우리는 그림과 도움을 이전 입력 및 일리아 Aylyarov에 대한 유동 세포 계측법, 박사 뿌르 니마 Jaiswal 박사 디 우와 관련하여 도움이 박사 R. 마이클 Sramkoski 감사드립니다. NIH 그랜트 R01GM089872과 세포 계측법 및 사례 종합 암 센터 (P30 CA43703)의 이미징 현미경 핵심 설비의 지원.

1. Haploid 세포의 성장 <ol><li> S. 성장 표준 조건 10 세 미만 S288C 배경 (BY4741)에서 cerevisiae 세포. </li><li> 두 눈에 형광 마커 10 중 하나를 표현하는 haploids을 변환 할 수 있습니다. 선택의 마커 mCherry (A. 존스턴에서 pAJ1661, URA3/CEN)과 융합 세포질로 표현 가용성 GFP (BglII 11 선형화 pEG220, URA3/YIp)와 하나의 ribosomal 단백질, RPL25입니다. 우리는 동등한 두 컬러 정화 프로토콜은 haploid 부모의 세포에 의해 합성 된 다른 밝은 형광 단백질의 사용을 만들 수 기대하고 있습니다. 또한, 세포 벽은 형광 lectins으로 표시 될 수 있습니다. </li><li> 하루 앞 접합자 정화에서 각 셀 타입의 5 ML 문화의 예방과 ° C가 1.0을 초과하지 A600에 도달 할 23 박 흔들림과 함께 성장. 2 %의 포도당 (CSM-포도당)를 포함한 완전한 합성 중간에 GFP의 transformants (ATY4442)을 성장uracil 10 부족 합성 선택적 중간에 차 RPL25 - mCherry의 transformants (ATY4552). 실온에서 흔들림 각 세포 유형의 병렬 문화를 유지하고 있습니다. </li></ol> 2. 크로스를 수행 <ol><li> 신선한 매체에 1.0으로 각 샘플의 광학 밀도 (A600)를 조정합니다. [1 광학 밀도 단위 ~ 3 X 10 7 세포 / ML] </li><li> 10 초에 대한 하나 이상 소용돌이 다음 간단히 두 문화, 소용돌이 3 회,의 동등한 볼륨을 섞는다. </li><li> CSM-포도당 접시를 준비합니다. 번호판은 일상적인 성장에 사용되는 것과 동일 45 쏟아져 이후 분, 한천 10 응고를 건조되었습니다. </li><li> CSM-포도당 플레이트의 표면의 가장자리에서 혼합 1cm의 많은 스무으로 40 ML 방울를 배포합니다. 작은 물방울이 처음 표면에 적용하는 경우는 시간이 경과 측정 할 수있는 타이머를 시작합니다. 액체 (약 30 분) 흡수되면, 접시를 커버하고 타나로 오에 그대로 남겨둔다는m 온도. </li></ol> 3. 수확 준비 <ol><li> 수확 샘플 23 1.75-2.5 시간 후에 ° C 반복적으로 얼음 접시를 유지, 150 ML 추위 CSM-포도당을 사용하여 접시에서 개인 말린 물방울을 닦고하여. 반복적으로 복구를 극대화 할 수있는 동일한 매체 비말 지역에게 평균의 10 배에서 20 배를 씻는다. 얼음에 15 ML 팔콘 튜브에 수집합니다. </li><li> 얼음에 피셔 FB120의 sonicator (120Volt 120Watt, 주파수 20KHz)로 60 % 진폭에서 샘플 10 배 sonicate 조사. </li><li> 몇 또는 전혀 집계가 유지 위상 현미경으로 확인합니다. 셀의 15-50%이 시점에서 zygotes을 형성 할 것으로 예상됩니다. </li><li> 더 예방책 (집계가 정착 할 수 있도록하기 위해)로 10 분을위한 얼음에 방해받지 수직 위치에있는 셀의 관을 둡니다. </li><li> 볼륨의 최상위 90 %를 복구하고 나일론 메쉬 (BD 매의 폴리 프로필렌 관 스트레이너 캡 (참조 352,235) 포함)를 통해 필터링합니다. 전형적인 실험, 10 7 세포에서한 접시에서 복구는 CSM-포도당 4 ML에 희석이 시점에서 있었다. </li></ol> 4. 유동 세포 계측법 <ol><li> 100 마이크론 팁과 소니 iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer, (고도의 자​​동화 병렬 정렬) HAPS1를 사용하여 정렬 셀. GFP의 여기 들어, 블루 아르곤 이온, 488 nm의 250 milliwatt 레이저를 사용합니다. mCherry에 여기 들어, 561 nm의에서 100 milliwatt 레이저를 사용합니다. 우리가 다른 기계와 경험이 있지 않지만, 우리는 올바른 레이저가 장착 때 Becton 디킨슨 FACSAria, Becton 딕슨의 유입 또는 Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀 베는 날 MoFlo XDP 잘 될 것이라고 기대합니다. </li><li> 베이스 가능한 세포에 게이트 위해 앞으로 대 다시 분산 형 플롯에 매개 변수를 정렬. 615의 방출 계획을 수립 + / - 30 nm의 대역 통과 필터 (mCherry) 대 525 + / - 25 nm의 대역 통과 필터 (GFP) 4 당장 자리로 이벤트를 나눌 수있는, &quot;레드 + 그린 -&quot;, &quot;레드 + 그린 +&quot;, &quot;적목 녹색 &#39;및&#39;레드 - 그린 + &quot;(그림 S2). 표준 F로 nonfluorescent 세포를 사용하여또는 &quot;적목 그린 -&quot;사분면의 결정. </li><li> 21.5 psi의 피복 압력, 43,400 물방울 / 초의 비말 주파수, 그리고 20.5 PSI의 샘플 압력 정렬 세포. </li><li> 초기 정렬 ( &quot;복구 모드&quot;) : CSM-포도당 찬 250 ML를 포함하는 차가운 Eppendorf 튜브에 샘플을 수집합니다. 냉장 microfuge의 최고 속도 (Tomy MRX-150, 15,000 RPM)에서 침전 10 초와 흐름 솔루션 (유동 세포 계측법의 피복 솔루션 (1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 PBS) BioSure 카탈로그 번호 1027)를 대기음. 500 ML 추위 CSM-포도당을 Resuspend. </li><li> 둘째 정렬 ( &quot;순도 모드&quot;) : &quot;순결 모드&quot;옵션을 사용하여 초기 정렬에 대한로 정렬을 실시한다. 침전 세포를 정화 500 ML-1.0 ML의 CSM-포도당의 알약을 resuspend. 신진 대사 복구 할 수 있도록 23 ° C에서 24 잘 플레이트에서 15 분 동안 흔들어. </li></ol> 5. DeltaVision의 현미경 <ol><li> 다음과 같은 아가로 오스 패드를 준비 : (UltraPure 1.5 % 아가로 오스의 정지 가져아가로 오스, Invitrogen 다음 종기에 CSM-포도당의 카탈로그 # 15510-07), 와류 짧게, 그리고 수평 표준 유리 슬라이드의 표면에 아가로 오스 솔루션의 0.3 ML 샘플을 적용하고 두 번째 슬라이드를 한 번에 커버 (없이 ) 압력을 가해. </li><li> 10 분 동안 냉각 후, 부드럽게, 수평 슬라이딩하여 상단 슬라이드를 제거 부드러운 표면을 떠날 돌봐하고 아가로 오스 레이어를 방해하지. (상단 슬라이드가 제거되면, 세포의 샘플은 1-2 분 내에 적용해야합니다. 위의 슬라이드를 제거하지 않고 실온에서 습한 챔버에 보관하면 패드는 사용하기 전에 하루에에 저장할 수 있습니다.) </li><li> 침전 샘플 및 보증금 아가로 오스 패드에있는 펠릿의 1 ML의 aliquots (표면을 만지지 않고). 즉시 정사각형 제 1 coverslip으로 샘플을 다룹니다. 단일 깨끗 razorblade을 초과 아가로 오스를 멀리 트림. 주사기에서 투여 바세린과 준비를 밀봉합니다. </li><li> Deltavision (응용 Precisio를 사용하여 이미지∞ / 0.17/FN26.5), binning없이 100x 기름 침지 목표 (올림푸스 UPlanApo 100x/1.40과 n)이. </li><li> softWoRx 5.0.0 프로그램 사용 (Z-스택 Deconvolve <a href="http://www.api.com/softworx.asp" target="_blank">http://www.api.com/softworx.asp을</a> )를 최소한 처리 할 수 있습니다. 연속 Z-비행기는 일반적으로 0.2-0.4 미크론 간격에서 수집되었다. </li></ol> 6. 대표 결과 변환 haploid 세포의 형광 강도 수준은 : haploids에 형광의 수준은 그림 S1에 도시된다. 십자가, epifluorescent 시험은 본질적으로 모든 GFP의 transformants가 녹색이었고 모든 mCherry의 transformants은 종종 희미하지만, 붉은 색 있다는 것을 보여 주었다 전에. 십자가에 사용 된 모든 세포가 실제로 형광 있다는 보장하기 위해, 우리는 가장 밝은 형광 신호 subpopulation를 사용했습니다. 완성 된 요리 :fter은 초기 정렬, 레드 + 그린 + 샘플 (그림 S2) 일반적으로 8-20 셀의 입력 번호의 %와 지속적인 세포 세포 접착으로 인해 아마도 haploid 세포의 과도한 숫자가 포함되어 있습니다. 높은 농축이 하나의 정렬을 달성되지 않기 때문에, 부분적으로 정화 예제는 탐사선이 다시 정렬에 이어 60 %의 진폭에 두 번 sonicated해야합니다. 세포의 두 번째 종류의 대상 (두 번째 종류는 불과 15 분. 필요 동안 1-2 시간 사이에 일반적으로 마지막으로 복구 정렬), 레드 + 그린 + 샘플은 입력 셀의 23-52%이 포함되어 있습니다. 단계 현미경 검사 : 검사 상 대비 현미경으로는 최종 접합자 준비의 순도는 21 준비 (86 %에서 91%에 이르기까지)을 통해 약 90 %를 평균 것으로 나타났다. 오염 물질은 서로 연락을했다 haploids의 녹색 또는 빨간색 haploids, 또는 쌍 중이었다. 그림 3은이 zygotes의 비율을 tabulates노 새싹, 중간 꽃 봉오리 (메드), 측면 봉오리 (LAT) 또는 터미널 꽃 봉오리 (기간), 같은 색의 짝을 haploids 수 ( &quot;2Same&quot;) 또는 다른 색 ( &quot;2Hap&quot;)뿐만 아니라, 개인 haploids ( 누군가에게). 세포가 1.75 시간 이후에 수확 때, 50 % 이상이 unbudded되었으며 다른 하위 카테고리가 (중간, 옆, 또는 터미널 꽃 봉오리 포함) 동등하게 표현되었다. 2.5 시간 후에는 4 가지 범주의 각 (unbudded, 안쪽, 옆 또는 터미널 꽃 봉오리 포함)에 zygotes의 약 같은 숫자가있었습니다. 현미경 관찰 (그림 4) : zygotes의 구조는 정화 동안 변함에 나타납니다. 십자가의 기간에 따르면, 인구는 위에서 설명한 unbudded 및 budded zygotes의 다른 비율을했다. 녹색과 붉은 haploids 모두 형광 신호 강도에 상당한 차이를 보여 주었다 때문에 comparin에 의해 관찰되기 때문에 다른 사람들이, 주로 녹색있을 때, 일부 zygotes는 주로 붉은 색이었다g 그림 4에 결합 된 이미지의 단일 컬러 이미지. GFP (MW 26kDa)은 핵을 입력하고 핵이 융합하지 않아도 핵에서 발견 할 수도 있습니다. 액포는 검은 색이 아닌 형광 분야로 눈에 띄는. 정화의 최종 제품 개발의 여러 단계에서 다양한 인구를 산출. Zygotes은 공사를하지 않은 퓨전이라는. B 형 zygotes는 unbudded 있습니다. C 형은 작은 꽃 봉오리가 있습니다. 형식은 큰 꽃 봉오리가 D 및 타입 E의 zygotes는 cytokinesis를 받아야하려고합니다. 이전 zygotes의 많은 여전히 비 형광 중간 부 라인 (*)를 전시하고, vacuolar &quot;상속 구조&quot;(I) 12 종종 꽃 봉오리에 접합자에서 확장 할 볼 수 있다는 것 또한 있습니다. 어떤 경우에는 녹색 신호가 빨간색 신호 그 훨씬 더 범위 파트너로 배포하고 있습니다. 이 (Tartakoff, 준비) polysom​​es의 특징 전송의 지연을 반영합니다. 6 zygotes를 복구합니다. 우리가 세포의 수와 RNA의 약 1.5 밀리그램의 압축을 풉니 다 페놀 - 클로로포름 절연 프로토콜을 사용합니다. 정화 zygotes은 사전에 자세한 분석, 냉각 된 이후 우리는 ° C 성장 매체 23에서 부화하는 것이 좋습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig1.jpg" /> 1 그림. 접합자 형성 연혁. haploids와 diploids 사이의 중간으로 Zygotes. 이 다이어그램은 고전 haploids의 활성화 (shmooing)의 융합, 그리고 초기 꽃 봉오리의 형성을 보여줍니다. 봉오리가 (T)하거나, (M) 안쪽 측면 (L) 또는 터미널 될 수 있습니다. <imgALT = &quot;그림 1&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/4197/4197fig2.jpg&quot;/&gt; 그림 2. 접합자 정화 프로토콜의 개략도. 포도당을 갖춘 중간에 한천 플레이트의 표면에 부화 후, 세포 혼합물은 세척에 의해 복구 된 후 &quot;순도 모드에서 두 번째 종류의 다음&quot;복구 모드 &quot;의 초기 정렬을 받게. &quot; 노란 색은 mCherry와 GFP 신호 모두 zygotes에서 볼 수 있다는 의미합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig3.jpg" /> 그림 3. 분수를 정화. 짝짓기 혼합물의 zygotes의 종류는 1.75 또는 상대적으로 초기 대 상대적으로 더 성숙 zygotes에 풍부한 분수를 복구 2.5 시간 후에 수확했다. 독특한 색상이 지정 여덟 독립적 인 실험은, 때마다 포인트를 수행했다. 그래프 zygotes의 상대적인 숫자를 나타내는 헥타르꽃 봉오리 형성 spatially 독특한 패턴이 있어요. 부화의 간단한 기간을 감안할 때 (상온에서 이하 2.5 시간) 관찰 모든 버드는 초기 접합자의 신진 행사입니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/4197/4197fig4.jpg" /> 4 그림. 풍부한 분수의 DeltaVision 시험. 일반적인 필드가 Deltavision 현미경으로 조사되었다. 그림도 붉은 색과 녹색 또는 하나의 두 색상을 보여줍니다. 빨간색은 polysom​​al 라벨 (Rpl25p - mCherry)과 cytosolic GFP의 녹색에 해당합니다. 액포 (V), 꽃 봉오리 (B), 핵 (n)이, vacuolar &quot;상속 구조&quot;은 (i), 그리고 부모를 구분하기 위해 나타나는 파티션 (*) : zygotes의 높은 농축하고, 지정된 subcellular 기능을합니다 비교적 초기 zygotes의 도메인. 이들의 변수 전체 색상이 융합 haploids의 상대 강도를 반영합니다. 두 부모 도메인이 유지되는 경우독특한 색상은 마커 (세포질 GFP, mCherry 태그 polysom​​es)의 평균은 불완전했다. 진행 시간 경과 연구 전에 polysomes에 용해 GFP를 redistributes는.을 보여 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4197/4197fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 보충 전설 <img alt="그림 S1" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS1.jpg" /> 그림 S1. haploid 세포의 형광 맨 왼쪽 :. mCherry 태그 polysomes을 표현 셀은 녹색 신호를 감지하기 위해 조사되었다. 직사각형 창은 부정적인 세포를 피하기 위해 설정되었습니다. 중앙 그래프 : cytosolic GFP를 표현 세포가 분석 탐지의 분명한 밝은 주요 인구를 보여주는되었습니다. 맨 오른쪽 : mCherry 태그 polysom​​es을 표현 세포를 분석 하였다. 직사각형은 (맨 왼쪽에있는 것과 동일) 밝은 세포를 포함하고 모든 수네거티브는 피해야합니다. 지정 &quot;R2&quot;는 지정된 사각형 안에 회수 세포의 비율을 나타냅니다. <img alt="S2 그림" src="/files/ftp_upload/4197/4197figS2.jpg" /> S2 그림. 첫 번째와 두 번째 정렬에서 셀 유통.이 두 색상의 플롯은 오른쪽 상단의 구역 (R5)에 그린 + 레드 + 세포의 비율을 나타냅니다. 이 비율은 두 번째 종류에서 52 %로 증가한다. 가로 축 : 녹색 신호. 수직 축 : 적색 신호.

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

정화 zygotes의 가용성 zygotes는 또한 세포주기 재입국, 세포 벽 개조, 신진 및 상속 특성 등을 받아야하는가 transcriptomics, 단백질 체학 및 lipidomics뿐만 아니라, 메커니즘에 대한 조사를 포함 생화학 연구를 촉진해야 zygotes가 시작 생성 할 수 하나 또는 둘 모두 부모의 특성 변이를 들고 긴장을 갖추고 있습니다. 또한, 정화 zygotes은 haploid 또는 diploid 세포로, 중간 15 % 글리세롤을 포함하는 동안 얼어있을...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 장비 </td><td> 출처 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> pEG220, URA3/YIp, 인코딩 세포질 GFP 11) </td><td> E. Grote </td><td></td></tr><tr><td> pAJ1661, URA3/CEN, mCherry에 융합 인코딩 RPL25 </td><td> A. 존스턴 </td><td></td></tr><tr><td> 피셔 FB120의 sonicator </td><td> 피셔 과학 </td><td></td></tr><tr><td> 스트레이너 캡과 폴리 프로필렌 관 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 참조 352,235 </td></tr><tr><td> 냉장 microfuge </td><td> Tomy </td><td> MRX-150 </td></tr><tr><td> 유동 세포 계측법의 피복 솔루션 </td><td> Biosure </td><td> 1027 </td></tr><tr><td> iCyt의 반사 모델 흐름 Cytometer </td><td> 소니 </td><td></td></tr><tr><td> DeltaVision의 deconvolution 현미경 </td><td> 응용 Precision </td><td></td></tr><tr><td> 입식 epifluorescence 현미경 </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure 아가로 오스 </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-07 </td></tr><tr><td> CSM 포도당 제제 참고 사항 : 한천 플레이트의 경우는 단순히 2 % 한천 (Difco)를 포함 </td><td> 10 </td><td></td></tr></tbody></table>

flow cytometry-based purification of s. cerevisiae zygotes

Zygotes는 효모 등 여러 생물의 수명주기의 haploid와 diploid 상태 사이의 중요한 중간체, (그림 1) 1. S. 아르 cerevisiae는 별개의 결합 유형 (마타, MATalpha)의 haploid 세포의 융합에서 결과를 zygotes과 연속의 놀랍도록 비대칭 mitotic 부문이의 결과로 많은 20로 diploid의 자손을 생성하는 해당 안정 diploids에 상승을 제공합니다. 접합자 형성은 사건의 복잡한 순서에 의해 조율되어 있습니다 :이 과정에서 용해 결합 요소는 세포 세포 융합에 세포주기와 절정에 달하다 중단을 촉진 수용체 - 매개 신호 폭포를 게재하고, 수용체 기원하기 위해 바인딩합니다. Zygotes는 전구 또는 줄기 세포 기능의 모델로 간주 될 수 있습니다. 대부분 zygotes의 형성에 대해 알게되었지만 및 zygotes는 일반 signif의 휴대 분자 질문을 조사하는 데 사용되었습니다 있지만,icance는 거의 모든 연구 zygotes가 3-8 haploid 세포의 과반수 인구 함유되어있는 결합 혼합물의 사용을 만들었습니다. 접합자 형성 생화학의 여러 측면과 접합자의 지속적인 삶을 따라서 uninvestigated 남아있다. 효모 zygotes의 정화의 보고서는 침강 특성 9 일 기준으로 프로토콜을 설명하지만,이 침전 기반 절차는 우리의 손에 약 90 % 순도를 얻을 수 없습니다. 또한,이 세포는 hypertonic sorbitol에 노출되는 단점이 있습니다. 따라서 우리는 다양한 정화 절차를 개발했습니다. 이러한 목적을 위해, 빨간색 또는 녹색 형광 단백질을 표현 ha​​ploid 세포의 쌍 접합자 형성, 다양한 시간에 수확하고, 결과 zygotes이 흐름 세포 계측법 기반 정렬 프로토콜을 사용하여 정제 된 수 있도록 공동 incubated했다. 이 기술은 결함과 성숙의 편리한 시각적 평가를 제공합니다. 평균 순도분수의 약 90 %이다. 수확의 타이밍에 따르면, 성숙의 학위를 변화의 zygotes은 복구 할 수 있습니다. 정화 샘플 초기 자손의 복구를 위해,이 전구 세포의 체계적 조사에 대해 &quot;omic&quot;연구에 대한 출발의 편리한 점을 제공합니다.

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Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

의 zygotes을 정화하려면<em&gt; S. cerevisiae</em&gt;, 반대 결합 유형의 haploid 세포는 흐름 세포 계측법 기반 프로토콜을 사용하여 빨간색 또는 녹색 형광 접합자 형성을 허용 공동 incubated 단백질, 그리고 fractionated을 표현하도록 설계되었습니다. 높은 강화 분율은 초기 자손의 후속 &quot;omic&quot;연구, 복구 및 접합자 morphogenesis의 체계적인 조사를 할 수 있습니다.

의 흐름 세포 계측법 기반 정화<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygotes

Zygotes are essential intermediates between haploid and diploid states in the life cycle of many organisms, including yeast (Figure 1) 1. S. cerevisiae ...

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Biology

Flow Cytometry-based Purification of S. cerevisiae Zygotes

12.7K 조회수.  Case Western Reserve University School of Medicine. 의 zygotes을 정화하려면 S. cerevisiae, 반대 결합 유형의 haploid 세포는 흐름 세포 계측법 기반 프로토콜을 사용하여 빨간색 또는 녹색 형광 접합자 형성을 허용 공동 incubated 단백질, 그리고 fractionated을 표현하도록 설계되었습니다. 높은 강화 분율은 초기 자손의 후속 "omic"연구, 복구 및 접합자 morphogenesis의 체계적인 조사를 할 수 있습니다.

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

세계 S. cerevisiae의에서 organelle 형태를 연구하기 위해 높은 처리량 방법

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. The simplicity and power of the yeast aging model can also be explored to study DNA damage and genome maintenance as well as their contributions to diseases during aging. Here, we describe a system to study age-dependent DNA mutations, including base substitutions, frame-shift mutations, gross chromosomal rearrangements, and homologous/homeologous recombination, as well as nuclear DNA repair activity by combining the yeast chronological life span with simple DNA damage and mutation assays. The methods described here should facilitate the identification of genes/pathways that regulate genomic instability and the mechanisms that underlie age-dependent DNA mutations and cancer in mammals.

Studying Age-dependent Genomic Instability using the S. cerevisiae Chronological Lifespan Model

Here we describe a set of DNA mutation assays that can be combined with the yeast chronological life span model to study the genes/pathways that regulate or contribute to genomic DNA instability during aging.

를 사용하여 연령에 의존 게놈의 불안정성 유학 S. cerevisiae 연대기 수명 모델

Studies using the Saccharomyces cerevisiae aging model have uncovered life span regulatory pathways that are partially conserved in higher eukaryotes1-2. ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

성게 접합자의 높은 처리량 Microinjections

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;