Blackwood, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement.">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 연구는 그 안에 마이크로 피처를 포함하는 전기 방사 막의 제조 방법과 진공 포장, 감마 방사선 조사 후 저장은 사용하기 전에 임상 사용을 위해 이러한 세포막을 준비하는 (B)에 대한 () 기술에 대해 설명합니다. 이 특정 응용 프로그램에서 우리는 각막 윤부 줄기 세포 틈새의 신체적 특징을 모방 micropockets를 포함하는 PLGA 멤브레인을 개발했다. 이 연구의 목적은 (i)는 조직 재생 그리고 (ii) 더 나은 이해를 제공하기로 줄기 세포 틈새의 기여에 대한 연구를위한 마이크로 피처를 포함하는 발판을 설계하고 제작하는 데 필요한 지식을 독자들에게 제공하는 방법을 설명한다 의 오랜 시간 동안 전기 방사의 발판을 저장하는 방법에 대해 설명합니다. 임상 응용의 측면에서, 링 막의 저장 매우 중요하다. 이 연구에서, 링의 저하는 6 개월 동안 조사 하였다. 의 저하멤브레인은 단순히 수분이없는 프로세스가 정지 막을 수 있도록 유지하여 가수 분해에 의해 구동된다. 사부는 외. PGA로 PLA의 비율을 변화시킴으로써, 막의 열화를 32으로 변경되었다고보고. 이 연구는 또한 PGA의 양을 증가시킴으로써, 전기 방사 막의 열화 속도가 생체 내 (22)에 증가 된 것으로 나타났다. 여기 진공 일부 건조제와 함께 막을 패킹을 조사하고, 6 개월 동안 저온에서 이들을 저장하여, 섬유의 무결성 열화에 변경이없는 것으로 밝혀졌다. 현재, 6 개월까지 우리가 일년이 -20 ° C (22)에서 일반 전기 방사 막에보고 지금 우리가 -20 ° C에서 자신의 저장되지 않은 데이터가되었습니다 이러한 막은 micropockets하지만, 저장 데이터를 포함과 함께 공부 같다 저하의 흔적이없는 이년합니다. 따라서 장기간 보관 -20 그들을 건조를 저장할 권장 될6, C 있지만 (아마도 더 이상) 6 개월 이상에도 인도 RT에서 보관하는 것이 가능하다. 습도 표시 등의 포함은 포장이 그들이 목적에 맞는 될 경우 건조 세포막을 유지하고 있음을 확인하는 쉬운 방법을 제공합니다. micropockets 내에서 윤부 이식편을 배치 할 때 3D 각막 모델이 링에서 세포의 이동을 표시했다. 이 그룹은 최근 일반 PLGA 막 (고리 구조가없는 막) 24에 외식을 배치하여 체외 토끼 각막 모델 상 세포의 이동을보고했다. 본 미세 지지체 셀 전송을 사용하여 우리가 지금 구체적으로 마이크로 피처 내에서 조직 절편을 찾을 수있는 한 단계를 촬영하고있다. 틈새 내에 직접 이식편을 배치 할 수있는 능력은 또한 외과 의사가 먼저 윤부 줄기 세포를 확장하는 클린 룸의 필요성을 회피 수술 극장에서 직접 멤브레인을 사용할 수있다. 법과이 조각 있지만K가 각막 질환 장치의 개발에 집중되어,이 미세 가공 기술은 또한 다른 많은 응용을위한 장치를 개발하기 위해 적용될 수있다. 향후 연구는 피부와 뼈 등 다른 조직의 재생을위한 구조의 제작을 모색 할 것입니다. PEGDA 미세 구조의 설계와 초기 제조 시간이 걸릴 수 있습니다 동안, 한 번 구조 저하없이 여러 번 재사용 할 수있는 제조. 따라서, 전기 방사에 의한 미세 구조화 PLGA 생분해 막의 후속 제조는 집 전체의 무지 다음 조립체 ( &#39;비정형&#39;) 멤브레인의 제조에 필적하는 속도로 수행 될 수있다. 본 연구에서 우리는 금형을 제조하는 마이크로 광을 사용하고 있지만, 이러한 3D 인쇄 또는 사출 성형 같은 다른 제조 방법도 사용될 수있다. 따라서, 기본 틀은 PE 대신 다른 중합체 또는 금속으로 만들어진 수GDA. 따라서이 기술은 매우 다양합니다 연구원은 쉽게 자신의 필요와 시설에 맞는 방법을 적용 할 수 있습니다. 30μm에서 기능과 구조의 제조를 허용하지 않습니다 본 연구에 사용 된 사내 마이크로 광 설정해서; 이것은 여기에 설명 된 각막 애플리케이션 한정되지이지만 다른 모델의 디자인에 결정적 일 수있다. 그 경우 다른 기술에서와 같은 2 광자 중합 (2PP)는하지만 전기 방사 기술은 (이 현재 우리 그룹에 의해 연구되고있다) 서브 - 미크론 규모의 구조의 재생을 허용하지 않을 관심이있을 수있다. 제조 공정 내에서 중요한 단계는 시간과 광개시제의 양을 조절하여 제어 할 수 PEGDA 템플릿의 overcuring 방지 (I)이다. (ⅱ)와 같은 온도 및 습도와 같은 전기 방사 조건을 제어한다. (ⅲ) 적절한 electrospu 보관진공 포장 및 건조제를 사용하여 n 개의 링 막. 요약하면, 멤브레인의 마이크로 피처 내에서 윤부 조직 절편을 배치하여 우리는 토끼 부상 각막과 각막의 이후의 재 상피화에 틈새 영역, 셀 전송의 절편에서 세포 부산물을 보여 주었다. 다른 온도에서 저장 막의 열화도 검토되고 있으며, 멤브레인의 장기 저장을 허용하는 장비 프로토콜은 임상 사용을위한 멤브레인을 개발 필수적인 것으로, 후자 개발되었다.

각막, 눈의 외측 중앙 무혈성 대부분 조직을 비전 일에 관여하는 가장 중요한 조직이다. 각막의 기능을 유지하는 세포의 몇 가지 유형이있다. 각막의 최 상부 층의 두께는 2 층에서 약 5-7 일 수 상피 세포를 포함한다. 이 층은 각막 세에 세균 침입을 방지하고 산소 넷의 입력 할 수 있습니다. 이보고 한 내용 윤부 5,6라고도 각막 주변부에서 (120-150 μm 인 사이즈)와 틈새 또는 지하실에서 각막 상피 거짓말 줄기 세포. 줄기 세포 분할로서, 또한 과도 증폭 셀이라고도 딸세포는 틈새 밖으로 이동하고 부서 세포 심적 안쪽으로 이동 및 위쪽 중심 각막 영역에서 7,8 말단 분화 세포에서 얻어진 계속된다. 이 세포는 정기적으로 눈 전자의 깜짝 멀리 닦아 아르구 아래에 새로운 세포를 xposing. 상피 줄기 세포의 위치 일뿐만 아니라, 또한 윤부 각막 영역 (10)로부터 떨어진 혈관 결막을 유지하는 역할을한다. 윤부 손상은 열 / 화학적 화상, 방사선 및 유전 적 질병 (10)에 의해 발생할 수 있습니다. 이 경우, 배리어는 윤부, 결막 세포는 각막에 이동할 수 있도록 영역 신생 혈관, 어떤 경우에는 통증 및 시력 상실을 유발로 세분화된다. 조건은 각막 윤부 줄기 세포 결핍 (LSCD) (10)로 알려져있다. 다른 자연 기판은 각막 재생을 돕는 가능한 줄기 세포 사업자로보고되고있다. 예를 들어, 콜라겐 계 막은 Dravida 외. 11, 라마 및 동료 (12)에 의해 112 환자 연구에서 섬유소의 사용을보고 하였다. 치료의 본 그러나 가장 널리 사용되는 방법에서,표면 (13, 14)에 조직 은행과 문화 윤부 상피 세포에서 인간의 양막을 사용하는 것입니다. 단층이 형성되면, 양막은 수술 이전에이 세포 이식 (14)에서 제거 모든 결막 세포와 흉터 조직이 손상된 각막에 최대 셀 측 붙어있다. 양막 상피 세포 (15, 16)를 재생하는 무 결함 영역에 부착 된 상피 세포를 떠나 개월 주 이내에 저하됩니다. 이 기술은 그러나 임상 적으로 널리 섭취를 제한하는 몇 가지 실질적인 문제가 여전히 거기에 비전을 복원에 성공했다. 양막은 인체 조직이기 때문에이 환자에 대한 세포 이식에 사용되기 전에 좋은 조직 은행 프로 시저를 사용하여 심사 받아야 할 필요가있다. 이 스크리닝은 질환의 전파의 위험성을 낮춘다하지만 완전히 17을 없앨 수 없다. 이 외에도 P 가변성의보고가 있었다때문에 간 기증자의 변화 (18, 19) 및 다른 처리 방법 (19, 20)에 양막의 erformance. 질병 전파의 위험 부담과 함께 수술 센터는 모든 사용할 수 없습니다 잘 실행 조직 은행에 액세스 할 수 있어야 할 필요가있다. 양막은 비교적 성공적이지만, 각막 질환의 치료를위한 새로운 합성 생분해 세포 담체 대안의 개발에 대한 필요성이 존재한다. 캐리어는 합성 절차 뱅킹뿐만 아니라 질병 전파 간 도너 변동의 작은 위험을 제거하기위한 필요성을 극복한다. 이러한 의미에서, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (21, 22)와 PLGA 23,24 같은 재료가 연구되어왔다. 양막을 합성 대안 개발 희망 배양 된 세포의 생존을 도와 그것에 바람직한 특성을 설계 할 수있는 가능성도있다. 포함셀의 동작 제어를위한 특정 장치 내의 생체 재료의 마이크로 피처 lusion 관심 신흥 영역이다. 인공 줄기 세포의 개발이 25 ~ 30을 틈새 시장으로 많은 저자는 작품을보고있다. 이 그룹은 최근 윤부 상피 세포 (22)의 전달 및 각막 윤부 상피 세포 (31)의 지원을위한 미세 포켓이 포함 된 전기 방사 된 생분해 성 막 제작을위한 방법론에 대한 미세 PEGDA의 피브로넥틴-biofunctionalized 인공 각막 윤부의 생성을보고했습니다. 이 연구의 목적은 정도로 세포 체내에 존재하는 줄기 미세 환경을 모방 마이크로 피처를 포함하는 바이오 물질 장치의 개발을위한 새로운 제조 기술을 개발하는 것이다. 우리는 GREA 표시 생분해 미세 막의 제조를 허용 마이크로 광과 전기 방사를 결합하는 기술을 개발했다조직 재생 응용 프로그램에 대한 t 가능성. 이는이 연구에서이 기법은 각막 재생을위한 링의 제조에 적용되었지만, 기술은 상피 조직의 넓은 범위의 재생, 즉, 피부, 구강위한 장치의 제조에 적용 할 수 있음을 주목하는 것이 중요 점막, 소장, 호흡기, 방광 상피. 특히, 본 연구에서 우리는 각막에 세포를 전달하는 양막 유사한 방식으로 기능하는 합성 생분해 성 멤브레인을 개발했다. 이 멤브레인은 약 300 μm 인 micropockets 포함 ((큰 보그의 Pallisades의 윤부 지하실 이상을 약 150 μm의)). 마지막으로, 우리는 이러한 세포막이 파괴의 흔적을 표시하지 않고 6 개월 이상 -20 ° C에서 보관 할 수있는 포장 프로토콜을 설립했다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="692">
	<tbody>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:183px;">Name of&#160; reagents/material/equipment</td>
			<td style="width:173px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:180px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:183px;">Poly lactic-co-glycolic acid</td>
			<td style="width:173px;">Purac</td>
			<td style="width:157px;">PDLG5004</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:183px;">Dichloromethane</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich Or Fisher</td>
			<td style="width:157px;">270997 Or D/1850/17</td>
			<td style="width:180px;">&#62;99.8% contains 50-150 ppm amylene stabiliser</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:183px;">Digital Micromirror Device (DMD) Discovery 1100 Controller Board &#38; Starter Kit</td>
			<td style="width:173px;">Texas Instruments</td>
			<td style="width:157px;">1076N732 (UV)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">473 nm Laser</td>
			<td style="width:173px;">Laser 2000</td>
			<td style="width:157px;">MBL-III</td>
			<td style="width:180px;">150 mW</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Poly (ethylene glycol) diacrylate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">475629</td>
			<td style="width:180px;">Mn = 250g/mol&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 500 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">DEMEM + Glutamax</td>
			<td style="width:173px;">Fisher</td>
			<td style="width:157px;">12077549</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Ham&#8217; s F12</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">LMH1236/500</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:173px;">Labtech biosera</td>
			<td style="width:157px;">FB-1090/50</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">EGF</td>
			<td style="width:173px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:157px;">236-EG-200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Insulin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">91077C-1G</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">A2942-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P0781-100ml</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="39" rowspan="2" style="height:39px;width:183px;">DAPI</td>
			<td rowspan="2" style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td rowspan="2" style="width:157px;">32670</td>
			<td rowspan="2" style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P4864</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Thrombin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">T9326</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">F3879</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">p63</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">P3737</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">CK3</td>
			<td style="width:173px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:157px;">CLB218</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:173px;">SLS</td>
			<td style="width:157px;">HHS16-500ML</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:183px;">Eosin</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">HT110232-1L</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:183px;">Medical grade bag (PET/Foil/LDPE) Peelable pouch</td>
			<td style="width:173px;">Riverside Medical Ltd. Derby, UK</td>
			<td style="width:157px;">Foil laminate PET/Foil/LDPE, (12,7,50)</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:183px;">gamma- irradiation (Sterilisation)</td>
			<td style="width:173px;">Applied Sterilisation Technologies (Synergy Health Laboratory Services (SHLS), Abergavenny UK) - external dose range of 25-40KGy</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:183px;">Silica gel orange</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">10087</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:183px;">Cobalt (II) chloride</td>
			<td style="width:173px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">232696</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:183px;">Copper (II) sulphate</td>
			<td style="width:173px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">C-1297</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:183px;">Six spot humidity indicator card</td>
			<td style="width:173px;">SCC, USA</td>
			<td style="width:157px;">6HIC200</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:183px;">Vacuum heat seal machine</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">VS518</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:183px;">Andrew James Vacuum Sealer rolls 28cm X 40 metre rolls</td>
			<td style="width:173px;">Andrew James UK Ltd, Bowburn, UK</td>
			<td style="width:157px;">BR2805</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Scanning Electron Microscopy (SEM)</td>
			<td style="width:173px;">Philips/FEI XL-20 SEM</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:183px;">Confocal Microscope</td>
			<td style="width:173px;">Zeiss LSM 510 META</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:183px;">Videne Antiseptic Solution</td>
			<td>Ecolab, Swindon, UK</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:180px;">3%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

combination of microstereolithography and electrospinning to produce membranes equipped with niches for corneal regeneration

각막 문제는 전 세계적으로 삶의 질을 크게 감소 수백만의 사람에 영향을 미친다. 각막 질환 등의 무 홍채 증 또는 스티븐 존슨 증후군과 같은뿐만 아니라 화학 화상이나 방사선 등의 외부 요인에 의한 질병으로 인해 발생할 수 있습니다. 현재 치료법은 (ⅰ) 각막 이식의 사용되며 (ⅱ) 실험실에서 확장되고 캐리어 (예를 들면, 양막)에 전달되는 줄기 세포의 용도; 이러한 치료는 상대적으로 성공하지만, 불행히도 그들은 3-5 년 후에 실패 할 수 있습니다. 설계 및 세부 사항에서의 줄기 세포는 각막에 상주 생리적 환경을 모방 할 새로운 생체​​ 재료 각막 장치를 제조 할 필요가있다. 각막 윤부 줄기 세포는 보그의 벼랑으로 알려진 특정 틈새 시장에서 (각막과 공막 사이에 원형 영역) 윤부에 있습니다. 이 작품에서 우리는이 최첨단 제조 기술 (마이크로 광 및 electrospinn을 결합한 새로운 플랫폼 기술을 개발했다어느 정도 모방 각막 윤부에 멤브레인의 제조를 위해) 보내고. 우리의 멤브레인은 보그의 벼랑이 눈처럼 보호 세포를 제공하는 것을 목표로 인공 micropockets가 포함되어 있습니다.

마이크로 제조 전기 방사 링 (도 1 및 2) 및 마이크로 광 전기 방사의 조합을 이용하여 제조 하였다. 서로 다른 크기의 PEGDA 링은보기 마이크로 광 (도 3)를 이용하여 제조 하였다; 이 기술 cm의 순서 및 마이크로 피처의 동시 제조에 혼입 구조를 허용한다. 이 경우, 직경의 반지는 350-500 μm 인 micropockets를 포함 1.2-1.6 cm에 이르기까지 (그림 4)를 제작 하였다. 생산 살균 및 미래의 임상 사용을위한 포장 재료에 관해서는 의료용 백에 진공 포장이 크게 PLGA 막 (도 5)의 장기간 저장을 달성 할 수있는 능력을 향상 발견되었다; 0.12 mm의 두께를 갖는 의료용 백 (PE​​T / 호일 / LDPE)의 사용이 더 긴 수명을 달성하기 위해 우리가 있었다. 이 membr를 전송하여 조사 하였다인도와 세포막에있는 우리의 협력자로 anes는 RT에서 고의적 습한 조건 (습윤 배양기)에서 37 ° C에서 -20 ° C에서 개월의 기간 동안 보관 하였다. 5가 보여주고 해당 스토리지의 의도적 도발 조건에서을 사용하여 습한 조건에서 37 ° C는, 막은 조건 포장이 아닌 진공 상태에서 약 1개월 만 안정하지만, 진공 포장 상태 (그림 5, 표 1)에서 3 개월 스토리지를 달성했다. 표 1은 심지어 물 흡수 및 섬유 하나가 사용 가방의 선택에 주목하면 팽윤에 도움이되도록 선택 조건 하에서 달성 될 수있는 보관 조건의 개선을 보여준다. 링은 서로 다른 조건 (I) 갓 (ⅱ)이 6 개월 (그림 6) 저장 링 반지 윤부 이식편에서 세포 부산물을 지원했다. 셀 전송이 사주 후 달성 할 때 PL3D 상처를 입은 모델 PLGA 막을 acing. 셀은 이전에 무 결함 각막에 새로운 상피 (도 7)을 작성 멤브레인에 배치 조직 이식편로부터 자랐다. 및 음성 대조군 (창상) 양의 (어떤 처리없이 각막)도 같은 시간 동안 문화를 유지 하였다. 음성 대조군은 어떤 세포의 첨가없는 새로운 상피의 형성 부족을 확인했다. 면역 세포 화학은 각막의 분화 마커 CK3 (그림 7E)에 대한 긍정적 이었기 때문에 외식에서 성장하는 세포가 각막 상피 세포가 있다고 설명했다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig1highres.jpg" width="500" /> 마이크로 광 그림 도식은 PEGDA 반지의 생성을 설정합니다. her.within 페이지 &quot;항상&quot;=&gt; <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig2highres.jpg" width="500" /> 템플릿으로 PEGDA에 마이크로 링을 사용하여 프로세스를 전기 방사의 그림 도식. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg" width="500" /> 도 3은 (A)는. 미세 PLGA 막의 방적 정적 콜렉터 (PEGDA 고리와 전기 알루미늄 시트)의 예를 나타낸다 (B) 및 (E) 서로 다른 전기 방사 매트 정적 수집기로부터 박리되는 것을 보여준다. (C)을 나타낸다 기본 표면의 제조를위한 마이크로 광을 사용의 다양성을 강조하는 다양한 크기의 PEGDA 템플릿. (D)는 PLGA 마이크로 제조 복제본을 보여줍니다./files/ftp_upload/51826/51826fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" width="500" /> 말굽 마이크로 (A)와 PEGDA 링의 그림 4 SEM 이미지; 미세 포켓 (B)의 고배율 SEM 이미지. 말굽 마이크로 (C)와 PLGA 링의 위상 콘트라스트 이미지; 미세 포켓 (D)의 고배율 위상 콘트라스트 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" width="500" /><b진공 및 비 진공 스토리지의 온도와 시간의 R /&gt; 그림 5 효과 (44kg / 몰) 6 개월 동안 마이크로 제작 된 링. 멤브레인 무결성이 완전히 그대로 섬유로 득점했다 PLGA (50 분의 50) 세포막을 포장 (+ + +), 일부 섬유는 섬유 (+) 병합 (+ +) 부종 또는 전혀 손상 섬유 (-). SEM 이미지와 세 건조제 (실리카 오렌지, 코발트 (II), 염화 구리 (II) 황산) 섬유 무결성이나 습도의 변경 사항을 표시하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig5highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" width="500" /> 그림 갓 만든 생분해 성 PLGA 반지 윤부 이식편에서 LEC의 부산물을 보여주는 6 형광 이미지 (A, B) -20에서 6 개월 저장 후 반지° C (C, D). 이미지 (A)와 (B)의 DAPI (청색) 각각 요오드화 프로피 듐 (적색)로 염색 된 세포에 대응한다. 이미지 (B)는 미세 가공 된 포켓에 배치 이식편의 촛점 Z-스택의 직교 도면이다. 이미지 (C)와 (D)는 P63 (녹색)에 대한 긍정적 인 염색을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" width="500" /> .도 7 (A)는 이전 피브린 접착제로 피복 된 지지체 상에 위치 된 링 지지체 및 조직 이식편으로 토끼 각막 상처 모델을 나타낸다 (B) 및 (C)는 양성 및 음성 대조군이다; 양성 대조군은 신선한 랍비<html> . t 각막 및 음성 대조군 상피 세포가 의도적으로 (음성 대조군은 4 주간 배양도했다) 제거 된 각막 (D)는 문화 사주 후 조직 설계 각막의 H &amp; E 이미지입니다; 그림은 틈새에 배치 외식에서 나오는 세포에 의해 형성된 새로운 다층 상피를 보여줍니다 (E)는 각막 윤부 이식편에서 세포 부산물을 나타내는 면역 세포의 이미지입니다.; 핵은 DAPI (파란색)로 염색하고 세포가 아세포 3에 대한 긍정적 인 염색을 보여줍니다 아르, 각막 분화 마커 (녹색). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51826/51826fig7highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" width="611"><tbody><tr height="22"><td height="43" rowspan="2" style="height:43px;width:163px;"> PLGA (50 분의 50) </td><html> X 37 ° C 습기에 저장 멤브레인 &quot;&gt; 섬유 무결성 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> 일 공 </td><td style="width:64px;"> 월 일 </td><td style="width:64px;"> 월 2 </td><td style="width:64px;"> 월 3 </td><td style="width:64px;"> 월 4 </td><td style="width:64px;"> 월 5 </td><td style="width:64px;"> 월 6 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:163px;"> 포장 비 진공 </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="67"><td height="67" style="height:67px;width:163px;"> 진공 청소기 (가방) (PE, PA 복합) 두께 : 0.14 mm </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td>64px; &quot;&gt; - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;width:163px;"> 진공 청소기 (백 B) (PET / 호일 / LDPE) 두께 : 0.75 mm </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + + + </td><td style="width:64px;"> + </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td><td style="width:64px;"> - </td></tr></tbody></table> PLGA의 무결성에 진공 서로 다른 스토리지 가방 표 1 효과 (50 분의 50) 막 (44kg / 몰) 저장 6 개월 동안 조사했다. 막 무결성을 완벽하게 그대로 섬유 (+ + +), 일부 섬유 붓기로 득점했다 (+ +), 섬유 병합 (+) 또는 전혀 손상 섬유 (-).

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Combination of Microstereolithography and Electrospinning to Produce Membranes Equipped with Niches for Corneal Regeneration

우리는 세포의 행동을 연구하는 전기 방사 막을 내 micropockets의 제조를위한 기술을보고합니다. 구체적으로, 우리는 PLGA (폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드)) 마이크로 피처 구비 각막 생체 재료 소자의 생산을위한 마이크로 광과 전기 방사의 조합을 설명한다.

마이크로 광 및 전기 방사의 조합은 각막 재생을위한 틈새를 장착 멤브레인을 생산하는

Corneal problems affect millions of people worldwide reducing their quality of life significantly. Corneal disease can be caused by illnesses such as ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K 조회수.  University of Sheffield.  우리는 세포의 행동을 연구하는 전기 방사 막을 내 micropockets의 제조를위한 기술을보고합니다. 구체적으로, 우리는 PLGA (폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드)) 마이크로 피처 구비 각막 생체 재료 소자의 생산을위한 마이크로 광과 전기 방사의 조합을 설명한다. 

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Electrospinning Fundamentals: Optimizing Solution and Apparatus Parameters

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. Electrospinning is a process in which a charged polymer jet is collected on a grounded collector; a rapidly rotating collector results in aligned nanofibers while stationary collectors result in randomly oriented fiber mats. The polymer jet is formed when an applied electrostatic charge overcomes the surface tension of the solution. There is a minimum concentration for a given polymer, termed the critical entanglement concentration, below which a stable jet cannot be achieved and no nanofibers will form - although nanoparticles may be achieved (electrospray). A stable jet has two domains, a streaming segment and a whipping segment. While the whipping jet is usually invisible to the naked eye, the streaming segment is often visible under appropriate lighting conditions. Observing the length, thickness, consistency and movement of the stream is useful to predict the alignment and morphology of the nanofibers being formed. A short, non-uniform, inconsistent, and/or oscillating stream is indicative of a variety of problems, including poor fiber alignment, beading, splattering, and curlicue or wavy patterns. The stream can be optimized by adjusting the composition of the solution and the configuration of the electrospinning apparatus, thus optimizing the alignment and morphology of the fibers being produced. In this protocol, we present a procedure for setting up a basic electrospinning apparatus, empirically approximating the critical entanglement concentration of a polymer solution and optimizing the electrospinning process. In addition, we discuss some common problems and troubleshooting techniques.

Electrospinning techniques can create a variety of nanofibrous scaffolds for tissue engineering or other applications. We describe here a procedure to optimize the parameters of the electrospinning solution and apparatus to obtain fibers with the desired morphology and alignment. Common problems and troubleshooting techniques are also presented.

Electrospinning 기본 : 최적화 솔루션 및 장치 매개 변수

Electrospun nanofiber scaffolds have been shown to accelerate the maturation, improve the growth, and direct the migration of cells in vitro. ...

연구

생체공학

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

뼈 재생을위한 인적 Perivascular 줄기 세포의 이용

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Preparation of Light-responsive Membranes by a Combined Surface Grafting and Postmodification Process

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is presented. The polymerization from the membrane surface is induced by plasma treatment of the membrane, followed by reacting the membrane surface with a methanolic solution of 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA). Special attention is given to the process parameters for the plasma treatment prior to the polymerization on the surface. For example, the influence of the plasma-treatment on different types of membranes (e.g.&#160;polyester, polycarbonate, polyvinylidene fluoride) is studied. Furthermore, the time-dependent stability of the surface-grafted membranes is shown by contact angle measurements. When grafting poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) in this way, the surface can be further modified by esterification of the alcohol moiety of the polymer with a carboxylic acid function of the desired substance. These reactions can therefore be used for the functionalization of the membrane surface. For example, the surface tension of the membrane can be changed or a desired functionality as the presented light-responsiveness can be inserted. This is demonstrated by reacting PHEMA with a carboxylic acid functionalized spirobenzopyran unit which leads to a light-responsive membrane. The choice of solvent plays a major role in the postmodification step and is discussed in more detail in this paper. The permeability measurements of such functionalized membranes are performed using a Franz cell with an external light source. By changing the wavelength of the light from the visible to the UV-range, a change of permeability of aqueous caffeine solutions is observed.

A plasma-induced polymerization procedure is described for the surface-initiated polymerization on polymer membranes. Further postmodification of the grafted polymer with photochromic substances is presented with a protocol of conducting permeability measurements of light-responsive membranes.

결합 표면의 접목 및 Postmodification 과정에 의한 빛의 응답 멤브레인의 제조

In order to modify the surface tension of commercial available track-edged polymer membranes, a procedure of surface-initiated polymerization is ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to intrinsic parameters within the process allow a high degree of control over scaffold characteristics including fiber diameter, alignment and porosity. By developing scaffolds with similar dimensions and topographies to organ- or tissue-specific extracellular matrices (ECM), micro-environments representative to those that cells are exposed to in situ can be created. 
The airway bronchiole wall, comprised of three main micro-environments, was selected as a model tissue. Using decellularized airway ECM as a guide, we electrospun the non-degradable polymer, polyethylene terephthalate (PET), by three different protocols to produce three individual electrospun scaffolds optimized for epithelial, fibroblast or smooth muscle cell-culture. Using a commercially available bioreactor system, we stably co-cultured the three cell-types to provide an in vitro model of the airway wall over an extended time period.
This model highlights the potential for such methods being employed in in vitro diagnostic studies investigating important inter-cellular cross-talk mechanisms or assessing novel pharmaceutical targets, by providing a relevant platform to allow the culture of fully differentiated adult cells within 3D, tissue-specific environments.

Adapting the Electrospinning Process to Provide Three Unique Environments for a Tri-layered In Vitro Model of the Airway Wall

Advancements in biomaterial technologies enable the development of three-dimensional multi-cell-type constructs. We have developed electrospinning protocols to produce three individual scaffolds to culture the main structural cells of the airway to provide a 3D in vitro model of the airway bronchiole wall.

전기 방사를 적응하는 것은 트라이 계층에 대한 세 가지 독특한 환경을 제공하기 위해<em&gt; 체외</em&gt;기도 벽의 모델

Electrospinning is a highly adaptable method producing porous 3D fibrous scaffolds that can be exploited in in vitro cell culture. Alterations to ...

Merging Ion Concentration Polarization between Juxtaposed Ion Exchange Membranes to Block the Propagation of the Polarization Zone

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP induces a noninvasive region for charged biomolecules (i.e., the ion depletion zone), and targets can be preconcentrated on this region boundary. Despite the high preconcentration performances with ICP, it is difficult to find the operating conditions of non-propagating ion depletion zones. To overcome this narrow operating window, we recently developed a new platform for spatiotemporally fixed preconcentration. Unlike preceding methods that only use ion depletion, this platform also uses the opposite polarity of the ICP (i.e., ion enrichment) to stop the propagation of the ion depletion zone. By confronting the enrichment zone with the depletion zone, the two zones merge together and stop. In this paper, we describe a detailed experimental protocol to build this spatiotemporally defined ICP platform and characterize the preconcentration dynamics of the new platform by comparing them with those of the conventional device. Qualitative ion concentration profiles and current-time responses successfully capture the different dynamics between the merged ICP and the stand-alone ICP. In contrast to the conventional one that can fix the preconcentration location at only ~5 V, the new platform can produce a target-condensed plug at a specific location in the broad ranges of operating conditions: voltage (0.5-100 V), ionic strength (1-100 mM), and pH (3.7-10.3).

The protocol for a novel ion concentration polarization (ICP) platform that can stop the propagation of the ICP zone, regardless of the operating conditions is described. This unique ability of the platform lies in the use of merging ion depletion and enrichment, which are two polarities of the ICP phenomenon.

나란히 이온 교환 멤브레인 사이의 이온 농도 분극을 병합하면 편광 영역의 전파를 차단하는

The ion concentration polarization (ICP) phenomenon is one of the most prevailing methods to preconcentrate low-abundance biological samples. The ICP ...

Synthesis of Hydrogels with Antifouling Properties As Membranes for Water Purification

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and thus achieving stable water permeability through membranes over time. Here, we report a facile method to prepare hydrogels based on zwitterions for membrane applications. Freestanding films can be prepared from sulfobetaine methacrylate (SBMA) with a crosslinker of poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) via photopolymerization. The hydrogels can also be prepared by impregnation into hydrophobic porous supports to enhance the mechanical strength. These films can be characterized by attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-FTIR) to determine the degree of conversion of the (meth)acrylate groups, using goniometers for hydrophilicity and differential scanning calorimetry (DSC) for polymer chain dynamics. We also report protocols to determine the water permeability in dead-end filtration systems and the effect of foulants (bovine serum albumin, BSA) on membrane performance.

This paper reports practical methods to prepare hydrogels in freestanding films and impregnated membranes and to characterize their physical properties, including water transport properties.

물 정화를위한 막으로 방오 특성을 가진 히드로 겔의 합성

Hydrogels have been widely utilized to enhance the surface hydrophilicity of membranes for water purification, increasing the antifouling properties and ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...