실험실에서 연구 프리츠 - 벤더 재단, 뮌헨, 독일 (TD에)와 (W.-KL에) 위튼 / Herdecke 내부 연구비의 대학 재정 지원된다. 우리는 도움이 제안을 (생리학, 병태 생리 및 독성, 위튼 대학 / Herdecke 연구소) 교수 박사 박사 프랭크 Thévenod에게 감사의 말씀을 전합니다.

시약 및 솔루션 1. 준비 <ol><li> 수정 된 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 준비 (mm 단위 : 136.9 염화나트륨, 5.37의 KCl, 0.34 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17의 NaHCO3, pH를 7.2, 아니 페놀 레드). 4 ℃에서 보관. </li><li> 1.5 M CaCl2를 2 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) (pH를 7.2) 증류수 원액 만들기. </li><li> 프로 베네 시드의 250 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. ,, 1 N의 NaOH에 베네 시드 파우더를 녹여 증류수로 최종 부피의 3/4 채우고 천천히 1 N HCl로 pH를 7.4로 적정 유리 산 형태의 경우 (불용성으로 종종 지칭). 4 ℃에서 보관. </li><li> 1mM이 스톡 농도 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 형광 막 투과성 칼슘 결합 염료 녹인다. 어둠 속에서 -20 ° C에 보관하십시오. </li><li> 각 실험에 앞서, 갓 제조 베네 시드를 함유 H하여 BSS 플럭스 (PHF) 버퍼 (최종 농도) 1.5 mM의 염화칼슘 2, 10 mM의 HEPES, pH를 7.2, 5 % 소 태아 혈청, 2 MM의 프로 베네 시드, 및 5.55 mM의 포도당과 HBSS를 수정 결합하는. 37 ° C의 따뜻한. </li></ol> 2. 세포 배양 <ol><li> 표준 배지에서 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시의 웰 플레이트 당 2.5 × 10 5 신장 근위 세뇨관 세포 (c12에 WKPT-0293)과 약 70 % 포화 상태에 도달하는 2 일 동안 성장한다. </li></ol> 3. 칼슘 염료로드 <ol><li> 각 웰 또는 접시를 들어, 5 % 소 태아 혈청, 4 μM 세포 투과성 칼슘 결합 염료 및 2 밀리미터 베네 시드를 함유하는 1 ml의 배지를 섞는다. </li><li> 각 웰에 1 ml의 로딩 염료 혼합물과 배양 배지를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 형광 표시기의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버. </li></ol> Ce의 제 담유동 세포 계측법에 대한 LLS <ol><li> 37 ° C의 따뜻한 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 솔루션입니다. </li><li> 대기음 칼슘 로딩 염료 각 웰의 솔루션과는 우물의 벽을 따라 1 ml의 트립신을 추가합니다. </li><li> 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어. </li><li> 1 분 10,000 g에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 1.5 ML 튜브 및 펠렛 세포를 전송합니다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. </li><li> 로 pipetting 아래로 1 ML의 PHF 버퍼에 resuspend을 추가하여 세포를 씻으십시오. </li><li> 1 분 10,000 g에서 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> 반복 4.6 단계를 반복합니다. 4.7. 또 두 번. </li><li> 500 μL의 PHF 완충액 최종 부피 세포를 재현 탁하고, 1 시간 내에 실험에 셀을 사용한다. </li><li> 선택적 : 카운트 세포는 세포 농도를 결정하고, 5 × 104 사용할 - 측정 당 1 × 105 세포. </li></ol> 5. 흐름 CYT오 미터 설치 <ol><li> , 흐름 cytometer 시작 플루이 딕스 서랍을 열고 시스 유체 탱크의 공기 압력을 증가시키는 통기 밸브 토글 스위치 플립. </li><li> &quot;프라임&quot;내측 튜브 및 유동 챔버 내에서 잠재적 상주하는 공기 방울을 제거하는 기기. </li><li> 유동 세포 계측법 소프트웨어에서 열린 두 점 플롯 창. <ol><li> 첫 번째 점 플롯은 앞으로 각각의 크기와 입도 (granularity)를 통해 시료 내에서 세포의 품질을 제어 할 수있는 Y 매개 변수의 X 매개 변수 및 측면 산란광 (SSC)에 대한 산란광 (FSC)가 필요합니다. </li><li> 제 도트 플롯은 칼슘 - 결합 된 염료의 형광 강도를 측정한다. 리니어 스케일의 X 매개 변수에 대해 초 단위로 로그 스케일와 시간을 사용하여 Y 매개 변수에 대한 적절한 형광 검출 채널을 선택합니다. </li></ol></li><li> &#39;높은&#39;에 유량을 설정합니다. </li></ol> 6. 유동 세포 계측법 M전 측정 <ol><li> RT에서 측정을 수행합니다. 샘플 튜브 (11.5 X 75mm) 유세포에서, 480 μL의 PHF 버퍼를 추가합니다. </li><li> 혼합 20 μL 세포 현탁액 간략하게 소용돌이를 추가합니다. </li><li> 측으로 튜브지지 암을 이동시키고 기밀 밀봉이 형성 될 때까지 시료 주입 관을 통해 샘플 튜브를 위치. 원래 중심 위치로 튜브 지지대를 돌려줍니다. </li><li> 샘플의 평균 형광 강도가 약 10이 y 축상되도록 형광 채널을 조정하여 측정을 최적화. 저장하고 다음 실험을 위해 사용합니다. </li><li> 실험을 시작하려면, 반복은 6.3에 6.1 단계를 반복합니다. </li><li> 50 초 동안 기록 기준 형광. </li><li> 간단히 추가, 관심, 소용돌이의 화합물을 샘플 튜브를 제거하고 시료 주입 관으로 돌아가 측정을 일시 중지합니다. 이 단계는 15 개 이상의 초를 복용해서는 안된다. </li><li> 측정을 다시 시작하고 204.8 초 총 계속합니다. </li><li> 칼슘 사용 ionophore 같은 이오 노마 이신 (10 μM), 및 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA) 같은 칼슘 킬레이트 제, MnCl 2의 CoCl2 (2 mM)을 각각 양성 및 음성 대조군에 대한. </li></ol> 7. 데이터 분석 <ol><li> 이러한 WinMDI (유동 세포 계측법 용 Windows 다중 문서 인터페이스), 스크립스 연구소, 유동 세포 계측법 핵심 시설에 조 트로터가 개발 한 무료 소프트웨어 패키지와 오프라인 분석을 위해 전용 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다. </li><li> SSC와 FSC 매개 변수를 사용하여 도트 플롯을 엽니 다. </li><li> &quot;지역&quot;도구를 사용하여 분석을위한 세포의 지역을 선택 죽은 세포 또는 데이터 분석에서 왼쪽 하단에있는 세포 파편 (그림 1)를 제외 (이미지에 마우스 오른쪽 단추로 클릭). </li><li> 쿼드런트 분석 (그림 2) <ol><li> y 축상의 x 축과 형광 강도에 시간 밀도 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> 우리7.3과 동일한 게이팅 영역 전자. </li><li> &quot;사분면&quot;도구를 사용하여 데이터를 정량화. </li><li> 수직선은 화합물 첨가시에 놓이고 수평 라인이 대조군에서 기준선 형광의 중앙에 위치되도록 사분면 세퍼레이터를 조정. 사분면 구분의 위치가 모든 샘플에서 동일한 지 확인합니다. </li><li> 각 사분면에있는 세포의 비율은 각 모서리 (그림 2)에 표시됩니다. 샘플 사이의 사분면 (UR)를 비교한다. </li></ol></li><li> 히스토그램 분석 (그림 3) <ol><li> y 축상의 x 축 및 이벤트에 대한 형광 강도 히스토그램 창에서 제어 데이터를 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> 화보 개요, 오버레이 플롯으로 제어 플롯 (파일 → 오버레이 → 파일 열기 → 파일로 이동)에 비교하는 테스트 데이터를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 정량 분석​​의 경우, 하나의 히스토그램은 승리dows 사용해야합니다. 게이트 단계 7.3에서 영역 R1을 사용하여 세포 집단. </li><li> 비 처리 제어에서, 최대 형광 강도의 최소값과 제어 피크의 최대 형광과 끝점 사이 중간 지점에서 시작하는 분석 영역을 표시하기 위해 ( &quot;마커&quot;) 마커 기능을 사용한다. 이 영역에서의 세포의 비율이 계산된다. </li><li> 통계 창에서 데이터를 검색합니다. 분석을 위해 동일한 표시된 영역을 이용하여 데이터 파일을 나머지에 대해 반복. </li></ol></li><li> 형광 강도 분석 (그림 4) <ol><li> y 축상의 x 축과 형광 강도의 시간 도트 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다. </li><li> &quot;속도론 모드&quot;와 &quot;오버레이 속도론 라인&quot;을 사용합니다. 파란색 선은 평균 형광 강도를 나타내는 도트 플롯에 나타납니다. </li><li> 여러 사각형 영역을 만들어 상대 칼슘 유입을 정량화. 각 지역은 아 있어야한다&quot;10 초&quot;에 해당 &quot;50&quot;, 약 idth. 15 사각형 영역을 정의. </li><li> 통계 창에서 정량화를 검색하고 스프레드 시트에 복사합니다. </li><li> 분석을 위해 Y-평균 데이터를 사용합니다. 20 초 50에 해당 R6에 R2의 평균을 계산합니다. 이 기준값이다. </li><li> 칼슘 유입 분석 (발병, 기간 및 강도에 따라 다름)에 대한 적절한 시간 간격을 선택합니다. </li><li> , 평균 기준값이 시간 간격 내에서 상대 100 %로 설정되는 화합물을 첨가 전에 즉, 형광 신호를 각 영역에서의 칼슘 신호를 계산한다. 화합물 첨가를 게시 평균 및 표준 편차의 영역을 결정하고; 이 화합물에 의해 유발 된 평균 칼슘 신호이다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

칼슘은 제 메신저 신호 전달 분자로서, 또한 ER 및 미토콘드리아 사이에서 통신하기위한 수단으로 작용하는 다수의 세포 과정에 키 이벤트이다. 자유 세포질 칼슘 농도의 변화를 측정하는 능력은 세포 생물학의 모든 영역에 적용 할 수있는 유용한 기술이다. 사이토 졸 칼슘 신호를 검출하기위한 다양한 방법이있다. 고전 등의 Fura-2와 같은 칼슘 비율 계량 표시기로부터의 신호는, 형광 촬상 설정 ?...

칼슘은 세포 생리 및 병리 생리 학적 신호 (1)의 전송을 담당하는 중요한 초 메신저. 세포질 칼슘 농도는 칼슘 펌프 및 칼슘 교환기의 활성을 낮게 유지된다. 근질 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA)는 ATP 의존적 방식 모두에서 세포막 칼슘 ATPase를 (PMCA)는 세포 외 구획 칼슘 압출 반면 &quot;펌프 누출&quot;시스템의 일부로서 소포체 (ER) 칼슘 저장소 리필 2. 이러한 호르몬 또는 신경 전달 물질과 같은 생리 메신저, G 단백질 커플 링 수용체, 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 트리 포스페이트 (IP3) (3)를 생성하는 세포막에 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PIP2)을 가수 분해 포스 포 리파제 C의 활성화를 통해 신호를 전송한다. 디아 실 글리세롤은 세포막에 남아있는 반면, IP3은 세포질 내로 확산되어 IP3 수용체에 결합ER 막과 칼슘에서 발견 리간드 칼슘 채널 활성화의 (IP3Rs)는, 세포질 칼슘 농도 4의 증가에서 남중 소포체 내강 저장소에서 해제됩니다. 세포질에 도달하는 칼슘 대체 경로는 세포막에 존재하는 칼슘 채널 교환기 통해서이다. 이 두 구획 사이의 크로스 토크 설명 하였다 : 칼슘에 의한 칼슘의 세포 외 칼슘이 ER 저장 5에서 칼슘 방출을 유도 릴리스 (CICR), 저장이 STIM에 의해 감지 된 ER 저장 비우는 칼슘 항목 (SOCE)를 운영하고 Orai의 개방 원인 세포막에있는 칼슘 채널 ER 저장소 (6)의 재 충진을 촉진. 병태 생리 학적 조건 하에서, 세포 칼슘 응답 생리적 자극 (1)의 부재하에 탈과 사이토 졸 칼슘 증가이다. 칼슘 응답은 다수의 방식으로 영향을받을 수있다 : 칼슘 장기간신호, 세포질에서 칼슘 제거, 칼슘 저장 또는 칼슘의 지역화 변경의 고갈을 지연. 또한, 미토콘드리아는 버퍼링의 중심 역할을 수행하고 칼슘 (7)을 발표. 장기간 및 / 또는 supramaximal 세포질 칼슘 증가는 죽음을 셀에 연결됩니다. 사실, 칼슘보다 종종 셀룰러 병태 생리 학적 반응에 관여하며, 주로 세포 사멸과 관련된 신경 퇴행성 질병, 심장 질환, 암, 골 질환 및 신장 질환과 같은 질병의 광범위한 배열의 키 이벤트하지보다 손실 또는 장기 나 조직 기능 8-10의 변화와. 또한, 칼슘 신호의 섭동 셀룰러 적응 및 세포 기능과 응답의 변화에​​ 연결되었다. 전통적으로, 칼슘 신호는 세포 투과성 아세 (AM) 에스테르 형태로 세포 내로로드 음전하 형광 칼슘 지표로 측정된다. 일단 세포 esteras에 의해 절단ES, 형광 지표 세포 내 구획 내에 남아 칼슘이 결합하면 형광 강도의 증가. 가장 잘 알려진 및 사용 칼슘 표시기는 비율 계량의 Fura-2 로저 첸과 동료 (11)에 의해 개발되고있다. 칼슘 : 서로 다른 친화력과 칼슘 지표는 다른 칼슘 풀을 모니터링 할 수 있습니다. 검출 방법은 살아있는 세포 이미징, 형광 마이크로 플레이트 리더를 포함 유동 세포 계측법. (일반적으로 분 몇 초 이내) 칼슘 신호의 상대적으로 빠른 반응 속도는 칼슘 신호의 특성에 대한 대부분의 정보를 얻는 가장 좋은 방법 이미징 살아있는 세포를 만든다. 이외에도 (밀리 초 이내) 칼슘 신호의 빠른 동역학에서, 생균 이미징은 단일 셀 (12) 내 칼슘 신호 전달의 셀룰러 구획화를 연구하기위한 더 나은 방법이다. 절대 칼슘 농도는 칼슘 산업사의 최소 및 최대 형광을 결정함으로써 계산 될 수있다Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 각각 칼슘 킬레이트 제를 첨가하고 세포를 permeabilizing 의해 icator. 칼슘 신호를 측정하기 위해 유세포의 사용은 제 기회는 막 무결성 및 세포 집단을 분리하고, 단일 파장의 개발과 결합 현탁액 중의 세포의 요건과 같은 여러 파라미터를 측정하는 위치를 면역 세포에서 1980 년대에 개발 된 칼슘 지표는 이상과 convenientdetection 방법 13-15 유동 세포 계측법을했다. 부착 세포에서는 생균 이미징 칼슘 시그널링, 가장 중요한 키네틱 관한 대부분의 정보를 제공하지만, 취득하는 온도 등의 형광 현미경, 관류 시스템, 셀룰러 환경의 유지를 포함하는 복잡한 설정 및 특수 현미경 소프트웨어가 필요 데이터 분석. 이러한 형광 마이크로 플레이트 리더 또는 pharmacol 등의 다른 방법칼슘 킬레이트의 사용을 통해 ogical 수단이 얻은 정보의 측면에서 비교할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 더 넓게, 대부분의 연구에 불구하고 측정이 수행되는 경우에만 최종 점 접착 세포에서 사이토 졸 칼슘을 모니터링하는 데 사용되어 가고있다. 초기 게르 겔리 등의 문헌에 의해 개발 된 방법을 사용. 면역 B 세포 (16)에 실시간 속도론과 유세포 및 샘플 모집단 개별 셀에서 형광 강도를 모니터링하여 세포질 유리 칼슘 농도의 변화가 성공적 경부암 상피 세포에서 측정 된 암 줄기 세포는 17 잡종. 이 방법은 더 칼슘 지표 (18)로드하기 어려운 부착 상피 세포에 사용하기 위해 적응했다. 여기서, 쥐 신장 근위 세뇨관 (c12에 WKPT-0293) (19)의 S1 세그먼트로부터 유도 된 무한 증식 자기편 상피 세포주를 사용하여, 우리는 최적의 간략화를 설명 m유동 세포 계측법에 의해 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 ethod. 많은 상피 세포는 음이온 성 화합물에 대한 유기 운송의 번호를 가지고 있기 때문에, 칼슘 표시기 세포의 로딩은 도전이 될 증명할 수 있습니다. 칼슘 지표, 프로 베네 시드, 페니실린 (20)의 신장 배설을 감소하기 위해 개발 된 원래 원형 유기 음이온 수송의 억제제와의 유출을 방지하기 위해, 배양 매체에 동시에 적용된다. 세포는 칼슘 인디케이터 로딩 단층 유지 화합물 첨가 후 즉시 검출 할 수 현탁액 칼슘 신호로된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

세포질 칼슘을 증가시키기 위해, 두 약물 화합물은 세포 투과성 칼슘 결합 염료, FLUO-3-AM로드 신장 근위 세뇨관 세포 (WKPT-0293 c12에)에 적용되었다. Nontreated 대조 시료는 베네 시드의 존재하에 칼슘 결합 염료로드 된 혼합 그러나 어떤 화합물의 첨가없이 하였다. 쌥시 가르 긴 (TG)는 ER에서 누출로 이어지는 증가 세포질 칼슘의 결과로 SERCA 펌프의 고전적인 억제제이다. Tunicamycin (TUN) 블록 펼쳐진 단백...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K 조회수.  University of Witten/Herdecke.  칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다. 

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IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

연구

생물학

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA 정제에 의한 염색질 절연 (처프)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

격리 된 괴 경 Protoplasts의 Cytometry에 의해 측정 Endoreduplication

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Flow Cytometry 여 Dictyostelium discoideum Macropinocytosis의 높은 처리량 측정

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

유세포분석으로 생체내 단백질 자가 조립 검출 및 특성화

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...