우리의 높은 처리량 분석법은 TCR 신호 및 T 세포 활성화를 조절하는 작은 분자 및 그들의 표적의 식별을 위한 유효한 방법에 추가합니다. 우리의 분석은 독성 화합물을 필터링하고 TCR 신호 및 자극 유발 세포멸의 억제제를 식별하여 자체 시정 측면을 가지고 있습니다. TCR 신호의 중재자의 식별은 면역 질환에 대한 치료의 개발에 도움이 될 수 있습니다.
우리는 TCR 폴리클론 마우스에서 파생된 티모사이클에 대한 강력한 자극을 제공했습니다. TCR-트랜스제닉 마우스를 사용하고 약한 자극을 위해 다른 펩타이드 리간드 테트라머로 자극할 수 있습니다. 이 분석법은 세포의 배양을 위한 소량 및 소량 판의 사용을 포함합니다.
이를 위해서는 플레이트와 그 내용물의 주의 깊게 다루어야 합니다. 위험한 것으로 간주되는 키나아제 억제제 라이브러리에는 많은 화합물이 있습니다. 안전 고려 사항에 대 한, 동등 하 게 위험 으로 모든 화합물을 치료, 그리고 공급 업체의 권장 된 안전 예방 조치를 따르십시오.
키나제 억제제로 티모사이클을 치료하려면 다중 채널 파이펫을 사용하여 작은 볼륨 플레이트에 티모사이클의 웰당 40 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 얼음 위에 놓습니다. 그런 다음 키나아제 억제제, DMSO 및 덱사메타손의 한 부분, 및 전체 RPMI 미디어의 4개의 부분을 96웰 플레이트로 피펫합니다.
소량 판의 8개의 우물을 치료되지 않은 컨트롤에 지정하고, 5마이크로몰러 농도에서 희석된 덱사메타손과 4개의 우물을 차량 처리 제어에 추가하여 세포 사멸을 위한 덱사메타손 처리양성 컨트롤에 4개의 우물을 지정하여 희석DMSO의 0.5 마이크로리터를 첨가하였다. 다음으로, 억제제 플레이트의 해당 우물에서, 96-well 플레이트에 각 희석 억제제의 0.5 마이크로리터를 추가한다. 티모세포 자극을 시작하려면 먼저 CD-3 반대 구슬과 CD-28 구슬이 균일하게 다시 일시 중단되었는지 확인하십시오.
다음으로 PBS 버퍼의 2밀리리터로 구슬 1밀리리터를 세척합니다. 튜브를 자기 스탠드에 올려 놓고 구슬을 상체에서 분리하고 용액을 흡인시합니다. 그런 다음 전체 RPMI 매체의 1 밀리리터에서 구슬을 다시 일시 중단합니다.
비드 현탁액의 웰당 10마이크로리터를 각 억제제 처리 샘플, 4개의 DMSO 처리 샘플 및 8개의 처리되지 않은 샘플 중 4개에 추가합니다. 나머지 4개의 처리되지 않은 우물에 전체 RPMI의 마이크로리터 10개추가합니다. 마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반합니다.
다음으로, 17~20시간 또는 하룻밤 동안 37도, 이산화탄소 환경 5%로 티모사이클을 배양합니다. 먼저 150밀리리터의 에탄올 트웬 용액을 장착한 자동 라미나르 플로우 플레이트 와셔를 프라임한 다음, 1%Tween 20으로 보충된 탈이온화된 물로, 마지막으로 FACS 워시 버퍼를 장착합니다. 플레이트 세탁기 시스템을 사용하여 인큐베이션의 끝에서, 9 회 세척 주기를 사용하여 FACS 세척 버퍼로 플레이트를 세척하십시오.
각 세척은 라미나르 흐름에 의해 55 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 제거하여 우물에서 시약의 기하급수적 희석을 초래합니다. 표면 항원염색에, 먼저 1부단위의 안티CD-3, 안티CD-4, 안티CD-8 및 안티CD-69 항체를 FACS 세척 버퍼의 100단위 부피로 희석한다. 그런 다음 염색 항체 혼합물의 25 마이크로리터에서 세포를 다시 중단합니다.
마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반한 다음 접시를 얼음 위에 30 분 동안 둡니다. 세포를 고치려면 먼저 FACS 세척 버퍼 55마이크로리터로 플레이트를 세척하여 이전에 설명한 대로 9배의 세척 주기를 사용하십시오. 그런 다음 고정 불침투화 버퍼의 50 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다.
잘 섞어서 30분 동안 얼음 위에 접시를 배양합니다. 인큐베이션 후, 제공된 10X 스톡 의 25 밀리리터를 초순수 수의 225 밀리리터에 희석하여 1-X 파마를 준비하고 버퍼를 세척합니다. 플레이트 와셔를 1-X 버퍼로 프라임하고 이전에 설명한 대로 9배의 세척 주기를 사용하여 1-X 버퍼의 55 마이크로리터로 플레이트를 세척합니다.
시작하려면, 1-X 파마의 2 밀리리터와 안티 카스파제 3 항체의 밀리리터 1밀리리터를 혼합하고 버퍼를 세척한다. 고정 된 세포에 혼합물의 우물 당 25 마이크로 리터를 추가합니다. 마이크로 플레이트 궤도 셰이커를 사용하여 접시를 부드럽게 교반합니다.
접시를 얼음 위에 1시간 동안 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면 1-X 파마와 세척 버퍼로 워시 단계를 9번 반복합니다. 그런 다음 FACS 세척 버퍼 25 마이크로리터를 플레이트의 모든 우물에 추가합니다.
솔루션을 혼합하기 위해 몇 번 위아래로 파이펫. 마지막으로 혼합 샘플을 마이크로티터 튜브로 옮기습니다. FACS 세척 버퍼로 튜브를 총 200 마이크로리터로 상향 하고 유동 세포 측정 분석을 진행합니다.
반대로 CD-3, CD-28 자극에 이어, 카스파제-3 활성화및 TCR 다운규제의 증가는 처리되지 않은 및 DMSO 모의 처리 샘플 모두에서 관찰되었다. 또한, CD-69 발현의 증가는 자극된 두 샘플 모두에서 관찰되었다. 덱사메타손 처리된 견본은 독립적인 자멸 유도 효과 및 TCR 자극에 대하여 예상대로, CD-69 업 규제에 무관하게 caspase-3 활성화에 있는 증가를 보여주었습니다.
T세포 활성화 현상의 선택적 손상은 caspase-3 활성화 및 CD-69 업 조절을 모두 억제하거나 CD-69 업 조절을 억제하는 상이한 억제제에 의해 나타났지만 caspase-3 활성화를 손상시키지 않았다. 또한 TCR 신호 경로의 관련 키나아제를 표적으로 하지 않은 억제제가 있었고, 따라서 CD-69 업규제 및 caspase-3 활성화를 모두 억제하지 않았다. 스타우로스포린의 화면 결과, 아포토시스 양성 제어, 예상대로 caspase-3 활성화의 높은 수준을 보여 주었다.
그러나, 결과는 또한 CD-69 발현 의 단백질 키나아제 C 또는 유도된 자멸의 그것의 그것의 매개억제에 기인할 수 있는 CD-69 발현의 낮은 수준을 보여주었다. 상이한 분석 프로토콜의 비교는 활성 caspase-3, CD-69 및 TCR 염색음성 제어, 세포 사멸에 대한 양성 제어, 차량 제어 및 억제제 처리 샘플에 차이가 없음을 나타냈다. 사전 잠복 단계는 세포의 배양을 위한 소량 판의 사용을 용이하게 하기 위한 것입니다.
표준 원심분리기 종속 프로토콜도 원고에 제공됩니다. 잠재적으로 흥미로운 억제제 또는 표적은 다른 세포 모형을 사용하여 또한 다른 종에서, pagopheral 마우스 림프구 또는 인간 적인 1 차 세포와 같은 다른 종에서 검증될 수 있습니다. 확인된 분자와 표적의 후속 특성화는 T 세포 생물학의 이해를 향상하고 면역 변조를 위한 가능한 표적에 확장하는 것을 도울 수 있습니다.
