이 방법은 종양 유전자 의존에 관련시킨 중요한 유전자의 확인과 같은 암 치료 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 키나아제 구동 암에 공통되는 온코진 의존성을 활용하므로 다중 종양 유형에 적용가능하다는 것입니다. 이 방법은 백혈병에 대한 통찰력을 제공할 수 있더라도 폐암, 뇌종양 및 췌장 종양과 같은 고형 종양과 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.
일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 분자 생물학 및 세포 생리학에 경험의 부족으로 인해 투쟁 할 것 이다. 시작하려면 안락사 된 마우스에서 다리 뼈를 수확하십시오. 메스로 뼈에서 조직을 청소합니다.
그런 다음 차가운 PBS에 뼈를 얼음위에 놓고 뼈를 봉금으로 부수습니다. 그 후, 70 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 셀 서스펜션을 10밀리리터 파이펫이 있는 50밀리리터 스크류 캡 튜브로 필터링합니다. 차가운 PBS로 박격포를 여러 번 씻고 셀 서스펜션을 50 밀리리터 튜브에 추가하십시오.
다음 원심 분리골골은 골수를 제거하고 진공 및 유리 파이펫으로 상체를 제거합니다. PBS의 5 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 파이펫을 사용하여 실온 폴리 자당의 상단에 매달린 골수를 천천히 추가합니다.
그 후, 브레이크가 꺼져 20분 동안 400 Gs에서 폴리 자당을 회전시다. 원심분리 후 파이펫으로 흐린 총 모노 핵 세포 인터페이스를 수집하고 새로운 15 밀리리터 튜브로 옮긴다. PBS로 10 밀리리터에 볼륨을 가져와 계산할 수 있는 마이크로리터 20기를 제거합니다.
원심 분리 후, 상체를 버리고 펠릿을 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, EDTA 및 BSA를 가진 PBS에 있는 세포 펠릿을 재중단합니다. CD117 마이크로비드를 세포 현탁액에 넣고 소용돌이를 혼합합니다.
그 후, 섭씨 4도에서 10분 동안 서스펜션을 배양합니다. 그런 다음 EDTA및 BSA와 원심분리기가 1200G에서 5분 동안 섭씨 4도에 더 많은 PBS를 사용하여 최대 10 밀리리터의 볼륨을 가져옵니다. 진공을 사용하여 상체를 제거하고 EDTA 및 BSA로 PBS에서 세포 펠릿을 중단하십시오.
그런 다음 EDTA 및 BSA를 사용하여 PBS 3 밀리리터를 자석 기둥이 있는 자석 스탠드에 추가하고 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 버퍼가 컬럼을 통해 흐르면 셀 서스펜션을 추가하고 컬럼을 통해 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 다음으로 EDTA와 BSA를 사용하여 PBS의 밀리리터 를 추가하여 플런저로 즉시 플러시합니다.
플런저를 제거하고 셀을 계산하기 전에 플러시를 반복합니다. 세포를 원심분리한 후, 상체를 제거하고 배양을 위해 완전한 IMDM에서 세포 펠릿을 중단한다. 이산화탄소5%로 밤새 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다.
먼저, 레트로바이러스 플라스미드 DNA를 포장 플라스미드, 염화칼슘 및 물을 1.5 밀리리터 튜브에 결합합니다. 그런 다음 다른 1.5 밀리리터 튜브에 HBS 의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 동시에 가장 낮은 설정으로 설정 된 소용돌이와 혼합하면서 HBS를 포함하는 튜브에 경피 혼합물 드롭 와이즈를 추가합니다.
실온에서 20~30분 동안 배양혼합물을 배양한다. 잠복기 동안, HEK 세포에 클로로퀸을 추가하고 인큐베이터에 보관하십시오. 트랜스페션 믹스를 추가한 후, 신선한 DMEM10 미디어의 14밀리리터를 매우 느리게 추가하여 세포 매체를 변화시키는 섭씨 5%CO2 인큐베이터에서 8시간 동안 세포를 배양한다.
접시의 벽에 천천히 파이펫팅HEK 세포의 스트리핑을 방지하는 데 도움이됩니다. 그런 다음 37섭씨 5%CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 바이러스 성 상체를 수집하십시오.
그런 다음 주사기에 0.45 마이크로미터 주사기 필터를 부착합니다. 새로운 컬렉션 튜브에 바이러스 성 상체를 플런지. 약 16시간 후에 바이러스 성 상체를 수집하십시오.
그 후, PBS에 재조합 인간 섬유네틴 조각의 2밀리리터를 추가하여 6개의 잘 배양 플레이트에 첨가한다. 다음 날 파이펫을 사용하여 플레이트에서 섬유네틴을 제거합니다. PBS에서 2%BSA로 플레이트를 차단하고 실온에서 플레이트를 30분 동안 배양합니다.
진공을 사용하여 BSA를 제거하고 진공으로 제거하기 전에 PBS로 플레이트를 세척하십시오. 그 후 즉시 여과된 바이러스 성 상신체를 추가하고 플레이트를 2시간 동안 원심분리기를 추가합니다. 진공을 사용하여 상체를 제거하고 플레이트를 다시 회전시십시오.
다음으로 진공으로 상체를 제거하고 PBS로 바이러스 코팅 된 우물을 씻으신다. 진공상태에서 PBS를 제거하고 이전에 배양된 c-Kip 플러스 마우스 세포를 바이러스 코팅 된 우물에 추가하십시오. 원심분리 후 세포는 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다.
48 변환 후 시간, 원심 분리를 통해 세포를 펠릿과 FACS 버퍼 1에서 다시 중단. 먼저 실온에서 마우스를위한 사이토카인으로 메틸 셀룰로오스를 해동하십시오. 그런 다음 FACS 튜브에서 메틸 셀룰로오스의 3 밀리리터를 알리쿼트합니다.
메틸 셀룰로오스의 3 밀리리터에 적절한 억제제와 함께 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 서스펜션을 10~30초 동안 높게 소용돌이시다. 대부분의 기포가 탈출한 후 1 밀리리터 주사기를 사용하여 3개의 복제 플레이트에 1 밀리리터의 미디어 플레이트를 플레이트에 놓습니다.
접시를 큰 페트리 접시에 놓고 멸균물이 들어있는 열린 접시 하나를 놓습니다. 그런 다음 큰 페트리 접시를 덮고 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 10 밀리리터의 물에 10 밀리그램의 요오도니트로테라졸륨염화물을 용해하여 요오도니트로테라졸륨 염화염을 준비하십시오.
필터는 0.2 마이크로미터 필터가 장착된 Luer 잠금 주사기를 장착하여 염색 용액을 살균합니다. 조직 배양 후드에서, CFU 플레이트 주위에 염색 용액의 100 마이크로 리터를 드롭 현명한 추가합니다. 그런 다음 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 플레이트를 배양합니다.
마지막으로, 식민지가 어두운 붉은 갈색으로 변한 후 멸균 조직 배양 후드에 흰색 배경을 사용하여 염색 된 CFU 플레이트의 사진을 찍습니다. 이 프로토콜에서, 다중 편견 유전자 발현 분석은 종양유전자 중독을 오케스트레이션하는 유전 성분을 확인하기 위하여 이용되었습니다. 백혈병에서 치료 대상으로 c-Fos 및 Dusp1의 역할을 검증하기 위해, 그들의 과발현은 BCR-ABL1 종양 유전자를 발현하는 세포로 확인되었다.
RT-qPCR 및 서부 블로팅을 통한 분석은 둘 다 BCR-ABL1에 의해 유도되었고 그들의 발현이 성장 인자 IL-3에 의해 증강된다는 것을 확인했습니다. YFP 플러스 발현 세포는 추가 시험관 내 및 생체 내 에세이를 위해 FACS를 통해 분류되었습니다. 결과는 c-Fos와 Dusp1의 삭제가 CFU 숫자를 억제한다는 것을 보여주었습니다.
c-Fos와 Dusp1이 모두 결여된 세포는 c-Fos와 Dusp1의 손실이 BCR-ABL1 발현에 합성적으로 치명적임을 나타내는 모든 CfU를 전멸시키는 식민지및 이마티닙 치료를 형성하는 능력에서 현저히 손상되었습니다. 이 발달 후에, 이 기술은 암의 필드에 있는 연구원이 종양유전자 의존을 몰고 유전 네트워크 및 유전자를 탐구하고 이 유전자가 마우스 모형 및 인간 적인 환자에 있는 그들의 특정 반응에 어떻게 영향을 미치는지를 탐구하는 길을 포장했습니다. 레트로바이러스 및 환자 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 안전한 실험실 관행을 준수해야 한다는 것을 잊지 마십시오.
