이 연구는 NIH 상 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733에 의해 부분적으로 지원되었다.

모든 동물의 작업은 규정과 의학의 알버트 아인슈타인 대학 동물 연구소의 지침에 따라 이루어졌다. C.의 1 성장 조건 콕 쿠스 네오 포르 만 H99 (혈청 형 A) <ol><li> 개별 C. 성장 사부로 한천 접시에 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 식민지. </li><li> 어느 날 이전에 실험 한 식민지를 선택하고 사부로 배지 10 ㎖를 접종. </li><li> 문화가 250 rpm의 속도로 흔들어 37 ° C에서 하룻밤 성장하도록 허용합니다. </li></ol> 2 분리 및 C57에서 차 뼈 대 식세포의 제조 / BL6 마우스 <ol><li> 더 이상 호흡까지 CO 2 챔버 내에 동물을 배치하여 마우스를 안락사. 두 번째 조치로, cervically 해부를 시작하기 전에 목을 탈구. 70 %의 에틸 알코올로 몸 전체를 소독. </li><li> 멸균 DMEM 모두 대퇴골 및 경골과 장소 뼈를 제거합니다. </li><li> 여분의 조직과 근육 드를 사용하여 제거뼈가 완전히 깨끗해질 때까지 licate가 정리합니다. </li><li> 70 % 에틸 알코올을 포함하는 페트리 접시 만 그대로 뼈를 삽입하고 관련 미생물을 죽이기 위해 3 분 동안 배양한다. 멸균 DMEM과 페트리 접시에 뼈와 장소를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 뼈의 끝을 잘라. 빈 50 ML 원뿔 튜브 얼음에 배치하고 각 뼈를 통해 25 G 바늘을 사용하여 차가운 DMEM 10 ㎖ 조심스럽게 세척을 통해 뼈를 잡습니다. 주 : 각 마우스가 4 뼈 (대퇴골 두, 두 경골)를 얻을 것입니다. 따라서 한 마우스 세포 현탁액의 약 40 mL로 수득한다. </li><li> 650의 X g에서 10 분 동안 실온에서 원심 분리 세포 현탁액. </li><li> 이 원심 중에 준비하고 필터 골수 대 식세포는 20 % L929, 10 % 소 태아 혈청, 10 % NCTC-109, 1 % 펜 연쇄상, 1 % HEPES, 1 % L-글루타민이 보충 된 DMEM으로 구성되어 용지를 공급하는 살균 비 필수 아미노산 1 %, 0.1 %, 2 - 메르 캅토 에탄올. </li><li> 용지를 넣기 10 mL로 재현 탁 결과 펠릿. 세포 suspens 합격세포 덩어리를 중단하고 큰 부스러기를 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 이온. </li><li> 플레이트 (10 판의 총) 조직 배양에 사용하도록 지정된 배양 접시에서 먹이 미디어의 10 ML에 세포 현탁액 1 ㎖. </li><li> 세포가 10 % CO 2와 37 ° C에 부착 할 수 있습니다. , 일 7 일 3 일에 신선한 공급 용지 5 ㎖를 추가 완전히 공급 매체 및 대 식세포가 사용될 준비가 교체. </li><li> 이전 실험에 날, 먹이 미디어를 제거하여 플레이트에서 대 식세포를 분리하고 플레이트에 시약을 제거 부드러운 세포의 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 37 ° C에서 5 ~ 10 분 동안 품어 부드러운 피펫 팅으로 대 식세포를 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 650 XG에 원심 분리하여 펠렛 세포. </li><li> 미디어를 공급하는 1 ㎖에 재현 탁 펠렛. 1:20 희석하여, 상 혈구 세포 현탁액 10 ㎕를 피펫 팅에 의해 대 식세포의 농도를 계산한다. </li><li> 페트리 접시를 14mm 유리 바닥 사용을 판직접 200 ㎕의 최대 보유하고있는 내부 아니라 상에 1 × 10 5 대 식세포의 농도는, 그래서 그림 4와 같이이 볼륨을 초과하지에주의하십시오. </li><li> 세포가 1 시간 동안 37 ° C의 배양기에서 접시를 배치하여 유리 페트리 접시에 부착 할 수 있습니다. </li><li> 500 U / ㎖에서 1 ㎎ / ㎖ 및 IFNg에서 LPS로 보충 미디어를 먹이의 1-2 ML을 추가하고 세포가 하룻밤 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 차 쥐과 대 식세포와 C의 3 공동 배양 콕 쿠스 네오 포르 만 <ol><li> 실험의 날, 420 X g에서 5 분 동안 원심 분리하여 하룻밤 접종 문화와 펠렛 효모 세포를 1 ㎖를 제거합니다. </li><li> 위에서 언급 한 속도 및 시간에 다당류 glucuronoxylomannan (GXM)와 같은 매체 및 크립토 외 제품을 제거하기 위해 멸균 PBS로 세포를 3 회 반복한다. </li><li> 100 희석 : 멸균 PBS 1 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛과 1을 확보. t의 피펫 10 μL그는 혈구에 희석 세포를 계산합니다. 하나의 MOI에서 효모 세포를 추가합니다 5. 1 × 105 식세포가있는 경우 예를 들면, / 웰, CN의 5 × 106 / ㎖의 세포 현탁액을 5 × 105 CN의 전량이 용액 100 ㎕를 추가한다. </li><li> 10 μg / ml의 농도에서 단클론 항체 18B7 항체와 함께 먹이 미디어의 1 ml의 크립토 세포 현탁액의 계산 된 볼륨을 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 세포 현탁액을 배양한다. </li><li> 유리에서 공급 된 용지를 제거은 페트리 접시를 바닥 및 멸균 PBS로 1 배를 씻는다. 물론 직접 옵 소닌 CN의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 세포가 10 % CO 2와 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> 공동 배양 후, 대 식세포는 CN을 내면화 한 것을 현미경으로 확인합니다. 내면화 고려하기 위해, 크립토 셀은 명확하게 식세포의 범위 내에서 볼 수 있어야합니다. </li><li> 멸균 PBS로 세척 페트리 접시의 3 배는 모든 extracellula를 제거합니다R CN. </li><li> 1-2 단클론 항체 18B7의 추가없이 미디어를 공급 ml의 설정 현미경을 추가합니다. </li></ol> 디지털 광학 현미경을 활용하여 실시간으로 4 떠올리 비 용해성 세포 외 유출 주 :, CO 2 배달 및 가열 장치가 필요합니다 포함 된 첨부 배양 챔버와 함께 제공되는 현미경을이 실험을 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 실험 전에 적어도 30 분에 37 ° C에 대한 배양 챔버를 미리 따뜻하게. CO 2 장치는 실험 시작시 5 %를 읽고 있는지 확인합니다. </li><li> 장소 유리 CO 2 뚜껑 커버, 더 열 탈출 없도록 모든 문을 닫고, 현미경 플랫폼에서 페트리 접시를 바닥. </li><li> 위상 콘트라스트 현미경으로 10X 대물 렌즈를 이용하여 감염된 대 식세포의 클리어 필드에 초점. 실험을 바탕으로 연구 될 필요가 얼마나 많은 대 식세포에 의해 사용 목적을 결정한다. </li><li> 타에 현미경 소프트웨어를 설정이미지에게 24 시간 동안 매 4 분 애. </li><li> 24 시간 후, 실험이 완성에 도달 한 것 및 361 화상의 총 수집 된 것이다. 5 % 압축에 .jpegs으로 이러한 이미지를 내 보냅니다. 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 초당 5 프레임에서 비주얼 스택으로 이미지를 볼 수 있습니다. 동영상이 게시 또는 프리젠 테이션을 볼 수 할 필요가있는 경우, AVI로 또는 형식 뷰어에 가장 적합한에 따라 .MOV 파일 중 하나로 저장합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

저자는 우리가 더 경쟁 재정적 이해 나 관심의 다른 충돌이 없음을 선언합니다.

여기서 우리는 곰팡이 식세포 작용을 기록하고 24 시간 동안 실시간으로 분석 할 수있는 방법을 설명 하였다. 본 연구실은 비 용균 세포 외 유출의 시간적 측면 많은 공부이 프로토콜을 사용하고이 프로세스를 둘러싸고 형태 요소를 확인하기 위해 실시간으로 현미경을 사용하는 것을 계속할 것이다. 이 기술은 이상적인 결과를 산출하기 위해서는 특별한주의가 프로토콜의 ?...

크립토 세포와 대식 세포 사이의 곰팡이 감염의 단계가 아니라 1-3 설명되어 있습니다. 효모 세포는 대 식세포에 의해 섭취 된 후, 상호 작용의 다양한 발생할 수 대식구는 세포 외 공간으로의 진균 부하 해제 용해되거나, 그것의 세포막 (4)의 범위 내에서 효모 세포를 유지하여 감염을 제어 할 수있다. 비 용균 세포 외 유출, 식세포가 주변 환경으로 크립토 셀의 일부 또는 전부를 소거하는 프로세스 또는 인접 셀 및 호스트와 병원체 모두 5 가능한 남아 : 그러나, 몇 년 전에 새로운 결과 두 그룹에 의해 독립적으로 설명 된 -8. 몇몇 연구는 이러한 상호 작용의 뒤에 분자 메커니즘을 이해하려고했지만 우리는 여전히이 현상을 원동력에 대한 전체 이해를 필요가 없습니다. 기능은 실시간으로 영상을 캡쳐하고 그 후 여러 감염을 분석 할에드 대 식세포는 하나가 곰팡이 감염시 형태와 대 식세포 심지어 스트레스에서 타이밍, 공간 능력, 변화에 관해서 비 용해성 세포 외 유출을 둘러싼 물리적 특성에 대해 많은 질문에 대답 할 수 있습니다. 세포 배양기의 것과 필적 환경에 수납 될 수 있도록함으로써, 우리는 식세포 진균 세포 상호 작용의 동적 특성을 엿볼 수있다. 연구진은이 과정의 다양한 구성 요소를 연구하기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 또 다른 그룹은 비 용해성 세포 외 유출이 단백질 도메인을 핵 WASH 10 삭제 있었 세포에서 차단 된 것을 보여주기 위해이 방법을 사용하는 동안이 과정에서 phagosome의 역할은, 형광 염색과 액틴 차단제 구를 사용하여 분명했습니다. 사이토 카인 시그널링의 효과도 실시간 현미경 (11)을 사용하여 확인되었다. 이 프로세스는 C. 한정되지 않는다 그와 같은 콕 쿠스 네오 포르 만은 칸디다 알비 칸스 (Candida albicans)로 관찰되었다, anothe대 식세포 (12)을 감염시키는 능력을 가진 곰팡이 병원균 r에. 이러한 연구 결과는이 방법이 우리에 대해 너무 조금 알고있는 지역에 풍부한 정보를 제공 할 수있는 방법에 대한 예입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="976">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td style="width:183px;">BD</td>
			<td style="width:227px;">DF0109-17-1</td>
			<td style="width:207px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sabouraud Dextrose Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>DF0382-17-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dubelcco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium(DMEM)</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum ( FCS)&#160;</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S12450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCTC 109</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21340-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES Buffer</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-060-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-essential Amino Acids</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-025-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3003 Tissue Culture Petri Dishes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>08772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellStripper</td>
			<td>Corning Cellgro</td>
			<td>25-056-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35GC-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse IFN-g</td>
			<td>Roche</td>
			<td>NC 9222016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mAb 18B7</td>
			<td colspan="2">&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Non-commerical antibody produced in our lab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

크립토 콕 쿠스 네오 포르 만에 의한 대 식세포의 감염의 많은 측면을 광범위하게 연구하고 잘 정의되어 있습니다. 그러나, 명확하게 이해되지 않는 한 특정의 상호 작용은 세포 외 유출 용균 비이다. 이 과정에서 효모 세포는 대 식세포와 CN 가능한 모두 나뭇잎 제대로 이해 메커니즘에 의해 세포 외 공간으로 해제됩니다. 여기서 우리는 시간 경과 현미경에 의해 24 시간 감염 기간에 대해 개별적으로 감염된 대 식세포의 큰 숫자를 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 감염된 대 식세포가 세포 배양 인큐베이터과 동일한 조건을 제공 현미경에 부착 된 CO 2 분위기의 가열 챔버 내에 수용된다. 라이브 디지털 현미경 정적 이미지에서 사용할 수없는 호스트와 병원체 간의 동적 상호 작용에 대한 정보를 제공 할 수있다. 그 반대의 경우도 마찬가지 대식 세포가 곰팡이 감염을 처리하는 방법에 대한 단서를 제공 할 수 각 감염된 세포를 시각화 할 수 있다는. 이 기술의 전복잡한 현상 뒤에있는 역학을 공부 SA 강력한 도구입니다.

이 기술은 이미지를 생성 세포 C. phagocytosed 후에 발생하는 주변 환경 정보를 수집하기 위해 다양한 방식으로 분석 될 수있다 콕 쿠스 네오 포르 만이.도 1에 도시 된 바와 같이, 감염되거나 감염되지 않은 아르 중 약 100 대 식세포있다. 이 대 식세포의 각각은 시청자에게 매우 미세한 수준에서 호스트 병원체 상호 작용을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다. 그...

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

visualizing-non-lytic-exocytosis-cryptococcus-neoformans-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

11.7K 조회수.  Albert Einstein College of Medicine.  우리는 macrophage- C.를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (CN) 디지털 광 현미경을 사용하여 비 - 용해성 세포 외 유출의 프로세스에 특정 중점을 실시간으로 상호 작용. 개별적 감염된 대 식세포를이 방법을 사용하는 것은 이러한 현상의 다양한 양태를 확인하기 위해 조사 될 수있다. 

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Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using fluorescence video microscopy. To track the movements of the human immunodeficiency virus core protein during cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus, we have GFP-tagged the Gag protein in the context of an infectious molecular clone of HIV, called HIV Gag-iGFP. We study this viral clone using video confocal microscopy. In the following visualized experiment, we transfect a human T cell line with HIV Gag-iGFP, and we use fluorescently labeled uninfected CD4+ T cells to serve as target cells for the virus. Using the different fluorescent labels we can readily follow viral production and transport across intercellular structures called virological synapses. Simple gas permeable imaging chambers allow us to observe synapses with live confocal microscopy from minutes to days. These approaches can be used to track viral proteins as they move in from one cell to the next.

This visualized experiment is a guide for utilizing a fluorescent molecular clone of HIV for live confocal imaging experiments.

HIV와 라이브 공촛점 현미경의 형광 클론을 사용하여 HIV의 머릿속 휴대 전화 전송

By fusing the green fluorescent protein to their favorite proteins, biologists now have the ability to study living complex cellular processes using ...

연구

면역학 및 감염병학

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

의 생리적 반응을 측정<em&gt; 초파리</em&gt; 라이브 칼슘 이미징을 사용하여 지질 페로몬에 감각 뉴런

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 대 식 세포 세포 외 트랩을 시각화

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze membrane fusion within eukaryotic cells. The SNARE protein family consists of about 36 different members. Specific intracellular transport routes are catalyzed by specific sets of 3 or 4 SNARE proteins that thereby contribute to the specificity and fidelity of membrane trafficking. However, studying the precise function of SNARE proteins is technically challenging, because SNAREs are highly abundant and functionally redundant, with most SNAREs having multiple and overlapping functions. In this protocol, a new method for the visualization of SNARE complex formation in live cells is described. This method is based on expressing SNARE proteins C-terminally fused to fluorescent proteins and measuring their interaction by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) employing fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). By fitting the fluorescence lifetime histograms with a multicomponent decay model, FRET-FLIM allows (semi-)quantitative estimation of the fraction of the SNARE complex formation at different vesicles. This protocol has been successfully applied to visualize SNARE complex formation at the plasma membrane and at endosomal compartments in mammalian cell lines and primary immune cells, and can be readily extended to study SNARE functions at other organelles in animal, plant, and fungal cells.

This protocol describes a new method allowing for the quantitative visualization of complex formation of SNARE proteins, based on F&#246;rster resonance energy transfer, and fluorescence lifetime imaging microscopy.

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...