This project was support in part by Johns Hopkins University, Office of the Provost through the Gateway Science Initiative.

1 로그인 <ol><li> 생물 반응기를 전원을 켭니다. 로그인 페이지를 열려면 아무 곳이나 클릭합니다. 사용자 이름을 선택하고 암호를 입력하고 &quot;로그인&quot;을 클릭합니다. </li></ol> 2 교정 <ol><li> pH 센서 (이전 고압 증기 멸균에 2 점)를 보정합니다. </li><li> pH 센서를 점검하고 센서 팁 전해질 용액으로 가득합니다 확인합니다. pH 보정 솔루션 (전해질)의 pH 4, pH가 7 두 개의 비커를 준비하고 증류수로 사용할 수있는 세척​​ 병이있다. </li><li> pH 센서하여 pH 케이블을 연결합니다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. 교정 솔루션 온도 필드에 버퍼 온도를 입력합니다. </li><li> 버퍼 1 (산도 4)에서 pH 센서를 삽입하고 &quot;제로&quot;필드에 값을 입력합니다. 안정 그래프 기다린 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다. 증류수 pH 센서를 헹군다. </li><li> 버퍼에 넣어 센서 2 (산도 7). 버퍼를 입력&quot;범위&quot;필드에이 값입니다. 안정이 버튼을 보정 클릭 그래프 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 용존 산소 (DO) 센서를 보정합니다. </li><li> DO 센서를 확인하는 몇 시간 동안 시스템에 연결 됨으로써 편광되었다. 안녕하세요 인터페이스에서 &quot;작업&quot;탭으로 이동하고 교정을 클릭합니다. &quot;금지&quot;버튼을 클릭합니다. </li><li> DO 센서를 분리하고 &quot;제로&quot;필드에 0을 입력합니다. 안정 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> DO 센서를 다시 연결하고 &quot;스팬&quot;필드에 100을 입력합니다. 안정 &quot;보정이&quot;버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다. </li><li> &quot;저장&quot;다음 &quot;닫기&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 3 압력솥​​ 및 설치 센서 및 시약 용기 <ol><li> autoc에서 보정, 위치 센서 및 열 아니라 후노예 파우치와 121 ° C, 15 PSI에서 30 분 동안 오토 클레이브. </li><li> 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA) 및 생물 안전 캐비닛에 전송 파우치 (BSC)와 오토 클레이브 파우치를 소독합니다. 용기의 외부 포장을 제거합니다. </li><li> 70 % IPA와 내부 포장을 소독 및 생물 안전 캐비닛 (BSC)에 선박을 전송합니다. 내부 포장을 제거하고 운송 중에 입은 피해에 대한 용기와 튜브를 검사합니다. </li><li> pH를 설치하고 두 개의 전면 포트에 센서를 않습니다. 다시 왼쪽 포트에 열을 잘 설치합니다. 센서 캡을 엽니 다. </li><li> 센서 포트를 통해 상기 센서 가이드. 포트에 단단히 센서를 끼 웁니다. </li><li> BSC에서 선박을 전송합니다. </li><li> 선박 슬리브 외부 DO 및 pH 센서 케이블을 끊고 아무것도 슬리브 없음을 확인합니다. 첫째, 소매에 발을 선박을 밀어 넣습니다. </li><li> 조심스럽게 용기 열 잘에 온도 센서를 장착한다. 용기의 바닥은 히터에 맞춰져 있는지 확인합니다. </li><li> 제거튜브는 자신의 가방에서 설정합니다. 생물 반응기 제어 장치의 해당 커넥터와 펌프로 튜브에 일치 색상 코드. </li><li> 그 가스 배출구에 커넥터를 눌러 메인 가스 라인을 설치한다. 가스 배출구에 커넥터를 시계 방향으로 꼬아 서, 마이크로 가스 라인을 설치한다. 배기 필터 튜브를 설치합니다 : </li><li> 필터 오븐을 엽니 다. 그 튜브 필터와 오븐이 고리를 통과하도록 U-채널의 배기 필터를 고정합니다. </li><li> 튜브 홀더에 콘덴서 가방에 의해 튜브를 설치합니다. 문을 닫습니다. </li><li> 다음 생물 반응기 제어부 행 부가 선 및 B 모두의 미디어 라인, 및 DO 센서 뒤에 벤치 위에 수확 라인. </li><li> DO 및 pH를 센서에 케이블을 연결합니다. </li></ol> (4) 추가 중간 및 마이크로 캐리어 <ol><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동을 클릭 컴퓨터 인터페이스의 &quot;제어 펌프&quot;. </li><li> 스 테리 양식미사용 매체 첨가 라인 (오렌지 1 대역) 및 튜브 용접 또는 루어 피팅을 사용하여 배지 병 / 가방 소스와 르 연결. </li><li> 의 미디어 펌프를 켜 슬라이더를 클릭합니다. 미디어 매체의 또한 원하는 금액으로 꺼 펌프 설정하는 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> 실온에서 3 시간 동안, 칼슘 Mg를 2 + 무료 PBS를 마이크로 캐리어 비즈를 놓습니다. </li><li> 워시는 칼슘, 마그네슘 2 + 무료 PBS로 여러 번 구슬. </li><li> 115 ° C, 15 PSI에서 15 분간 고압 증기 멸균한다. 참고 :이 실험에 3g의 /의 L (건조 중량)를 추가합니다. </li><li> 수화 및 세정 매체가 단계 4.1에 첨가 동일한 방식으로 반응기로 멸균 된 마이크로 캐리어에 펌프. </li></ol> 5 평형 및 원 포인트는 교정 DO <ol><li> 자동으로 컨트롤러를 설정하고 원하는 설정 값을 입력합니다. 여기에서, 교반 설정 값 (SP) = 15 RPM, 온도 SP를 = 사용 37.0 ° C, pH가 7.2 = 100 % 마십시오. 페이지 기다립니다arameters는 평형합니다. </li><li> 센서를 확인하는 것은 완전히 편광이다. DO 현재 가치를 확인하는 안정. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;교정&quot;을 클릭합니다. &quot;원 포인트&quot;를 클릭 &quot;DO&quot;를 클릭합니다. </li><li> &quot;스팬&quot;필드에 &#39;백&#39;을 입력합니다. 을 클릭 &quot;저장&quot;과 &quot;주변&quot;을 클릭 &quot;교정 1&quot;버튼을 클릭합니다 : </li></ol> (6)는 실행을 시작 <ol><li> 작업 탭으로 이동합니다. &quot;일괄 처리&quot;를 클릭하십시오. 배치 이름 16 자 이하를 입력하려면 화면 키보드 나 외장 키보드를 사용합니다. </li><li> 온 스크린 키보드의 &#39;숨기기&#39;버튼을 클릭합니다. &quot;배치 시작&quot;오버레이의 &quot;시작&quot;을 클릭하여 확인을 클릭합니다. </li></ol> 7 세포에 접종 <ol><li> 용접에 의해 사용되지 않는 중간 부가 라인 (1 오렌지 밴드) 사이의 연결 및 멸균 셀 병 / 가방 소스를 형성루어 피팅을 사용하여 튜브 또는. </li><li> 펌프와 용기 사이의 튜브를 향해 화살표가 그래서 미디어 펌프 튜브의 실리콘 부분을 설치합니다. </li><li> 튜브 클램프를 확인하는 것은 개방과 분기 튜브 클램프가 닫힙니다. 의 미디어 펌프를 켜고 셀을 추가 한 후 &quot;Off&quot;로 클릭 슬라이더를 클릭합니다. </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;제어 펌프&quot;를 클릭합니다. </li></ol> 8 샘플링 <ol><li> 자주 배양을 모니터링하고 필요에 따라 접종 후, 다음과 같은 방식으로 배양 물로부터 시료를 그린다 </li><li> &quot;작업&quot;탭으로 이동하여 &quot;샘플을 채취&quot;를 클릭합니다. 샘플링 펌프 샘플링 튜브를 삽입하고 화면의 지시에 따라 샘플링 꼭지를 조작 할 수 있습니다. </li><li> 이러한 샘플에 적어도 매일 현미경 관찰 및 세포 수를 수행합니다. </li><li> 셀이 C에서 원하는 농도에 도달했으면1.2 × 106 세포 / ml ASE, 바이러스 접종 물을 첨가하여 세포를 감염시킨다. </li><li> 무균는 20 ㎖ 주사기로 접종을 추가하고, 반응기에 공급 부가 포트 중 하나에 연결 주사기. 주사기 플런저를 눌러 반응기로 접종을 소개합니다. </li><li> 샘플링을 계속 아데노 바이러스 세포 내 입자 농도에 대한 문화를 분석. </li></ol>

<ol>
	<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications. , (2010).</li><li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods.">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li><li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies.">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li><li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application.">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12 (2011).</li><li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing.">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li><li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities.">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li><li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures.">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li><li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization.">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li><li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology. , (2010).</li><li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures. , (2012).</li></ol>

저자 D. 지로와 Y Hashimura이 문서에서 사용되는 시약 및 장비를 생산 PBS 바이오 테크의 직원입니다.

이 회용 바이오 리액터 시스템은 사용하기 비교적 간단하고 반응기 모니터링 및 분석을위한 실시간 분석을 제공한다. 그것은 매우 잘 천만명 이상의 세포 / ml에 도달 한 세포 밀도가 포유 동물과 곤충 세포 배양에 적합하다. A549 세포는이 보고서 11에 설명 외에, 우리는뿐만 아니라 생물 반응기에서 SF-9 곤충 세포를 성장했다. 공압 공기 휠이 제공하는 부드러운 혼합 세포 손상을 줄일 수 있습니다. 이 반응기를 설정할 때 몇 가지 단계가 중요하다. 첫째, 적절한 산도의 교정 및 센서는 문화의 최적의 모니터링 및 산도 또는 시스템의 산소를 조절 시약을 첨가 한 중요 않습니다. 둘째, 시약 및 종자 병이 채워지고 루어 첨부는 BSC로 무균 환경에서 이루어져야한다. 시약 병은 무균 환경에서 벗어나게되면, 생물 반응기 공급 라인의 연결은 미생물이 오염되지 않도록주의해야합니다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt;이 생물 반응기 시스템이이 박테리아 배양을 위해 설계되지 포유 동물과 곤충 세포주 잘 작동하는 동안. 시스템은 세균 세포에 필요한 산소와 급속한 혼합을 제공 할 수 없다. 세균의 성장에 가장 교반 탱크 생물 반응기에서 수행됩니다. 포유 동물 또는 곤충 세포 배양에 대한 다른 일회용 바이오 리액터에 비해,이 시스템은 사용하기 쉽고 실행의 분석을 위해 충분한 데이터를 제공하고, 우리가 평가 한 다른 단일 사용 시스템보다 비슷하거나 더 나은 세포의 성장이 있습니다. 회용 바이오 리액터 공압 시스템은 세포를 연구 biotherapeutics, 백신의 임상 응용 분야에서의 여러 줄기를 충족 할 가능성, 및 개인화 된 약 4를 갖는다. 또한,이 시스템의 유연성은 배치, 회분, 관류 및 형질을 기반으로 생물 반응기 애플리케이션 다섯 수 있습니다. 마지막으로, 단일 사용 회용 바이오 리액터 시스템이 poten대규모 산업 생산의 요구를 충족하고, 가이드 라인과 국내 및 국제 규제 기관 6-10의 권장 사항을 준수 자유형.

현탁액에서 성장 세포 응집체로서 세포 성장 및 세포 기질에 고정 성장 : 포유류 세포 선은 그들의 성장 특성에 따라 세 개의 카테고리 중 하나로 분류 될 수있다. 이 비디오에서 보여준 공기 륜 생물 반응기는 세포의 세 가지 유형을 성장할 수 있지만,이 비디오는 마이크로 캐리어에 고정 장치 의존 세포를 성장하는 생물 반응기의 사용을 설명합니다. 세포 자체 산물 - 앵커리지 종속 포유류 세포보다 세포를 생산하기위한 목적으로 성장시킬 수있다. 예를 들어, 인간의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포는 현재 세포를 수확하고 병든 조직으로 이들을 주입 목적으로 재배되고있다. 이 동영상에서 입증 공압 생물 반응기가이 애플리케이션에 대한 이러한 중간 엽 줄기 세포의 제조에 적합한 입증되었다 (세라 외., 개인 통신, 2013). 앵커리지 출발endent 포유 동물 세포는 일반적으로 그들이 특별하게 취급 성장 표면에 부착 한 세포 배양 접시, 세포 배양 플라스크, 또는 롤러 병으로 2D 배양 용기에서 작은 규모의 성장하고 있습니다. 이상의 셀이 요구되는 경우, 플레이트 또는 플라스크 개 이상의 용기를 사용하여 확장 될 수있다. 그러나,보다 비용 효율적인 앵커리지 의존적 세포의 대량 배양, 세포 부착을위한 표면적을 증가시키기 위해 마이크로 - 고체 담체라는 작은 비드를 사용하여 수행 할 수있다. 세포의 부착 특성에 따라, 마이크로 캐리어의 여러 다른 유형의 코팅 된 덱스 트란과 같은, 펩타이드, 콜라겐과 같은 시판 중이다. 마이크로 캐리어는 세포 성장을위한 큰 표면적을 제공 부피비 큰 표면적을 갖고; 및 마이크로 캐리어 세포 바이오 리액터 시스템이 높은 밀도로 배양 할 수 교반과 현탁액에서 유지 될 수있다. biorea의 현재 형식부착 세포는 마이크로 캐리어에 성장 ctors 셀 코팅 마이크로 캐리어들의 현탁액을 유지하기 위해 축 방향 임펠러를 사용하여 스피너 플라스크 및 교반되는 탱크 시스템을 포함한다. 여러 가지 요인 산소 장력, 전단 응력, 표면 행렬, 영양소 및 대사 산물 농도를 포함한 세포의 배양에 성공에 중요하다. 생물 반응기의 사용은 실시간 성장 조건의 모니터링 및 상당히 낮은 생산 비용 1 전위 허용한다. 를 포함하여 체외 세포 배양, 교반 서스펜션, 회전 벽 용기, 중공 섬유, 로커 플랫폼에서 가방 생물 반응기, 유동층 시스템 3에 대한 몇 가지 일반적인 생물 반응기 설계가 있습니다. 이들 시스템의 대부분은 높은 비용, 영양소 농도 기울기, 유체 역학적 전단력, 세포 응집 어려움 샘플링에서, 모니터링 및 제어 CEL 같이, 세포 배양을 위해 고유의 문제를 제시하고 - 최대 스케일리터 규모입니다. 다양한 점착성 세포주 바이러스 백신의 제조 또는 유전자 치료 응용을위한 바이러스 벡터의 제조 중, 바이러스의 생산에 사용된다. 이 비디오에서는, 단일 사용 공기 (에어 휠) 생물 반응기 시스템을 사용하여, 우리는 인간의 폐암 세포 (A549) 콜리 틱 아데노 바이러스의 생산을위한 마이크로 캐리어에 세포의 문화를 보여줍니다. 공압 생물 반응기 설계는 생물 반응기의 바닥으로 살포 기체의 부력에 의해 구동되는 수직 교반 휠을 사용한다. 이 부드러운 교반 방법은 유체 ​​역학적 전단력을 제한하지만 여전히 최적 배지 및 세포가 4를 혼합 보장한다. 교반 탱크 반응기에 비해, 공기 반응기 심지어 대용량 에어 휠 바이오 리액터 시스템 (도 1)와 낮은 벽 전단 응력을 갖는다. 교반 탱크 생물 반응기는 대조적으로,이 단일 사용 반응기의 수직 임펠러는 기포의 스트림 내에서 켜져부드럽고 균일 한 매체의 혼합 (그림 2)을 허용 용기.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 3&#160;</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single Use Assembly</td>
			<td style="width:124px;">PBS</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;">Human Lung Carcinoma Cells (A549)</td>
			<td style="width:124px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM High Glucose Medium</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA, 0.25%</td>
			<td style="width:124px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytodex 1 Microcarriers</td>
			<td style="width:124px;">GE</td>
			<td align="right">3781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antifoam C</td>
			<td style="width:124px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivation of mammalian cells using a single-use pneumatic bioreactor system

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

그림 3에서 생물 반응기 실행의 개시에 대한 매개 변수가 표시됩니다. 이 그림은 온도, 용존 산소, pH와 교반의 매개 변수를 설정하기 전에 화면을 보여줍니다. 매개 변수가 설정되면, 실행 파라미터는 연속적으로 모니터링하고 조정이 필요한 상태를 유지하도록 할 수있다. 이 소프트웨어는 문제를 쉽게 식별 할 수있는 연속 판독 값을 생성합니다. DMEM은 10 % FBS, SAFC 안티 폼 C 250 PPM, 2mm의 L-글루타민 및 3g / 마이크로 캐리어들의 L을 함유하는 2.5 L를 이용하여 본 실험에서, 시스템은 매우 산소 퍼센트가 50 %, 인 안정 온도는 37 ° C이며, pH는 7.2이다. 반응기를 7 × 104 세포 / ml (또는 / 미세 담체 10 세포)의 농도에서 A549 세포를 접종한다. 이 실행을 위해 선택된 파라미터는 2 시간 (도 4) 내에 마이크로 캐리어에 부착 된 세포의 대다수되었습니다. 12 시간 후, 세포는 악마입니다(그림 5) 평탄화 및 마이크로 캐리어 표면에 확산 trating 표지판. 24 시간으로, 마이크로 캐리어 (그림 6) 세포없이 어떤 마이크로 사업자 및 마이크로 캐리어에 세포의 더 큰 덩어리와 세포의 비교적 고른 분포를 가지고있다. A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 비율은 24 시간 후 90 % (그림 7) 75 %이다. 세포는 48 시간 (그림 8) 후 ~ 1,000,000 세포 / ml로 기하 급수적으로 증가하는 것을 계속했다. 50 시간에 온 콜리 틱 아데노 바이러스 (2 × 10 8 비리 온 / ㎖)의 투여에 의해 감염 후, 밀도는 ML 1,200,000 세포 / 증가하고 용균 감염이 진행됨에 따라 감소하기 시작했다. 바이러스 접종 ~ 10,000 배 증폭이 있었다. 이전의 실험에서, 우리는 가스 흐름을 모니터링하고 조정하는 것은 세포의 성장 (게시되지 않은 데이터)를 극대화하는 데 중요한 것으로 나타났습니다. 빠르게 성장하는 세포는 산소 시스템을 고갈 수<html> 제로로 떨어지는 DO 수준입니다. 세포는 성장을 계속하지만, 훨씬 더 느린 속도로했다. 그것은 모니터링 및 대수 성장 단계에서 세포의 요구를 충족시키기 위해 산소 유량을 조정하는 것이 중요하다. 각각의 실행은 매일 세포 수와 산도, DO, 온도를 비교하여 최적의 성장을 분석 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg" /> 다양한 원자로 볼륨에서 벽 전단력을 측정 교반기 탱크 생물 반응기에 비해 공압 생물 반응기 시스템 (PBS)의 그림 1 유체 역학. <img alt="그림이" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg" /> 그림 2 공압 에어 휠 원자로 임펠러. <html> 52008 / 52008fig3highres.jpg &quot;/&gt; 생물 반응기의 실행을 시작하는 매개 변수의 3 공압 에어 휠 소프트웨어 스크린 샷 그림. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" /> A549 세포 2 시간 게시물 접종 그림 4 마이크로 캐리어 식민지. (평균 마이크로 캐리어 직경 ~ 180 μm의.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg" /> 도 5에서 12 시간 배양 개시 후, A549 세포는 부착 평탄화 및 마이크로 캐리어 상으로 확산된다.5highres.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" /> 문화 24 시간 후 세포로 코팅 된 그림 6 마이크로 캐리어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg" /> A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 그림 7 비율 접종을 게시 할 수 있습니다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg" /> 도 8 adenovir 함께 예비 배양에서 생존 A549 세포의 수와 포스트 감염우리는. 바이러스 감염 단계는 50 시간에서 발생합니다.

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Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

24.2K 조회수.  Johns Hopkins University. Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells. 

비디오: Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

타악기 생물 반응기를 사용하여 생물 공학 기반 혈관의 이식

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

연구

생체공학

Cultivation of Human Neural Progenitor Cells in a 3-dimensional Self-assembling Peptide Hydrogel

The influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally neuronal differentiation is of great interest in order to find new methods for cell-based and standardised therapies in neurological disorders or neurodegenerative diseases. 3D structures are expected to provide an environment much closer to the in vivo situation than 2D cultures. In the context of regenerative medicine, the combination of biomaterial scaffolds with neural stem and progenitor cells holds great promise as a therapeutic tool.1-5 Culture systems emulating a three dimensional environment have been shown to influence proliferation and differentiation in different types of stem and progenitor cells. Herein, the formation and functionalisation of the 3D-microenviroment is important to determine the survival and fate of the embedded cells.6-8 Here we used PuraMatrix9,10 (RADA16, PM), a peptide based hydrogel scaffold, which is well described and used to study the influence of a 3D-environment on different cell types.7,11-14 PuraMatrix can be customised easily and the synthetic fabrication of the nano-fibers provides a 3D-culture system of high reliability, which is in addition xeno-free.
Recently we have studied the influence of the PM-concentration on the formation of the scaffold.13 In this study the used concentrations of PM had a direct impact on the formation of the 3D-structure, which was demonstrated by atomic force microscopy. A subsequent analysis of the survival and differentiation of the hNPCs revealed an influence of the used concentrations of PM on the fate of the embedded cells. However, the analysis of survival or neuronal differentiation by means of immunofluorescence techniques posses some hurdles. To gain reliable data, one has to determine the total number of cells within a matrix to obtain the relative number of e.g. neuronal cells marked by &beta;III-tubulin. This prerequisites a technique to analyse the scaffolds in all 3-dimensions by a confocal microscope or a comparable technique like fluorescence microscopes able to take z-stacks of the specimen. Furthermore this kind of analysis is extremely time consuming. 
Here we demonstrate a method to release cells from the 3D-scaffolds for the later analysis e.g. by flow cytometry. In this protocol human neural progenitor cells (hNPCs) of the ReNcell VM cell line (Millipore USA) were cultured and differentiated in 3D-scaffolds consisting of PuraMatrix (PM) or PuraMatrix supplemented with laminin (PML). In our hands a PM-concentration of 0.25% was optimal for the cultivation of the cells13, however the concentration might be adapted to other cell types.12 The released cells can be used for e.g. immunocytochemical studies and subsequently analysed by flow cytometry. This speeds up the analysis and more over, the obtained data rest upon a wider base, improving the reliability of the data.

Here we describe the use of a self-assembling 3-dimensional scaffold to culture human neural progenitor cells. We present a protocol to release the cells from the scaffolds to be analysed subsequently e.g. by flow cytometry. This protocol might be adapted to other cell types to perform detailed mechanistically studies.

3 차원 자기 조립 펩티드 히드로겔에서 인간 신경 전구 세포의 배양

The  influence of 3-dimensional (3D) scaffolds on growth, proliferation and finally  neuronal differentiation is of great interest in order to find new ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

벤치 탑 생물 반응기의 운전

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past studies have evaluated the performance of the reactor for the removal of COD1 and nitrogen species2-4 by heterotrophic and chemoautotrophic bacteria, respectively. The HDBR design eliminates the requirement for external flocculation/sedimentation processes while still yielding effluent containing low suspended solids. In this study, the HDBR is applied as a photobioreactor (PBR) in order to characterize the nitrogen removal characteristics of an algae-based photosynthetic microbial community. As previously reported for this HDBR design, a stable biomass zone was established with a clear delineation between the biologically active portion of the reactor and the recycling reactor fluid, which resulted in a low suspended solid effluent. The algal community in the HDBR was observed to remove 18.4% of total nitrogen species in the influent. Varying NH4+ and NO3- concentrations in the feed did not have an effect on NH4+ removal (n=44, p=0.993 and n=44, p=0.610 respectively) while NH4+ feed concentration was found to be negatively related with NO3- removal (n=44, p=0.000) and NO3- feed concentration was found to be positively correlated with NO3- removal (n=44, p=0.000). Consistent removal of NH4+, combined with the accumulation of oxidized nitrogen species at high NH4+ fluxes indicates the presence of ammonia- and nitrite-oxidizing bacteria within the microbial community.

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Here, the HDBR is successfully applied in a photobioreactor (PBR) configuration for the study of nitrogen metabolism by a mixed high density algal community.

다양한 미생물 커뮤니티의 고밀도 배양위한 새로운 생물 반응기

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet encapsulation has been studied extensively as a means to increase islet survival in allogeneic or xenogeneic transplants. Alginate encapsulation is commonly achieved by nozzle extrusion and external gelation. Using this method, cell-containing alginate droplets formed at the tip of nozzles fall into a solution containing divalent cations that cause ionotropic alginate gelation as they diffuse into the droplets. The requirement for droplet formation at the nozzle tip limits the volumetric throughput and alginate concentration that can be achieved. This video describes a scalable emulsification method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate with 70% to 90% cell survival. By this alternative method, alginate droplets containing cells and calcium carbonate are emulsified in mineral oil, followed by a decrease in pH leading to internal calcium release and ionotropic alginate gelation. The current method allows the production of alginate beads within 20 min of emulsification. The equipment required for the encapsulation step consists in simple stirred vessels available to most laboratories.

This video and manuscript describe an emulsion-based method to encapsulate mammalian cells in 0.5% to 10% alginate beads which can be produced in large batches using a simple stirred vessel. The encapsulated cells can be cultured in vitro or transplanted for cellular therapy applications.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

Cell encapsulation in alginate beads has been used for immobilized cell culture in vitro as well as for immunoisolation in vivo. Pancreatic islet ...

Recombinant Collagen I Peptide Microcarriers for Cell Expansion and Their Potential Use As Cell Delivery System in a Bioreactor Model

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation purposes. The process to generate such tissues is complex, and includes an appropriate combination of specific cell types, scaffolds, and physical or biochemical stimuli to guide cell growth and differentiation. Microcarriers represent an appealing tool to expand cells in a three-dimensional (3D) microenvironment, since they provide higher surface-to volume ratios and mimic more closely the in vivo situation compared to traditional two-dimensional methods. The vascular system, supplying oxygen and nutrients to the cells and ensuring waste removal, constitutes an important building block when generating engineered tissues. In fact, most constructs fail after being implanted due to lacking vascular support. In this study, we present a protocol for endothelial cell expansion on recombinant collagen-based microcarriers under dynamic conditions in spinner flask and bioreactors, and we explain how to determine in this setting cell viability and functionality. In addition, we propose a method for cell delivery for vascularization purposes without additional detachment steps necessary. Furthermore, we provide a strategy to evaluate the cell vascularization potential in a perfusion bioreactor on a decellularized&#160;biological matrix. We believe that the use of the presented methods could lead to the development of new cell-based therapies for a large range of tissue engineering applications in the clinical practice.

We propose a cell expansion protocol on macroporous microcarriers and their use as delivery system in a perfusion bioreactor to seed a decellularized tissue matrix. We also include different techniques to determine cell proliferation and viability of cells cultured on microcarriers. Furthermore, we demonstrate functionality of cells after bioreactor cultures.

재조합 콜라겐 나 세포 확장과 생물에 셀 납품 시스템으로 그들의 잠재적인 사용에 대 한 펩 티 드 Microcarriers 모델

Tissue engineering is a promising field, focused on developing solutions for the increasing demand on tissues and organs regarding transplantation ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

균일 한 골 재를 생산 하 오 모양의 혈관에 포유류 세포의 문화를 떨고는 궤도

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

이중 루시파라제 기자 시스템을 통해 포유류 세포에서 CRISPR 플라스미드 의 건설 및 녹아웃 효율 검출

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...