우리는 NPY-MRFP의 cDNA의 선물 박사는 미국 Ashery 감사합니다. 우리는 박사 감사합니다. MJ 코프 론 (Kofron), L. 틀먼, M. Shaharbani 및 현미경에 귀중한 도움을 Y. Zilberstein 및 이미지 분석. 우리는 또한이 원고의 중요한 읽기 박사 조셉 오를리 감사합니다. 이 작품은 과학에 대한 이스라엘 아카데미가 설립 한 이스라엘 과학 재단의 연구비에 의해 지원되었다 (12분의 1,139 RS-E에.).

RBL 세포 배양 미디어 1. 준비 <ol><li> (이 ~ 1 % PEST한다) (이 10 % FBS한다) 소 태아 혈청 56 ㎖로 낮은 혈당 둘 베코의 수정 이글 배지 (DMEM)의 500 ml를 혼합 한 다음 페니실린 스트렙토 마이신의 5.5 ml를 추가합니다. </li><li> 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 크기 및 저장소와 500 ~ 1,000 ml의 병 - 최고 진공 필터를 사용하여 미디어를 필터링합니다. </li></ol> RBL 세포의 배양 (2) <ol><li> 어느 플레이트 또는 플라스크에서 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 RBL 세포 성장. 10cm 플레이트에서 성장하고있다 RBL 세포는 10 ml의 매체로 보충 및 10 ~ 7 세포 / 플레이트의 합류 단층을 형성해야한다. </li><li> 세포 층이 합류 해 가면, 낮은 밀도로 배양을 replate. <ol><li> 진공에 연결된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플레이트 / 플라스크로부터 배지를 제거한다. </li><li> (37 데워진와 세포 단층을 씻어전체 단층을 (볼륨이 문화 판 / 플라스크의 크기에 따라 달라집니다 커버 ° C) 0.25 % 트립신 / EDTA; 10cm 판 2 ㎖). 이것은 세포를 분리한다. </li><li> 또한, 인산염과 세포 단층은 식염수 (PBS)를 버퍼 씻어 PBS를 제거 및 / EDTA를 데워진 (37 ° C) 트립신을 추가합니다. 이 단계는 빠른 세포를 분리. </li><li> 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다. </li><li> 가 분리 된 경우 확인하기 위해 광학 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포가 10 분 후 분리하지 않은 경우, 부드럽게 플레이트 / 플라스크에 누릅니다. </li><li> 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크에 배지를 추가 (매질의 부피는 적어도 트립신 용액의 부피보다 더 큰 2 배이어야한다). </li><li> 25 ° C에서 200g에서 3 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛. </li><li> 배지에서 세포를 재현 탁. 1시 10분에 의해 세포를 희석하고 새로운 배양 접시에 씨앗. 그들은 REAC 때까지 48 ~ 72 시간 동안 세포를 품어H 약 90 % 합류점. </li><li> 최대 3 개월 (30 유로)에 대해 동일한 절차 (제 2.2.1-2.2.8)을 반복합니다. </li></ol></li></ol> 형질 미디어 3. 준비. <ol><li> K-파이프의 pH 7, 칼슘 아세테이트의 1 mM의 솔루션과의 Mg 2+ 아세테이트 100 mM의 용액 100 mM의 솔루션을 준비합니다. </li><li> DMEM 매체를 사용하는 20 mM로 K-파이프의 pH 7의 100 mM의 용액을 희석시키고, (2)의 최종 농도로 10 μM Mg를 2+ 아세테이트 100mM의 용액의 최종 농도 칼슘 아세테이트 1mM의 용액을 추가 mm이다. </li><li> 칼륨 글루타민산의 무게를 128 mm의 최종 농도 솔루션에 추가, 잘 섞어 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. -20 ° C에서 남은 해결책 (예., K-파이프, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 2+ 아세테이트)를 유지합니다. </li></ol> RBL 세포의 형질 4. <ol><li> 플레이트를 사용 / 플라스크로부터 배지를 제거진공에 연결 멸균 파스퇴르 피펫. </li><li> 전체 단층을 포함해야한다 데워진 (37 ° C) 트립신 / EDTA와 세포 단층을 씻어. 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다. 세포가 광학 현미경을 이용하여 분리 한 경우 확인합니다. </li><li> 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크 배지 (추가 미디어의 볼륨은 트립신 용액의 부피보다 적어도 2 큰이어야한다). </li><li> 혈구 계를 이용하여 세포 수를 계산. </li><li> 25 ° C에서 200 XG에서 3 분 동안 원심 분리하여 1.5 × 10 7 세포 펠렛. 상층 액을 버리고 형질 매체의 280 μl를 추가합니다. 4mm의 큐벳에 반응 혼합물을 전송합니다. </li><li> 추가 NPY-MRFP 플라스미드의 20 μg의 제어 빈 플라스미드 또는 시험 플라스미드 중 30 μg의. 반응 혼합물의 최종 부피는 300 μL이어야한다. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음에 배치합니다. 잔여 물과 페이지에서 큐벳을 닦아9 밀리 300 V에서 전기에 roceed. </li><li> 세포 외 유출의 측정을 위해 300 ㎕의 매체를 포함하는 24 잘 조직 배양 접시에 즉시 세포를 replate. 물론 각각에 대한 반응 믹스 (4 × 10 5 세포)의 8 μl를 추가합니다. 제어를위한 추가 우물에 4 × 10 5 비 형질 전환 세포를 추가합니다. 적어도 모든 형질에 대한 각각의 치료를 위해 우물을 중복이 수있는 충분한 우물을 준비합니다. </li><li> 시간 경과 현미경, 80 ㎕의 배지를 함유하는 8 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 즉시 세포 replate. 각 실에 대한 반응 믹스 (7.5 × 10 4 세포)의 1.5 μl를 추가합니다. (커버 글라스의 중심에있는 챔버 이미지로 쉽게 커버 글라스의 가장자리에 실을 사용하지 않도록하십시오). 참고 : 중요한 것은, 모든 셀이 트리거가 발생하지 가끔 시간 경과 현미경 인해 8 잘 챔버 borosi의 초점 손실과 드리프트에 폐지된다licate 커버 ​​글라스 시스템. 따라서 각 형질에 대한 각각의 치료를 위해 최소 8 챔버를 준비합니다. </li><li> FcεRI 중재 활성화를위한 세포를 민감를 들어, 미디어 (적어도 2 시간 동안 IgE 항체와 세포를 배양)에 마우스 DNP 특정 단일 클론 IgE 항체의 1 ㎍ / ㎖를 추가합니다. </li><li> 18-24 시간 후에 세포가 플라스미드를 발현하는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용한다. MRFP 형광 여기 및 방출 파장은 다음과 같습니다 λEx 584, λEm 607 nm의. NPY-MRFP는 SG를에 해당 기공 구조에 나타납니다. 제 2 관심 유전자 형광 태그에 융합되는 경우 동일한 셀 양쪽 플라스미드의 공동 발현을 확인하기 위하여 형광 현미경을 사용한다. 테스트 GFP 유전자가 융합 된 경우 예를 들어, GFP 형광의 여기 및 발광 파장은 : λEx 488 λEm 507 ㎚이다. GFP 태그 단백질은 NPY-MRFP을 표현 같은 세포에 나타납니다. </li><li> 세포 외 유출 측정의 경우 t 진행O를 5 단계 및 시간 경과 현미경은 6 단계로 진행합니다. </li></ol> 5. NPY-MRFP 세포 외 유출을 측정 <ol><li> 타이로드 버퍼의 준비 : <ol><li> 54 mM의 KCl을 20 mM의의 MgCl 2, 2.74 M 염화나트륨과 DDW 8 mm의의 NaH 2 PO 4 용액을 준비합니다. 잘 혼합하고 4 ℃에서 저장한다. 이 단계는 20 배 타이로드 버퍼의 준비입니다. </li><li> 20 mM의 헤 페스 용액의 pH 7, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 1 ㎎ / ㎖ BSA, 5.6 mM의 포도당과 DDW에서 타이로드 20 배의 1 ~ 20 희석을 준비하고 잘 섞는다. 이 단계는 1 배 타이로드 버퍼의 준비입니다. </li><li> -20 ℃에서 1X 타이로드 및 저장 버퍼 나누어지는. 반복되는 동결 융해을 피하십시오. </li></ol></li><li> 24 웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 타이로드 버퍼로 3 회 세척한다. 웰을 제어하는​​ 200㎕의 타이로드 완충액을 첨가함으로써 자극되지 않은 세포를 준비한다. </li><li> / 웰의 20 배의 10 μL 시약 [(예 1000 NG / ml의 DNP-BSA 또는 DNP 활성화 농축 준비-HSA은 (Ag), 200 μM 칼슘 이온 운반체 (예 : A23187), 20 μm의 칼슘 이온 운반체 및 1,000 nm의 12-O- 테트라 데카-13 아세테이트 (TPA)]의 조합. 시약은 DMSO에 저장되어있는 경우, 1 % DMSO를 함유하는 타이로드 완충액으로 20 배 농도로 희석 시약. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 96 웰 플레이트에 잘 신중하게 각각의 상층 액을 제거 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다. (상층 액은 세포에서 방출 된 키메라 펩타이드 NPY-MRFP를 포함). </li><li> 각 웰을 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 200 ㎕의 타이로드 완충액을 첨가하고, 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. (이 단계는 세포에서 방출되지 NPY-MRFP의 나머지를 포함하는 세포 용 해물의 준비를위한 중요하다). 세포 용 해물을 수집하고 96 웰 플레이트에 전송, 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다. </li><li> fluoresc를 사용하여 세포 상등액 및 세포 용 해물의 형광을 측정런스 플레이트 판독기, 590-이 20 nm 대역 여기 필터 및 635- 35 nm의 대역폭 방출 필터를 사용. </li><li> 출시 NPY-MRFP의 비율을 계산한다 참고 : 형광 판독기 측정 임의의 형광 단위 (AFU). AFU 값은 기계 및 감도와 형질 감염 효율에 의존한다. <ol><li> 빈 nontransfected RBL 세포의 형광도를 설정합니다. 총 형광 각 상층 액의 AFU (상층 액을 해당 해물 + AFU의 AFU)을 나누고 100을 곱합니다. </li></ol></li></ol> 세포 외 유출의 6 시간 경과 현미경 <ol><li> 8- 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 형질 감염된 세포 / 챔버의 7.5 x 104을 시드. 18-24 시간 후, 챔버에서 배양 배지를 제거하고, 타이로드 완충액으로 3 회 세척 </li><li> 각 실에 타이로드 버퍼의 72 μl를 추가합니다. 10 배 농도로 타이로드 버퍼의 활성화 시약을 희석. </li> &lt;리&gt; 가열 챔버 (37 ° C) 및 CO 2 컨트롤러 (4.8 %)과 40X 또는 63X 목적으로 장착 된 공 초점 형광 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템 켜기 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저를. 가열 된 챔버 실험을 시작하기 전에 적당한 온도에 있는지 확인합니다. </li><li> 가열 된 챔버 챔버를 놓고 챔버 정확하고 안정적​​으로 설치되어 있는지 확인하십시오. </li><li> 관련 형광에 따라 형광 빛을 켜고 형질 감염된 세포를 시각화. 관심의 셀이 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다. 그것은이 필드가 2-3 형질 감염된 세포를 포함하는 것이 중요합니다. 형질 전환 된 세포를 잘 퍼져 있지만 서로 닿지 않도록해야합니다. </li><li> 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 (현미경)에 따라 레이저 전력을 조정하고, 이득을 설정하고, 신호 대 잡음비를 수정 오프셋. 에 빠른 스캔하거나DER 레이저 박람회 (평균 2)의 지속 기간을 최소화한다. </li><li> 이 레이저 파워의 감소 가능 최대 핀홀 크기를 조정하고 장시간 집중 화상을 유지한다. 원하는 경우 Z 스택 이차원 공 촛점 광학 조각의 3 차원, 잡음비 최상의 신호를 제공하는 한 통풍 유닛 (AU)에 핀홀 크기를 조정하고 획득 연속 주사로 화상을 재구성하기 위해, 파라미터 세트 광학 조각 ≤0.7 μm의와 Z -axes. </li><li> 15 ~ 30 초마다 수집 및 15 분에 총 취득의 기간 사이의 시간 간격을 설정하고 이미지를 획득 시작합니다. 취득 5 분 후에 시계열을 일시. 10 배 트리거의 8 μl를 추가하고 즉시 인수를 계속합니다. </li><li> , 사진을 저장 디컨 볼 루션 소프트웨어를 사용하여 디컨 볼 루션을 수행하고 세 가지 차원 이미지와 Imaris 소프트웨어를 사용하여 동영상에 스택을 재구성. </li></ol><ol><li> Imaris 소프트웨어 공 초점 형광 현미경에 의해 수득되었다 deconvoluted 시계열 화상으로부터 데이터를 가져. 이 소프트웨어는 40 개 이상의 현미경 파일을 읽습니다. 소프트웨어는 파일을 읽을 수없는 경우; TIF 파일 및 가져 오기로 파일을 변환합니다. </li><li> 오픈 데이터 세트 프레스 편집의 끝 시점을 추가하려면 -&gt; 새 데이터 세트를 시간 포인트를 추가하고 가져옵니다. </li><li> 표면 마법사 옵션을 사용하여 MRFP 채널의 표면을 만듭니다. 기본 알고리즘을 선택합니다. NPY-MRFP의 채널을 선택합니다. 소음을 줄이기 위해 평활화 옵션을 표시한다. 작은 세부 사항은 0.05 μm의 지역 상세 수준을 감소의 손실을 방지합니다. </li><li> 강도 임계 값을 설정합니다. 새로운 회색 화면이 표시됩니다. &quot;설정&quot;으로 이동하여 &quot;중심점&quot;을 &quot;표면&quot;에서 스타일을 전환합니다. </li><li> 선택된 개체의 속성에서 통계 탭으로 이동하여 상세 탭과 특정 값 SUC을 선택형광 강도로서 H, 볼륨 등 </li><li> 데이터를 검토하고 값이 이미지와 호환되는지 확인합니다. 예를 들어, 두 개 이상의 인접하는 하나의 더 큰 과립은 과립으로서 측정 될 수있다. 평균 과립 크기를 정량화 과립의 실제 개수에 병합 된 과립의 크기를 나눈다. </li><li> 엑셀 파일에 원하는 데이터 세트를 내보내고 데이터를 분석한다. </li></ol> F

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The authors have no financial conflicts of interest.

우리는 세포 외 유출에 대한 리포터 유전자를 사용하여 살아있는 세포에서의 에스 지에스의 시간 경과 3 차원 화상으로의 MCS 엑소 사이토 시스 및 네 개의 값 (x, y, z, t) 치수 정량화 정량화 결합한 혁신적인 전략을 설명한다. 이 기술은 일찍 성숙을 통해 골지체에서 자신의 출구, 세포 외 유출의 능력과 탈과립를 획득하는 등 시작하는 등 모니터링 SG를 같은 MC 기능에 미치는 영향에 대한 단백질의 ...

마스트 셀 (MC)은 가장 관절염, 천식, 호산 구성 식도염, 만성 피부염 및 관상 동맥 질환 및 3,5- 포함한 과민성 쇼크 1,2-뿐만 아니라 다른 병리 알레르기 및 염증성 반응에서 이들의 참여를 위해 공지되어있는 면역 세포 암 3,4. 또한, MC라면은 동종 이식 허용 5,6 유도 예를 들어, 박테리아와 기생충에 대한 숙주 방어와 면역 반응의 억제에 의해 모두, 선천성 및 후천성 면역에 중요한 역할을한다. MC들은 + / CD117 + 능성 전구 세포 (7) CD34에서 개발, 골수에서 유래. 커밋 골수 MC 전구 세포는 혈류에 방출 및 결합 조직과 상피 표면 (8) 내에서 주로 지역화 주변 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 성숙 및 터미널 차별화는 결국 영향 O에서 달성주변 환경의 8,9 내에서 F 사이토 카인. MC라면 누구의 만남 면역 글로불린 E (IgE) 항체 생성의 결과를 입력 알레르겐 (항원),은 (Ag)에 의해 활성화 될 수있다. 동일의 Ag에 다시 노출시 IgE 항체를 결합 셀의 가교 다음에 MC의 FcεRI 수용체, 그러한 IgE 항체의 결합, FcεRI 집계 및 세포 탈과립에 절정 신호 캐스케이드의 개시의 결과는 [10, 11에서 검토] . MC들도, 신경 펩티드 -5,12- 의해 독립적 IgE 항체의 활성 (13), 세균성 및 바이러스 성 항원 14,15 집합 적 분비 기본적인 면역 세포 및 사이토 카인이라고도 5,13,12,16 양전하 펩티드의 수를 독소 17. MC들도 상기 염증 반응을 증폭 자신 방출 매개체 많은 의해 활성화된다. MC라면은 면역을 포함 분비 과립 (SG를)로 포장된다이러한 카이 메이즈와 트립 타제, 혈관 내피 성장 인자와 여러 사이토 카인과 케모카인 8,9 등의 히스타민과 (설치류) 세로토닌 같은 혈관 활성 아민, 프로테오글리칸, 단백질 분해 효소를 포함하여 규제 매개체. 이러한 매개체는 &quot;갈 준비&quot;하고 MC들이 적절한 자극에 의해 활성화되면, 이러한 매개체는 분 18, 19 초 만에 규제 세포 외 유출 (탈과립)에 의해 세포에서 방출된다. 이러한 초기 이벤트는 아라키돈 산 대사 물질, 여러 사이토 카인 및 케모카인 블랭킷을 포함한 생물학적 효능 물질의 큰 배열의 드 노보 합성 및 방출 이어진다. 새로 합성 된 제품의 출시는 독립적으로 SG 릴리스 발생합니다. 종합적으로, 이러한 매개체는 초기와 후기 단계 염증 및 알레르기 반응을 시작합니다. 따라서, MC 활성화 및 탈과립를 차지 메커니즘을 이해하는 것은 이론 및 임상 꼬마 도깨비의 모두는ortance. 유 전적으로 기본 및 배양의 MC를 조작에 어려움이 제대로 해결 남아 MC 탈과립의 기초가되는 메커니즘을 규명하는 시도를 방해하고있다. 관심의 유전자와 함께이 문제를 극복하기 위해, 우리는 공동 형질 점막 비만 세포주, 래트 호 염기 구성 백혈병 리포터 기재 분석법을 개발 하였다 (RBL) -2H3 (본원 RBL라고 함) 또는 골수 유래의 MC (BMMCs) 30 뉴로 펩타이드 Y (NPY)는 SG의 기자로, 단량체 RFP (MRFP)에 융합. NPY는 이전에 다른 시스템에서 내생 SG 마커의 동작을 요점을 되풀이 나타났다. MRFP 형광 둔감 pH가 발현하기 때문에 또한 NPY는 MRFP-96- 웰 플레이트 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 산성 SG를 시각화 할뿐만 아니라 세포 외 유출의 정량적 평가를 허용한다. 우리는 NPY-MRFP가 RBL 세포와 BMMCs의 산성 SG를 전달됩니다 보여 주었다과 세포에서 분리 될 때내생 SG화물 (즉, β-소사 미나와 세로토닌) (30, 32)과 함께 규제 방식. 이 프로토콜은 자신의 표현형과 RBL 세포 32 SG 특성과 탈과립에 기능에 미치는 영향에 대한 관심의 선별 유전자를 할 수있는 고해상도 이미지 기반의 방법을 제공합니다. 즉,이 프로토콜은 실시간 MC SG를 추적 및 면적 또는 체적의 크기, 그들의 수, 조립의 동력학, 세포 골격을 따라 자신의 이동 및 다른 조건 하에서 세포막과의 궁극적 인 융합 정량화 할 수있다. 예를 들어, DNP - 특이 IgE 항체와 세포를 민감하고 다른 섭동에서 다가의 Ag (DNP 결합 혈청 알부민)와 세포를 트리거 (즉, 중량 또는 돌연변이 유전자의 발현, 또는 약리학 적 조작을 통해 관심의 유전자의 최저) 및 셀을 제어하는​​ 비교.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

마스트 셀 (MC)를 형성 미리 새로 합성, 알레르기 염증 및 면역 매개 물질을 방출하여 생리 학적 및 병리학 적 기능을 수행하는 면역 체계의 분비 세포이다. MC들 &#39;매개 알레르기 및 면역 반응에서 남중 여러 조직과 장기에 영향을 미친다. MC 매개체의 합성, 저장 및 방출은 매우 통제된다. 예비 형성된 매개체는 세포막과 융합 세포 외 유출에 의해 규제 대상 콘텐츠를 해제 세포질 분비 과립 (SG)에서 포장된다. 우리는 SG를 대상으로하고 내인성 SG 매개체와 함께 조절 된 방식으로 방출된다 리포터 유전자를 사용하여 원하는 유전자의 공동 발현에 기초하여 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 MC SG를 분석하고 트리거 세포 외 유출에 생합성에서 자신의 타임 라인을 모니터링 높은 해상도 네 차원 공 초점을 수 있습니다. 따라서, 간 유전자의 스크리닝이 프​​로토콜을 이용하여자신의 표현형 및 기능에 미치는 영향에 대한 추정치는 MC SG를의 생합성 및 세포 외 유출을 제어하는​​ 분자 메커니즘을 해독과 관련된 규제를 식별 허용한다. 이에 따라, 건강과 질병에서의 MC 기능을 설명 세포 메커니즘으로 더 통찰력이 제공되어야한다.

때문에 MC들의 낮은 형질 전환 효율의 유전자 조작은 내생 SG를 매개체에 의해 측정 된 평균 분비의 판독에 영향을 떠나지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 독점적 목적 유전자를 발현 세포 집단을 모니터링하는 리포터 유전자 NPY-MRFP 완전히 공동 발현과 같은 세포에 동시 형질 플라스미드, NPY-MRFP 모니터링 결과를 설정하여. 따라서, 종래의 방법에 비해이 분석의 장점은 선택적으로 유 전적으로 ?...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.

비만 세포 분비 과립을 조사; 생합성에서 세포 외 유출에

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K 조회수.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석. 

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

임상 신청<em&gt; 잠자는 숲속의 미녀</em유전자 주변과 배꼽 탯줄 혈액에서 T 세포를 수정하는 셀을 제시&gt;과 인공 항원

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

탯줄 혈액에서 전구체 B-세포 하위 집합의 절연

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

'마스트 셀 노크-인' 마우스를사용 하 여 생체 내 비만 세포의 기능 분석

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

복 막 파생 돛대 세포 및 그들의 기능 특성화 캘리포니아2 +의 격리-이미징 및 Degranulation 분석 실험

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

조사 된 버피 코트에서 피더 세포를 사용하여 T 림프구의 격리 및 배양을 통해 대동맥 밸브 석회화 조사

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

호스트-병원균 상호 작용을 연구하기 위하여 동일 종에서 항체를 사용하여 면역 형광을 이중 표지합니다

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.