Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.

프로토콜은 세 가지 주요 단계로 구성된다 : 첫 번째 단계는 배양 배지에서 복합재 추출물의 제조를 포함하며; 두 번째 문제 기본 인간 치은 섬유 아세포 (HGF) 세포 배양, 복합 추출물과 세포 염색 세포의 접촉; 세 번째 단계는 공 초점 이미징 및 형광 신호 분석으로 구성되어 있습니다. 치은 조직을 복용의 경우, 프로토콜은 프랑스 법, 동의서 및 지역 윤리위원회 준수 승인을 받았다. 1. 복합 추출물 준비 용출 매체로 둘 베코의 변형 이글 배지 (DMEM)를 사용합니다. 시험편의 표면적과 추출 매질의 부피의 비는 ISO 12분의 10,993 요구 최하위 레벨인지 확인. 절차는 최근 11 기재되고 아래 간단히 요약된다 : <ol><li> 맞춤 보류를 경화 치과 복합의 구형 샘플 양식어. 홀더 크기는 경구 임상 치료에 일반적 의뢰 경화 깊이에 따른 것이다 반경 2mm이다. </li><li> 웰 플레이트를 준비, 5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 암포 테리 믹스 1 %로하지만 소 태아 혈청 (FBS)이없는 배지의 각각 함유하는 1 ㎖ (DMEM). </li><li> 40 초 동안 1,070 메가 와트 cm -2 강도 (λ = 465-475 ㎚)와 LED 조명 램프를 사용하여 잘 포함하는 DMEM 배지 내에서 치료 샘플. 경화 팁과 시료 사이의 거리가 0.5 mm의 범위 인 것이 확인. 치아와 경화 치과 복합의 차이 인 일시적 접촉을 시뮬레이션이 경화 모드를 사용합니다. 보철 복합체 구강에 배치 될 때 임상 적 상황에서 접촉이 발생한다. </li><li> 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 37 ° C에서 샘플 (DMEM 배지에서 복합 표본) 부화. 동일한 조건에서 대조군 세포에 대한 (합성 샘플 없음) DMEM 배지를 배양하라. </li></ol> 2. HGF 세포 배양, 복합 추출물 테스트 및 세포 염색 <ol><li> 성장과 세포 배양의 유지 보수 일상적인 교정 추출 동안 촬영 환자의 건강한 치은 조직 생검에서 인간 치은 섬유 아세포를 분리합니다. <ol><li> 10 % FBS의 존재하에 DMEM 인간 치은 섬유 아세포를 배양, 5 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 1 % 암포 테리 B. 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기 하에서 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li><li> 변경된 매체 매 3 일, 그리고 통과 세포 5 일마다. 트립신에 의해 포화 상태, 수확 세포에 도달 한 후. </li><li> 5 분 90 XG에 원심 분리기 세포 배양 배지에서 그들을 다시 일시 중지합니다. 홀 핸드 헬드 자동 세포 계수기로 세포를 계산합니다. </li><li> 챔버 슬라이드 시스템에서 2.5 × 104 세포 / ml의 세포 밀도로 시드 세포 현탁액. 5 %의 분위기하에 밤새 37 ° C에서의 세포 배양을 허용. </li></ol></li><li> 문화의 세포에 복합 추출물의 첨가 <ol><li> (배양 24 시간 후) 시험 복합 추출물 1 ㎖에 의해 챔버 슬라이드의 두 우물의 용지를 교체하십시오. </li><li> 동일한 조건에서 남은 두 웰 (대조군 세포)를 유지한다. </li><li> 공기 중 5 % CO 2의 가습 된 분위기하에 인큐베이터에서 37 ° C에서 네 개의 우물을 포함하는 챔버 슬라이드를 부화. </li></ol></li><li> 형광 염색 제조업체의 지침에 따라 진핵 세포의 라이브 / 죽은 세포 독성 얼룩을 사용합니다. NOTE는 : 키트 세포막 무결성 및 에스 테라 제 활성에 기초하여 집단에서 세포의 생존 능력을 결정하기 위해 빠른 2 색 형광 분석을 제공한다. 얼룩은 membran의 세포 내 에스 테라 제 활동과 빨간색 형광 에티 디움 호모 다이머-1 (EthD-1) 표시하기 위해 손실을 나타 내기 위해 동시에 녹색 형광 칼 세인 AM과 라벨에 의해 손상된 세포에서 라이브 구분전자의 무결성. <ol><li> 칼 세인 오전 2 μM 4 μM EthD-1 (섬유 아세포 염색에 적합한 것으로보고 최종 농도)를 포함하는 두 개의 염색 시약의 작업 솔루션을 준비합니다. 선택된 복합재 추출물의 존재 또는 부재하에 배양 된 세포에 부착 얼룩을 추가한다. </li><li> 염색 후 시간 경과 영상을 통해 최소 15 분에서 직접 신속하게 염색 된 세포 집단을 준수하십시오. 하지 원심 분리기를 수행하고 염색 된 세포를 픽스하지 않습니다. </li></ol></li></ol> 3. 공 촛점 시간 경과 이미징 및 신호 분석 사용 된 시스템은 네 개의 다이오드 레이저 장치와 각 시험편에 대한 최대 네 개의 형광 염료에 대한 멀티 - 얼룩진 화상을 갖추고있다. 시스템은 하나이자 (600X 배율)의 영역을 관찰 이동할 수있는 시료의 개요를 제공 매핑 화상 (10X 배율)을 수행 할 수있다. <ol><li> 시간 경과 영상 <ol><li> 의 배치pecimens는 공 초점 통합 보육의 어두운 방 (챔버 슬라이드 스테인드 샘플을 포함) (37 ° C, CO 2 다습 한 분위기의 5 %). </li><li> 해당 레이저를 선택합니다. 칼 세인과 EthD-1을 자극하는 두 개의 레이저 소스를 473 나노 미터 (15 MW) 및 (559) 뉴 멕시코 (18 mW의)를 사용합니다. </li><li> 두 사용되는 형광 염료로 이미지에 혼선없이 라인 시퀀스를 통해 이미지를 수집하기 위해 두 개의 연속 모드를 사용합니다. </li><li> 자동 주사 유닛의 형광 염료에 따라 조건을 설정하기 위해 새로이 개발 된 스펙트럼 검출기를 사용한다. </li><li> 최대 채널별로 검출 된 형광의 대역폭을 최적화. 기록 모든 인수는 순차적으로 잠재적 교차 이야기를 방지 할 수 있습니다. </li><li> 수집 소프트웨어를 이용하여 형광 염료 선택에 기초하여 최적의 촬상 조건을 선택한다. </li><li> 자동 나선형 패턴의 중심에서 생성되는지도 화상을 취득관심 영역 쉽게 자세히 살펴보면 선정된다. </li><li> 선택 관찰 모드. 시간 경과, Z-스택, 필요에 따라 여러 영역을 포함하여 관찰 모드의 다섯 가지 유형까지 선택합니다. 본 연구에서 Z-스택 및 시간 경과 모드의 조합을 사용하여 신속하게 이미지 캡처를 완료 </li><li> 변경 및 형광 염료를 전환합니다. 대안 적으로, 형광 및 서로 광 콘트라스트 이미지를 오버레이. 왼쪽 아래지도 화면에서 선택한 지점을 사용하여 라이브 이미지를 관찰합니다. </li><li> 프레임을 사용하고 기능을 확대하여 이미지 영역을 결정합니다. 선택적으로, 형광 염료의 종류마다 표시 전환. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 현미경은 컴팩트 한 디자인에 높은 기존의 공 초점과 같은 기능이 있습니다. 현미경 최적 단순화 내장 인큐베이터와 살아있는 세포의 안정 시간 경과 영상에 적합 거꾸로 물 침지 목표를 갖추고 있습니다. </lI&gt; </ol></li><li> 신호 분석 및 정량화 <ol><li> 형광 신호를 정량화하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 모두 테스트 샘플 및 세포 제어를위한 10 배 목적으로 다섯지도 이미지를 가져옵니다. </li><li> 0.231 μm의 × 0.231 μm의 픽셀 크기, 1,024 × 1,024 픽셀 정기적 인 이미지를 획득. 신호 분석을위한 올림푸스의 이미지 포맷 (OIF)로 화상을 저장합니다. 이 형식은 함께 다양한 파라미터 설정과 이미지를 저장 할 수 있습니다. 다른 분석 도구 (강도 프로파일의 측정, 두 사용되는 채널 사이의 강도 비)를 사용합니다. </li><li> 12 비트 / 픽셀 TIFF 파일로 최대 투사 이미지를 저장합니다. </li><li> R 지휘관 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 프리폼. 반복 시험과 분산 (ANOVA) 단방향 분석을 사용하여 차이점을 분석한다. 보고서는 (± 표준 편차) 등의 평균 표준 편차 P &lt;0.05에서 통계적으로 유의 한 결과. </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests, they have nothing to disclose.

생체 적합성 물질의 동작은 의료용으로 평가하는 가장 필수 파라미터이다. 국제 표준은 의료 기기 ISO를 10993 33 특히 치과 재료 ISO 7405 (34)를 커버한다. 주변의 세포 독성 효과의 부재는 재료의 생체 적합성 평가의 핵심 표준이다. 37 - 세포 독성 시험은 치과 재료의 생체 적합성 (35)의 평가에서 이러한 중요성을 가지고 이유입니다. ISO 테스트 방법은 신진 대사 활동 또는 막 무결성을 기반으로 할 수 있습니다 제안했다. 선택된 엔드 포인트는 시간과 평가 분석의 비용을 최소화하기 위해 시험 물질에 의해 유발 된 부작용의 순위에 대한 구체적인 조건을 따라야한다. 조사의 현재 방법 (3D 공 촛점 시간 경과 영상)을 기반으로 막 무결성. 이 엔드 포인트를 통해 세포 독성 평가는 세포 biocompa의 중요한 지표가 될 것으로 보인다테스트 자료와 그것이 가진 tibility 또한 ISO는 엔드 포인트를 승인했다. 시험관 시험 물질 샘플이 특정 세포 유형에 영향을 미치는 방법을 결정하기 위해 설계되었습니다. 비색 MTT 분석은 원래 시험 관내 세포 독성 및 세포 증식의 측정에 유용한 방법으로서 (1983) 모스맨 의해 설명 하였다. MTT 시험 미토콘드리아 활성을 결정 활성 셀에 의해 포르 마잔 결정으로 테트라 졸륨 염 변환에 기초한다. 이것은 생존률 (38)에 의해 번역 될 수있다. 굽​​타 및 공동 작업자 MTT 시험 복합 수지의 세포 독성을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이다보고. 숙신산 탈수소 효소 알칼리성 포스파타제 및 응답은 또한 동일한 목적 (39)을 위해 사용되어왔다. MTT 분석법은 각 측정 시점에서 세포를 죽이는 필요하기 때문에, 세포의 운명, 추적 할 수 없다. 현재 연구에서 더욱 밀접하게 염색 된 세포의 동작을 모니터링하기 위해, 다이에살아있는 세포의 RECT 관찰, 짧은 프로토콜 염색, 자동 이미지 분석 및 형광 신호의 정량화와 함께 시간 경과 CLSM 영상 덕분 하였다. 치과 복합 재료는 구강 조직, 특히 잇몸과 치수의 세포에 밀착되어 있습니다. 41 - 섬유 아 세포는 이러한 회복 복합 재료 (40)로부터 방출 구성 요소의 대상이 될 것입니다. 또한, 여러 연구는 불후의 세포 및 일차 전지는 생체 물질과 접촉하는 다른 세포 반응이있을 수 있다고보고있다. 일차 세포는 생체 물질 (42) 효과를 평가하기 위해 더 적절한 것으로 밝혀졌다. 이것은 현재 연구에서 시험 치과 복합체의 세포 독성 평가를위한 세포 모델로서 일차 인간 치은 섬유 아세포 세포의 사용을 설명한다. 44 - 치과 복합체로부터 방출 물질의 독성 전위는 43 널리 검토되고있다. t를 평가하기 위해서그 물질의 잠재적 인 세포 독성, 두 콘택트 모델 셀은 수행 될 수있다. 간접 접촉 시스템에서, 세포 생물학 미디어에서 용출과 접촉하는 동안 대상 직접 접촉 모델 시스템에서 물질을 직접적으로 표적 세포로 배치된다. 임상 적용 및 회복 절차, 치과 복합은 치은 조직과 간접 접촉에 배치됩니다. 이러한 이유로, 현재의 실험 프로토콜 (시험 복합 추출물의 존재하에 세포) 인간 치은 섬유 아세포와 간접 접촉 시스템에 집중 하였다. 이전 달과 공동으로 보도 된 바와 같이, 세포 독성 반응은에 활동 기준에 따라 &lt;(90 %), (30 % 중간 (30~60%), 약간 (60~90%) 또는 비 세포 독성)&gt; 심한 위를 차지했다 값은 컨트롤 (45)에 대한 취득. 따라서, 얻어진 결과의 빛 (표 1)이 순위에과에 따라, 복합 ELS 여분의 낮은 수축 VER로 선정 될 수있다Y는 약간 세포 독성 및 전체 시간 경과 기간 동안 세포를 제어하는​​ 비교 동작을 나타내었다. 정확하게 동일한 방법을 이용하여 조사, 본 연구의 결과는 최근 발표 된 연구와 비교 될 수있다. ELS 여분의 낮은 수축 복합은 직접 복원 11 같은 임상 응용 프로그램에 사용되는 두 개의 이전에 테스트 복합 재료에 비해 우수한 생체 적합성을 보여 주었다. 추가적인 연구는 더욱 완전한 비교를 설정할 필요하다. 특정 종말점 평가를 승인하는 세포 독성 분석을 결정할 때, 그 장점과 각 분석의 한계를 이해하는 것이 중요하다. 공 촛점 이미지의 주된 목적은 세포 및 기관의 3-D 구조를 달성하는 것이다. 이 기술은 시료의 표면뿐만 아니라, 그 표면 아래뿐만 아니라 공개 할 수있다. 본원에 기재된 프로토콜은 SENSI로서, 3D CLSM 시간 경과 촛점 이미징의 사용을 강조적인 방법은 치과 복합 체외 생체 적합성 동작을 평가한다. 그러나,이 연구에서 발생 한계를 피하기 위해, 진동 방지 워크 스테이션은보다 안정적이고 장시간 경과 이미징을 허용하기 위해 사용될 수있다; 탁상용 실험실에서 진동이 발생할 수 있음 해로운 영향에서 사용 된 공 초점 시스템을 분리 할 수​​ 있습니다. 또한, 재료는 이상적으로 치은 조직에 무해해야한다 구강에 사용되는 전신 독성을 일으킬 수있는 물질이 포함되어야합니다. 사용 방법에 따라서, 현재의 연구에서 얻은 결과 그것은 테스트 복합체 (ELS 여분 낮은 수축율) 본 실험 조건에서 세포 독성이되지 않는다는 결론을 내릴 수있다. CLSM 방법 민감 생존 세포의 초기 속도를 제공 할 수 있듯이, 다른 가능성은 더 많은 엔드 포인트를 평가하기 위해 예상 될 수있다. 특히, 최근보고 된 바와 같이 합성 모노머 THR 세포에 영향을 미친다깨닫지 못하고 있거나 남의 반응성 산소 종 (ROS) 46- (48)가, 추가 조사는 세포 독성 사이는 네트워크 및 ROS 생성을 시그널링하는 경우 상관 관계를 평가하기 위해 필요하다. 미래의 프로토콜을 동시에 ROS 생산을 평가하기 위해 (H 2 O 2 및 / 또는 O 2 - 염색) 설계 될 수 있으며, 시간 경과 CLSM 영상을 사용하여 세포 독성 비 (라이브 / 죽은 염색).

생체 적합성을 정의하는 ISO 권고에 인용 주요 표준 중 하나는 세포 독성 물질의 부재이다. 수지 기반 치과 복합 시간이 1-4 이상 및 / 또는 이상에 의한 분해 과정에 대한 부분 중합 초기에 기인 할 수있는 수지 매트릭스의 구성 요소를, 공개 할 수 있습니다. 이 발표 구성 요소는 구강 조직에 접촉 및 두드러기 및 점막 반응 5 명 6 알레르기 및 과민 반응의 개발, 미토 겐에 유형에 대한 치은 섬유 아세포의 형태와 감소의 수정 I 콜라겐 단백질 (7), 면역 억제 또는 면역 자극 같은 다양한 단점을 가질 수있다 자신의 유전 독성 가능성 (9)을 강조 정제 T 림프구 및 비장 세포 (8) 및 기본 인간 치은 섬유 아세포의 DNA 손상 구동 형 확산. 대부분의 매개 변수는 C의 그늘로 치과 복합 독성에 영향을 미칠 수omposite, 광 경화 수지 단량체의 화학 성분, 충전제 및 전환 10- (13)의 정도. 재료의 시험 관내 독성 생체 전위 상황에서 예측할 수 있고, 일부 관련 엔드 포인트의 연구에 의해 임상 적 상황과 비교 될 수 있기 때문에. 치과 복합 재료 및 그 구성 요소의 세포 독성 널리 세포 배양 시스템 14- (16)으로 평가하고 있었다. 이러한 체외 시스템의 용어에 치과 복합 생체 적합성을 평가하기 위해 개발되었다 : 세포 성장, 세포 사멸 세포 (17)와 같은 THP-1monocytes를 사용하여, 인간 치은 섬유 아세포 (18)의 세포 독성, HaCaT에 염증 가능성이 세포 2, 세포 기능처럼 각화 odontoblast- MDPC-23 세포 (19), 총 RNA 수준의 감소, 인간 치은에 세포 사멸 유도에 크게 증가처럼 각화 20치은 및 펄프 섬유 아세포 세포 (21)에 대한 DNA 손상. 다른 방법은 치과 복합 재료의 생체 적합성을 조사하기 위해 제안된다. 특정 착색제 및 광 흡착 측정을 포함 비색 분석법, 그들의 상대적인 단순성 및 저가 22- 26, 가장 일반적으로 사용 남아있다. 광에 의한 콘트라스트 현미경 분석은 종종 더 많은 시간을 소비하며 비용 증가를 초래한다. 그러나 이러한 현미경 기술은 몇 가지 중요한 장점이있다. 셀 구조의 관찰하여보다 적절하고 중요한 데이터를 제공, 경험 독성 효과에 대한 확장 정보를 제공합니다. 특히, 공 초점 현미경 (27)의 도입은 기존의 와이드 필드 이미징 형광 현미경에 비해 축 방향의 해상도를 향상시키는 생물학적 구조의 관찰을 허용했다. 따라서, 공 초점 이미징의 다양한 분야에서 강력한 조사 도구가되었습니다의료 및 과학 연구. 전자 현미경 기술과 대조적으로, 스캐닝 공 초점 현미경은 특정 형광 마커의 혼입에 의해 세포의 별개의 구성 요소를 시각화 할 수있는 능력을 제공한다. 이들 특정 트레이서 대부분 임상에서 사용뿐만 아니라 실험실 연구 연구를 허용, 수성 환경에서 안정한 띌 측정, 저렴하고 28 무독성이다. 또한, 종래의 전자 현미경 분석에 필요한 시료 건조 및 고정 시간 경과 촛점 이미징을위한 필요가없고, 따라서 시간에 따라 획득 된 샘플에 또한 가능하다. 이차원 촬상에 비해 공 촛점 촬상 원리 시편 지하 시각화 및 상이한 깊이 얻어진 이미지에서 입체 구조의 재구성을 가능하게; 초래되는, 더 정확하고 더 세부 구조 (29), (30). 본 연구는 비디오 입체 타임 랩스 C의 사용의 예이다혁신적인 방법으로 라이브 / 죽은 형광 표지 및 신호 정량화와 결합 onfocal 레이저 스캐닝 현미경 (3D-CLSM). 이 논문에서 제시된 기술은 평가 된 셀 구조를 변경하지 않고 생균의 민감한 평가 및 시간 경과 이미징을 가능하게하는 장점을 갖는다. 어떤 준비 단계는 공 초점 분석하기 전에 필요하지 않습니다. 이전에는, 동일한 염색 배양 해면골 코어 (31)의 가능성을 평가하기 위해 다음의 촛점하지만 경과하지 않고 사용 하였다. 마찬가지로 동일한 시간 경과 촛점 절차 / 특정 박테리아 라이브 죽은 염색법을 사용하여 그람 형태 32에 따른 활성 슬러지의 박테리아 에리스로 시간 - 명 활성을 평가하는데 사용 하였다. 이들 방법은 최근에 적응 및 메타 크릴 레이트 단량체 11에 기초 치과 복합 독성을 비교하기 위해 사용되어왔다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Olympus Fluoview FV10i&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">O2/Co2 Incubator</td>
			<td style="width:71px;">Pnasonic</td>
			<td style="width:119px;">MCO 5M</td>
			<td>Cell incubation</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Live/Dead&#174; Kit</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">MP 03224</td>
			<td>Stain&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ELS extra low shrinkage&#174;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Saremco&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Dental composite</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM medium</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D 6046</td>
			<td>Culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1426</td>
			<td>harvesting cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">chamber slide system&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">14220040X</td>
			<td>Culture chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Amphotericin B</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">P11-001</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Foetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:71px;">PAA</td>
			<td style="width:119px;">A11-101</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell Counter</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">00110230TP1</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal time lapse imaging as an efficient method for the cytocompatibility evaluation of dental composites

그것은 일반적으로 시험 관내 세포 물질의 상호 작용은 치과 용 재료, 생체 적합성의 평가 기준이 유용한 것을 허용한다. 이 연구의 목적은 치과 복합 재료의 생체 외 생체 적합성을 평가하기 위해 3D CLSM의 시간 경과 공 촛점 이미징을 사용하는 것이 었습니다. 이 방법은 치과 복합 추출물과 접촉 생존 세포 비율의 정확하고 민감한 표시를 제공한다. ELS 여분의 낮은 수축, 직접 복원에 사용되는 치과 복합체는, 예를 들어 촬영되었습니다. 시험관 평가는 라이브 / 죽은 염색을 사용하여 배양 주 인간 치은 섬유 아세포에서 수행되었다. 이미지는 FV10i 공 초점 생물학적 반전 시스템으로 얻은 FV10-ASW 3.1 소프트웨어로 분석 하였다. 이미지 분석은 시간 경과 5 시간 후에 시험 복합체의 존재 하에서 아주 약간의 세포 독성을 보였다. 세포 생존의 약간의 감소는 시험 복합 추출 비교 예와의 접촉에 나타내었다에드 셀을 제어 할 수 있습니다. 결과는 정 성적 및 정량적으로 치과 복합 재료의 생체 적합성을 평가하기위한 동작 감지 방법으로서 3D CLSM 시간 경과 이미징의 사용을 강조.

그림 1은 제어 및 시험 복합 추출물 (ELS 여분의 낮은 수축)에 노출 된 세포를 모두 얻을 매핑 이미지 (10 배 목표)의 라이브 / 죽은 염색 된 세포의 개요를 보여 주었다. 세포의 삼차원 구조는 배율 600X에서 시각화 될 수있다. 제어실과 시험 복합 추출물의 존재 하에서 챔버 내에서 수집 된 세포의 수집 세포의 가시화는도 2에 제시되어있다. 최대 돌기 (대물 60X)는 시간 경과의 시작에서 선택된 세포 집단의 운명을 도시 (15 분에서)와 시간 경과 기간 말 (5 시간에). 이미지의 쉰 일곱 스택 (xyzt 모드 스캔, 스택 당 39 이미지, 복셀 깊이 1.00 μm의)는이 기간 동안 얻었다. 적색 형광에 녹색 형광 신호에 약간의 감소와 아주 약간의 변화는 노출 된 세포에서 얻어졌다. 유의 한 변화는 제어를 위해 관찰되지 않았다세포. 복합 추출물 노출 된 셀들은 셀을 제어하는​​ 스핀들 유​​사한 형태를 상정; 형태는 (녹색 신호 감소 및 테스트 복합체의 존재에 빨간 신호 증가에도 불구하고)이 실험 조건에서 변경되지 않았습니다. 이미지 분석은 녹색​​ 및 적색 모두 신호에 대한 음성 대조군 세포에 비해 테스트 용 복합 얻어진 이미지에서 다른 세포 집단에 대응 선택한 5 개의 상이한 이미지 스택에서 수행 하였다. 염색 된 세포의 강도 프로파일은도 3에 도시되어있다; 테스트 복합체와 접촉 세포의 녹색 및 적색의 신호 발생이 대조군 세포의 것과 비교했다. 칼 세인과 EthD-1 형광 방출 강도는 대조군 세포에 노출 된 복합 세포에서 측정 하였다. 측정은 최대 5 시간 동안 한 시간 간격으로 행해졌 다. 녹색 495-515 나노 미터의 통합 강도와 붉은 620-650 nm의 신호에 따라 그린 / 레드 형광 비율 () 시간 경과 기간을 계산 하였다. ELS 여분 낮은 수축 추출물에 생존 제어용 비율과 노출 된 세포 일 수 T에 나타내었다. 시험 복합체의 존재 하에서, 생균의 비율이 1 시간 후 93.9 %로 100 % 약간 감소였다 접촉. 유의 한 차이는 지정된 시간 경과 기간의 5 시간 후에 시험 복합 (있는 복합 추출물이없는 세포) 음성 대조군 사이에 관찰되었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig1highres.jpg" /> 도 1 : 매핑 화상의 개요 시간 경과 시간 (t = 15 분)의 시작 부분에서의 복합 추출 (ELS 여분 낮은 수축)의 존재하에 대물 10X, (A) 대조군 세포와 (B) 세포에서 세포를 염색 하였다. 녹색 영역은 살아있는 세포이고 빨간색 지역은 손상된 세포이다. 이에실험 조건 (모두 녹색 및 적색 형광 용) 없음 변화는 대조군 세포에 비해 복합 노출 세포 관찰되었다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/51949/51949fig2highres.jpg" /> 도 2 (A) 제어실과 처음에 (B) 복합 추출물 챔버 및 노출 시간 경과 기간의 끝에서 세포 집단의 대물 60X에서 CLSM 이미지 (I : 15 분 및 II는 : 각각 5 시간, ). 녹색 영역은 살아있는 세포이고 빨간색 지역은 손상된 세포이다. 이미지의 패널은 강도 신호에 약간의 변화 (녹색 신호에 약간의 감소와 빨간 하나에 아주 약간의 증가)을 보여 주었다. 어떠한 세포 형태의 변화는 복합 추출물의 존재는 관찰되지 않았다; 대조군 세포로 자신의 스핀들 모양과 섬유 모세포의 형태를 유지하고 세포를 노출합니다. 그림 3 : 시간 경과 현미경에서 관찰되는 세포의 라인 프로파일 15 분 5 시간에서 (II)에서 (A) 대조군 세포 (B) 복합 추출물 노출 된 세포, (I).. 상관없이 테스트 복합체의 존재하에 녹색 신호 진화에 눈에 띄는 변화 없음 시간 콘택. 그러나, 적색 신호의 약간의 증가는 접촉 5 시간 후에 복합체의 존재가 관찰되었다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 접촉 시간 (시간) </td><td colspan="5"> 세포 생존율 (%) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td><td> (5) </td></tr><tr><td> 제어 셀들 </td><td> (100) </td><td> (100) </td><td> 100 &lt;/ TD&gt; <td> (100) </td><td> (100) </td></tr><tr><td> ELS 여분의 낮은 수축 ® </td><td> 93.9 ± 7 </td><td> 91.3 ± 5 * </td><td> 89.5 ± 3 * </td><td> 87.6 ± 2 * </td><td> 87.7 ± 3 * </td></tr></tbody></table> 표 1 :. 복합 추출물 세포 생존 접점 1, 2, 3, 4, 5 시간 후 살아있는 HGF 세포 진화의 평점 라이브 / 죽은 세포 독성 키트를 사용하여 염색하여 분석 하였다. 다섯 이미지의 SD 분석 스택 ± 데이터는 평균 값을 보여줍니다. 값은 p &lt;0.05에서 대조군 세포와 크게 다르다.

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Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다.

치과 복합 재료의 Cytocompatibility 평가하기위한 효율적인 방법으로 공 촛점 시간 경과 영상

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

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Research

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Medicine

13.4K 조회수.  UMR CNRS 5615, Université Lyon1.  치과 복합 재료의 생체 적합성 연구의 대부분의 측면은 형광 신호의 정량화와 결합 된 세포 독성 3D CLSM 시간 경과 영상은 시간이 지남에 따라 세포의 운명의 민감한 평가할 수있다. 이 방법을 활용하여 치과 복합 재료의 cytocompatibility을 평가하는 효율적인 도구가 될 수 있습니다. 

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Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Intravital 이미징을 사용하여 실시간으로 종양의 Nanoparticle의 이해 평가

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

연구

의학

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and highly vascularized, making it an ideal system for tumor implantation. Furthermore, the CAM contains extracellular matrix proteins such as fibronectin, laminin, collagen, integrin alpha(v)beta3, and MMP-2, making it an attractive model to study tumor invasion and metastasis. Scientists have long taken advantage of the physiology of the CAM by using it as a model of angiogenesis. More recently, the CAM assay has been modified to work as an in vivo xenograft model system for various cancers that bridges the gap between basic in vitro work and more complex animal cancer models. The CAM assay allows for the study of tumor growth, anti-tumor therapies, and pro-tumor molecular pathways in a biologically relevant system that is both cost- and time-effective. Here, we describe the development of CAM xenograft model of hepatocellular carcinoma (HCC) with embryonic survival rates of up to 93% and reliable tumor take leading to growth of three-dimensional, vascularized tumors.

The In Ovo Chick Chorioallantoic Membrane CAM Assay as an Efficient Xenograft Model of Hepatocellular Carcinoma

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is immunodeficient and highly vascularized, making it a natural in vivo model of tumor growth and angiogenesis. In this protocol, we describe a reliable method of growing three-dimensional, vascularized hepatocellular carcinoma (HCC) tumors using the CAM assay.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

The chick chorioallantoic membrane (CAM) begins to develop by day 7 after fertilization and matures by day 12. The CAM is naturally immunodeficient and ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

마우스의기도 신속 삽관 용 개선 된 방법

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

종양 미세 환경에서 실시간 다세포 역학의 확장 시간 경과 생체 내에 영상

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

수술 용 나사를 이용한 마취, 수술 및 수확 방법<em&gt; In Vivo</em&gt; 돼지의 허리 척추 모델

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy include photochemical cross-linking and tissue cross-linking (TXL) methods. Such methods for inducing mechanical tissue property changes are being employed to the cornea in corneal thinning (mechanically weakened) disorders such as keratoconus as well as the sclera in progressive myopia, where thinning and weakening of the posterior sclera occurs and likely contributes to axial elongation. The primary target proteins for such tissue strengthening are fibrillar collagens which constitute the great majority of dry weight proteins in the cornea and sclera. Fortuitously, fibrillar collagens are the main source of second harmonic generation signals in the tissue extracellular space. Therefore, modifications of the collagen proteins, such as those induced through cross-linking therapies, could potentially be detected and quantitated through the use of second harmonic generation microscopy (SHGM). Monitoring SHGM signals through the use of a laser scanning microscopy system coupled with an infrared excitation light source is an exciting modern imaging method that is enjoying widespread usage in the biomedical sciences. Thus, the present study was undertaken in order to evaluate the use of SHGM microscopy as a means to measure induced cross-linking effects in ex vivo rabbit sclera, following an injection of a chemical cross-linking agent into the sub-Tenon&#39;s space (sT), an injection approach that is standard practice for causing ocular anesthesia during ophthalmologic clinical procedures. The chemical cross-linking agent, sodium hydroxymethylglycinate (SMG), is from a class of cosmetic preservatives known as formaldehyde releasing agents (FARs). Scleral changes following reaction with SMG resulted in increases in SHG signals and correlated with shifts in thermal denaturation temperature, a standard method for evaluating induced tissue cross-linking effects.

Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking TXL for Myopia

This protocol describes techniques for evaluating chemical cross-linking of the rabbit sclera using&#160;second harmonic generation imaging and differential scanning calorimetry.

치료 조직 (TXL) 근 시에 대 한 교차 연결의 평가 위한 도구로 토끼 Sclera에 제 2 고조파 발생 신호

Methods to strengthen tissue by introducing chemical bonds (non-enzymatic cross-linking) into structural proteins (fibrillar collagens) for therapy ...

Subclavian Vein Puncture As an Alternative Method of Blood Sample Collection in Rats

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful compared to other more aggressive methods such as retro-orbital plexus sample collection. However, this blood collection method is sometimes limited by an unsatisfactory success rate. Here, we introduce a method for blood collection through the subclavian vein puncture. The subclavian vein is located just under the clavicle and this vein is large enough to fulfill the volume requirements of blood collection. Our results show that this method is safe and applicable for blood collection sampling with the required blood volume. Blood collection through the subclavian vein puncture could serve as an alternative blood collection method in case of failed tail vein blood sampling in rats.

Here, we present a protocol to collect blood samples from the rat subclavian vein.

쥐에서 혈액 샘플 컬렉션의 대체 방법으로 빵 꾸 하 정 맥

Blood collection with enough blood volume is essential in animal experiments. Blood collection from the tail vein of rats is popular and less stressful ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Guided Endodontics: Three-Dimensional Planning and Template-Aided Preparation of Endodontic Access Cavities

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, pulpitis or apical periodontitis may develop in the long term. Root canal treatment of teeth with severe PCO and pulpal or periapical pathosis is challenging for general practitioners and even for well-equipped endodontic specialists. To ensure detection of the calcified root canal and avoid excessive loss of tooth structure or root perforation, static navigation using templates ("Guided Endodontics") was introduced a few years ago. The general workflow includes three-dimensional imaging using cone-beam computed tomography (CBCT), a digital surface scan, and superimposition of both in a planning software. This is followed by virtual planning of the access cavity and the design of a template that will guide the drill to the desired target point. To do this, a true-to-scale virtual image of the drill must be placed in a way that the tip of the drill reaches the orifice of the calcified root canal. Once the template has been fabricated using computer-aided design and computer-aided manufacturing (CAD/CAM) or a 3D printer, guided preparation of the access cavity can be performed clinically. For research purposes, a postoperative CBCT image can be used to quantify the accuracy of the access cavity performed. This work aims to present the technique of static guided endodontics from imaging to clinical implementation.

Guided endodontics describes a template-aided approach for access cavity preparation. The procedure requires cone-beam computed tomography and a surface scan to produce a template. An incorporated sleeve guides the drill to the target point. This allows the preparation of minimally invasive endodontic access cavities in calcified teeth.

유도 근관 치료: 근관 접근 공동의 3차원 계획 및 템플릿 지원 준비

Pulp canal obliterations (PCO) are often a consequence of dental trauma, such as luxation injuries. Even though dentin apposition is a sign of vital pulp, ...