생체 재료 멤브레인에 인간과 양 각막 내피 세포 층의 성장

본 세포 배양 프로토콜은 각막 내피 세포가 격리, 확장 및 하위 배양 중에 중간엽 전이에 대한 상피를 거치지 않도록 설계되었습니다. 세포 배양은 각막 조직 각성에서 설치됩니다, 이는 한 기증자에서 1 차 세포의 지속적인 공급을 보장하기 위해 재사용할 수 있습니다. 먼저 6웰 조직 배양판의 우물을 제조업체의 지침을 사용하여 부착 인자를 코팅합니다.

그런 다음 각 코드에 문화 배지의 밀리리터 를 잘 추가합니다. 각막 내시경을 해부 현미경의 무대에 멸균 페트리 접시에 올려 놓습니다. 각막 표면이 내피 층을 강조하기에 충분한 대조로 조명을 조정하고 줌을 조정하여 가장자리와 일부 중앙 각막 내막 내분비암이 볼 수 있도록 조정합니다.

멸균 된 워치메이커 집게를 사용하여 기본 스트로마에서 데스멧의 멤브레인을 부드럽게 들어 올리고 찢어냅니다. 멤브레인 스트립을 배양 판의 준비된 우물 중 하나에 넣고 즉시 플레이트뚜껑을 교체하여 오염 위험을 줄입니다. 먼저 내피의 극단적 인 주변에서 Descemet의 막의 스트립을 제거하고 나중에 중앙 지역에서, 하나의 우물에 하나의 각막에서 모든 스트립을 배치.

완료되면, 가습 된 세포 배양 배양에서 이출을 37섭씨 37도 및 이산화탄소 5%로 설정하여 배양한다. 중앙에 빨간색 O 링을 배치하여 마이크로 보이든 챔버의 상부 챔버를 조립합니다. 18mm 직경의 트레핀을 사용하여 PTFE 도마의 생체 재료 시트에서 디스크를 펀치합니다.

그런 다음, 마이크로 보이덴 챔버의 상부 챔버에 빨간색 O 링 위에 디스크를 배치합니다. 상부 챔버에 하부 챔버를 나사, 그 사이에 바이오 재료의 디스크를 확보. 그리고 조립 된 마이크로 보이덴 챔버를 70 %에탄올에 1 시간 동안 담그고 살균하십시오.

담그고 나면 에탄올을 제거하기 위해 10 분 동안 멸균 HBSS에 챔버를 완전히 담그십시오. 그런 다음 챔버를 배양 배지로 10분 간 세척합니다. 그리고 상부 챔버가 위쪽으로 지향되도록, 6 웰 플레이트의 우물 내부 의 문화 매체로 전송합니다.

생체 재료 멤브레인의 하부 표면에 접촉하지만 상부 챔버로 흐르지 않도록 매체의 수준을 조정합니다. 파이펫 100 마이크로리터의 마이크로리터는 마이크로 보이든 챔버로 멤브레인에, 4시간 동안 조직 배양 인큐베이터에 배양한 후, 챔버를 완전히 침수하기 위해 배지를 추가한다. 1~2세 양 또는 30세 미만의 인간 기증자의 각막에서 유래된 대부분의 이질은 1주일 이내에 부착된 조직 배양 판에 부착되었다.

6 주 후, 많은 작은, 단단히 포장 된 세포는 절제 옆에 존재했다. 각막 내피 세포 배양 내의 작고 단단히 포장 된 세포는 삼중 으로 소화에 저항하고 더 큰 섬유 아세포 세포는 그것에 더 민감합니다. 이러한 차이는 작은 세포를 새로운 플레이트로 옮기기 전에 배양에서 큰 세포를 선택적으로 제거하기 위해 이용되었다.

면역 가루 분석은 ZO-1, 단단한 접합 단백질 및 N-cadherin, 준수 접합 단백질을 찾아내는 각막 내피 세포 배양에 실시되었습니다. 동일한 항체는 양과 인간 세포 둘 다를 위해 이용되었고, 두 단백질은 두 종 모두에서 세포의 혈장 막에서 검출되었다. 사용자 정의 만든 마이크로 보이덴 챔버는 멤브레인의 양면을 동시에 세포 배양 표면으로 사용할 수 있었습니다.

조직 엔지니어링 세포 구조의 단면 보기는 한 표면에 각막 내피 세포의 단일 층, 다른 표면에 각막 기질 세포의 다층 배양을 나타낸다. 이 프로토콜을 시도할 때, 각막에서 멀리 데스메트의 막을 벗길 때 집게로 내피하는 것을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 멤브레인의 각막 내피 세포 층의 무결성을 전기 저항을 측정하여 확인할 수 있습니다.