Name: macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans at JoVE.com

이 작품은 NIH 보조금 MDP에 AI56168, AI71142, AI87541 및 AI100631에 의해 지원되었다. 마우리 치오 델 포에 타는 감염증에 버로우즈 웰컴 탐정이다.

MβCD와 J774A.1 세포의 1. 콜레스테롤 고갈 <ol><li> 멸균 생물 안전성 캐비닛, 시드 105 J774A.1 식세포 유사 세포 웰 당 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) 200㎕의 1 %에서 96 웰 세포 배양 접시에 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 37 ° C에서 품어 5 % CO 2 O / N. </li><li> 세포 단일 층에서 미디어를 제거하고 여과 또는 멸균 된 1 배 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 제어로 원하는 농도 (10 PBS에서 MM 또는 30 mM의) 또는 1X PBS에서 MβCD 솔루션의 200 μl를 추가하고 진탕 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다. 즉시 절차에 따라 시판 키트와 함께 정량 분석​​을 실온에서 뜨는 및 예약을 제거합니다. </li><li> 1X PBS 또는 혈청 무료 DMEM으로 세포를 2 ~ 3 배를 씻고 pipetti에 의한 감염이나 세포를 Lyse 계속박층 크로마토 그래피 또는 키트와 분석을위한 탈 H 2 O와 2 ~ 3 배 겨. 참고 : 시판 콜레스테롤 정량 키트를 사용할 수있는 콜레스테롤 고갈 이어. 자세한 내용은 자료 섹션을 참조하십시오. 작성된 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol> 박층 크로마토 그래피에 의한 콜레스테롤 내용 2. 관측 (TLC) <ol><li> 석유 에테르 용액을 아세톤으로 2 회 및 한 번 탱크 TLC 세탁 : 디 에틸 에테르 : 아세트산 (65 : 30 : 1, 부피 기준). (부피 기준으로 1~65 : 30) 용액 및 / N을 O두고 아세트산 : 디 에틸 에테르 : 석유 에테르로 적신 탱크. 참고 : 유기 용매는 항상 증기 흡입을 방지하기 위해 흄 후드를 사용해야합니다. 장갑 및 실험실 코트는 항상 착용해야합니다. 아세트산은 강산과주의를 요합니다. </li><li> 6 잘 가전에 잘 당 멸균 바이오 안전성 캐비닛에, 씨 (10) 6 J774A.1 대식 세포와 같은 세포10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한 5 ㎖의 부피 LL 배양 플레이트. 5 %, 37 ° C에서 품어 CO 2 O / N. </li><li> 1.4 더 잘 크기를 고려하여 적용 할 수있는 200 ㎕를 1 ml의 대체 - 단계 1.2에 따라 콜레스테롤의 대 식세포를 고갈. </li><li> , 각 웰에 트립신 - EDTA의 500 μl를 추가, 37 ℃에서 3 분 동안 품어 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어. </li><li> 미세 원심 분리 튜브로 옮기고, 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한의 추가 500 μL를 추가한다. </li><li> 300 XG에서 5 분 동안 세포를 스핀 상층 액을 제거합니다. </li><li> 세포 펠렛에 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM 따뜻한의 추가 500 μl를 첨가하고, 피펫 팅 상하로 재현 탁 신중. </li><li> 세포의 10 μl를 제거하고 혈구에 세포를 계산합니다. 각 샘플로부터의 세포 농도를 정상화 유리관 셀들의 동일한 수를 추가한다. 참고 :이 단계에서, 한 5 월최종 지질 농축 된 추출물을 수득 동일한 치료군에서 세포를 결합하도록 선택. </li><li> 원심 분리기 세포 미디어 RT에서 5 분 300 XG에 제거합니다. </li><li> 메탄올과 소용돌이 2 ㎖를 추가합니다. 그런 다음, 클로로포름과 소용돌이 1 ㎖를 추가합니다. 단상에서 확인 솔루션을 만들기 위해 위상 상태를 확인합니다. 참고 : 튜브가 4 ° CO / N에 저장할 수 있습니다. </li><li> 실온에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기 새로운 튜브에 뜨는을 전송 </li><li> dH보다 2 O 1 ml의 클로로포름과의 추가 1 ML을 추가 두 번 30 초 동안 소용돌이. 실온에서 5 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기. </li><li> 민감한 균형 유리관을 달아 공지 중량의 유리관에 하층을 전송할 유리 파스퇴르 피펫을 사용한다. </li><li> 건조 (약 2 시간)까지 원심 증발기에서 지질을 건조시킵니다. 건조 지질와 튜브의 무게를 측정하고 건조 지질 무게를 계산한다. 주 : 건식 지질 TLC를 수행 할 준비가 될 때까지 -20 ° C에 저장 될 수있다. </li><li> (- 50 μL 일반적으로 20)와 실리카 TLC 판에 희석 된 지질의 부하 20 μL 지질의 농도를 정상화하는 데 충분한 클로로포름에 건조 지질을 희석. 부하 (20)를 표준으로 클로로포름 20 μL 희석 μg의 콜레스테롤. </li><li> 포화 TLC 탱크로 건조 TLC 판을 추가하고 플레이트 에지 전에 1cm까지 마이그레이션 할 용매 수 있습니다. 탱크에서 TLC 플레이트를 제거하고 약 5 분을 건조 할 수 있습니다. </li><li> 마이그레이션을 확인하기 위해 요오드 증기 탱크에 배치하여 지질을 시각화. 제거 및 관광 명소가 약 10 페이드 할 수 - 후드 15 분. 참고 : 요오드 흡입의 위험이다. 항상 흄 후드를 사용합니다. </li><li> 탈 H 2 O 60 ㎖, 황산 4 ㎖, 망간 클로라이드 630 mg을 메탄올 60 ㎖에 결합하여 중성 지질 염색 용액을 준비한다. </li><li> 조심스럽게 천천히 트레이에 중성 지질 염색 액에 TLC 판을 찍어 실리카 리터를 벗기없이 제거이어. 참고 : 중성 지질 염색 액을 여러 번 재사용 할 수있는 등 용지함에서 용지를 검색 할 수 있으며, 나중에 사용하기 위해 병에 다시 배치. </li><li> 모든 거품이 사라질 때까지 판 실온에서 후드 아래에 건조하도록 허용합니다. 원하는 색상에 열 블록 160 ° C로 설정하고 문자에 TLC 판을 가열한다. 주 : 안과 같은 공공 LS 농도계 프로그램 지질 샘플과 비교 까맣게 대역을 정량화하는데 사용될 수있다. </li></ol> C.와 대 식세포의 3. 감염 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99) <ol><li> 멸균 생물 안전성 캐비닛, DMEM 웰에 200㎕를 96 웰 세포 배양 플레이트에 시드 (10)가 당 5 대 식세포 유사 세포는 10 % FBS와 1 % P / S가 보충. 37 ° C, 5 % CO 2, 5 % CO 2 O / N에서 인큐베이션. 참고 : 감염도 유리 수행 할 수 있습니다 쉽게 이미징을위한 공 초점 요리를 바닥; 모든 금액은 동일하게 유지됩니다. </li><li> C.의 문화를 성장 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99)강타 판에서 얻은 하나의 식민지로 YNB 10 ㎖를 접종하고 진탕 30 ° C에서 / O N 그것을 배양하여. </li><li> 씻고 C.를 계산 콕 쿠스 네오 포르 만 스 (H99) 세포. <ol><li> 원심 분리기 C. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 콕 쿠스 네오 포르 만 스 O / N 문화. </li><li> 용지를 제거하고 폐기합니다. 1X PBS의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기. </li><li> PBS를 제거하고 여과 1X PBS 5 ㎖로 세척한다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,700 XG에 원심 분리기. 이 단계 2 번 이상 반복합니다. </li><li> PBS를 제거하고 1X PBS 5ml에 재현 탁. </li><li> 세척 문화의 500 희석 : PBS의 일련의 희석은 1를 획득 할 수 있습니다. <ol><li> 1:10 희석을 얻기 위해 1X PBS 900 ㎕를 원래 시료 100 μl를 추가합니다. </li><li> (100) 희석 : 1을 얻기 위해 1X PBS 900 ㎕를 1:10으로 희석 시료 100 μl를 추가합니다. </li><li> 500 diluti : 1을 얻기 위해 1X PBS 800 μL에 100 희석 샘플 : 1의 200 μl를 추가에 </li></ol></li><li> (1)의 10 μL 가라 : 500 희석하고 세포의 수를 계산하는 데에 혈구 계산. </li></ol></li><li> C.를 대 식세포를 활성화하고 opsonizing 위해 일하는 솔루션을 준비합니다 콕 쿠스 네오 포르 만. <ol><li> 990 μl의 10 μl를 추가하여 원액에서 LPS와 IFNγ의 100 배 희석. 참고 : LPS와 IFNγ는 식세포 흡수를 향상시키기 위해 사용되지만 식균 작용이 필요하지 않습니다. 대 식세포의 살 진균 활성에 관심이있는 경우, 감염에 앞서 진탕하면서 37 ℃에서 활성화 O / N을 수행한다. </li><li> 샘플 당 희석 된 7.5 ㎕의 LPS, IFNγ 희석의 1.25 μL, GXM 항체 1.25 μL 및 C.의 체적을 결합 1.25 × 10 5 세포를 제공 콕 쿠스 네오 포르 만의 문화. 10 % FBS와 1 % P / S가 보충 된 DMEM와 샘플의 수를 곱한 250 μL 최대 용적을 가지고. </li><li> 소용돌이와 진탕 37 ° C에서 20 분 동안 솔루션을 품어. 참고 :옵 소닌 단계와 동시에 수행 할 수 있습니다 - 콜레스테롤 고갈 (1.4 1.2 단계). 옵 소닌 세포가 최적 단계 3.4.3 배양 한 다음 20 분보다 더 이상 사용해야 같이 작업 솔루션을 결합하기 전에 대식 세포를 치료해야합니다. </li></ol></li><li> 대 식세포를 감염 <ol><li> 세척 대 식세포 두 번 혈청 무료 DMEM와 옵 소닌 C. 200 μl를 추가 콕 쿠스 네오 포르 만이 아니라 각 솔루션을 작동합니다. </li><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 품어. </li></ol></li><li> 수정 및 얼룩 세포 <ol><li> 용지를 제거하고 DMEM으로 세포를 제거하는 과정을 2 회 반복한다. </li><li> 공기는 10 분 동안 세포 단일 층을 건조하고 세포를 해결하기 위해 얼음 냉 메탄올 200 μL를 추가합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 품어 남아있는 메탄올을 제거합니다. </li><li> 10 배 김사 200 μl를 추가하고 RT에서 5 분 동안 품어. </li><li> 오프 캡을 탈 이온수 건조 O / N로 3 회 - 2 씻으십시오. 참고 : 이미징은 주 followi에 다음날 수행 또는 최대 수NG 염색. </li></ol></li><li> 시각화 및 개수 <ol><li> 현미경을 사용하여, (물론 당 150 카운트 같은 치료의 2가있는 경우) 데이터 포인트 당 300 세포를 계산하고 침몰 크립토 셀의 감염된 대 식세포의 수와 번호를 적어 둡니다. 참고 : 상태별로 데이터 포인트 사용 당 2 판을 샘플링도 확인 판에 3 비 중첩 영역을 선택하고 영역 당 50 셀을 계산합니다. </li><li> C.의 평균 숫자로 감염된 대 식세포의 비율을 곱하여 계산 균성 인덱스 대 식세포 당 콕 쿠스 네오 포르 만. 1X PBS의 비율이 제어 처리로 값을 표현함으로써 식세포 인덱스를 정상화. 여러 실험 후 평균값과 식세포 지수 경향을 결정하기 평균의 표준 편차를 계산한다. 의미를 결정하기 위해 학생 t-test를 사용합니다. </li><li> 1000 배 또는 400 배의 배율로 세포의 현미경 사진을 가져 가라. </li></ol></li></ol> 4. 트리 판 블루 분석 <ol><li> 멸균 생물 안전성 캐비닛, 시드 106 식세포 유사 세포 당 웰의 체적 6- 웰 세포 배양 접시에 5, 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신이 보충 된 둘 베코 최소 필수 배지 (DMEM) ml의 . 5 %, 37 ° C에서 품어 CO 2 O / N. </li><li> 물론 더 큰 크기를 고려하여 해당되는 200 μL가 2 ㎖에 대입 1.4 - 1.2 단계를 수행하여 콜레스테롤 식세포를 고갈. 참고 : 1X PBS뿐만 아니라 치료 전에 긁어 제어로 처리하는 컨트롤을 포함해야합니다. </li><li> 각 웰에 1X PBS의 500 μl를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 긁어. 미세 원심 튜브에 전송하고 부드럽게 피펫 아래로 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 4 % 트리 판 블루의 1 μL와 세포와 얼룩의 10 μl를 제거합니다. </li><li> 혈구에 세포를 계산하고 다음 식을 이용하여 생존을 계산 : % 생존 = [1 - (블루 세포 / 총 세포)]치료했다 컨트롤에 X 100 표준화 값. 여러 실험 후 평균값과 생존의 경향을 결정하는 표준 편차를 계산한다. 의미를 결정하기 위해 학생 t-test를 사용합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 프로토콜과 협력 이는 포유류 세포를 C. 도금 및 opsonizing 때 정확한 세포 수를 구하는 것이 중요 콕 쿠스 네오 포르 셀. 이 시험 사이의 변화를 최소화하고 정확한 일 보장 : 연구를 통해 이펙터 비율 1 목표. 또한 절차 사이에 RT에서 휴식에서 옵 소닌 효모 세포 또는 처리 된 대 식세포를 방지 콜레스테롤 고갈과 감염의 타이밍을 조정하는 것이 중요하다. 감염이 시작하기 전에 긴 ?...

탐식 세포 외 실체가 숙주 세포에 의해 내재화되는 과정입니다. 또한 병원균에 대한 방어 면역 체계의 병기 키 무기이지만, 프로세스는 종종 내재화 및 본체 (1) 전체에 확산을 허용하도록 병원균 전복 될 수있다. 탐식 숙주 세포의 세포 골격 재 배열을 통한 부착과 말림을 초래할 여러 시그널링 이벤트에 의해 매개된다. &#39;전문&#39;식세포는 첨부 파일과 병원균을 삼켜과 phagosome 2를 형성 멜리의 형성에 대한 신호를 침입 병원균의 표면에 opsonins로 인식하고 결합 할 수 있습니다. 소위 &#39;전문가&#39;식세포 중 대 식세포이다. 대 식세포는 대부분의, 추구와 질병의 원인이 에이전트를 제거, 손상된 조직을 복구 및 염증을 매개하는 등 보호 기능을 수행 고도로 전문화 된 세포이다식균 작용 1,2의 과정을 통해 이들. 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만은 크립토로 알려진 심각한 질병을 일으키는 병원성 효모의 종입니다. 크립토 포자는 호스트에 의해 흡입 일반적으로 무증상 폐 ​​감염이 발생할 수 있습니다. 노광이 매우 만연이라고 사료된다; 조사 된 모든 사람들은 크립토 다당류 glucuronoxylomannan 및 다른 연구에 대한 항체를 가지고 있다는 클리닉 브롱스 레바논 병원 센터에서 발견 된 소아 감염성 질환 61 어린이의 샘플은 모두 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염되지 않은 감염된 성인 3 유병률을 보여 주었다 4. 폐포 대 식세포가 성공적으로 명확 병원체 폐 감염에 대부분의 경우 응답의 첫 번째 줄입니다. 그러나, 면역 개인 (예를 들면, HIV 및 AIDS 환자)에 효모는 대 식세포 내에서 생존 할 수있다. 이들에이 경우, 대 식세포는 병원체의 복제 틈새의 역할을 할 수 있으며 5 치명적인 질병해진다 중추 신경계 (CNS)의 보급에 용이하게 할 수있다 - 8. 11 - 그것은 식세포 심지어 &quot;트로이 목마&quot;모델 3,9- 통해 혈액 뇌 장벽을 통과하는 효모 돕는 수막에 직접 효모를 전달할 수 있다고 생각된다. 따라서, 탐식 과정과 특히 크립토 감염에 영향을 끼치는 요인을 이해하는 것이 중요하다. 15 - 다른 병원체 시스템의 이전 작업은 식균 작용 (12)에 중요한 역할을 갖는 것으로 콜레스테롤에 의해 형성 콜레스테롤과 지질 뗏목을 가리 킵니다. 콜레스테롤은 포유 동물 세포에 가장 풍부한 지질 종 및 25 포함 - 포유류 세포 막 (16)의 50 %. 그것은 BIOP를 변조하는 역할을하는 것으로 밝혀졌다자신의 강성 (17)을 변경하여 막 A. 물리적 특성. 콜레스테롤과 스핑 고리 피드 함께 지질 뗏목으로 알려진 막 내 지질 마이크로 도메인을 형성한다. 18 - 지질 래프트은 카베 올래의 형성뿐만 아니라, 신호 (16)의 특정 유형에 대한 격리 영역을 제공하는데 관여하는 것으로 밝혀졌다. 그들의 작은 크기 때문에, 이것은 생체 내에서의 지질 래프트를 연구하기가 어렵다. 지질 래프트의 역할을 연구하기위한 유용한 방법은 성분을 변경하는 것이다. β 메틸 시클로 덱스트린 (MβCD)는 포유류 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 밝혀졌다 일반적 지질 래프트 (18)의 역할을 연구하기 위해 사용되는 화합물이다. 이러한 프로토콜에서는, 숙주 세포 막으로부터 콜레스테롤을 고갈 및 C.를 탐식하는 숙주 세포의 능력 고갈의 효과를 정량화하는 방법을 제시 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 절차는 세포 배양 techniq 이용한다감염 모델로 세포주 (J774A.1) 같은 불멸의 대 식세포에 단말. 콜레스테롤 고갈 스테롤의 크기에 특정 소수성 코어를 가지고 있으며, 콜레스테롤 막 (19) 밖으로 묘화하는 싱크 역할을 할 수 MβCD에 노출에 의해 이루어졌다. 콜레스테롤 고갈 정량적 시판 키트를 사용하고 질적으로 박층 크로마토 그래피 (TLC) (20) 다음에 수정 된 후 Bligh-다이어 지질을 추출하여 측정 하였다. . (23) - 탐식은 대 식세포를 활성화하기위한 인터페론 γ 및 리포 폴리 사카 라이드의 칵테일 혼합 옵 소닌 효모의 문화 세포주를 감염에 의해 측정 된 크립토는 glucuronoxylomannan (GXM) 항체 (21)를 사용하여 옵 소닌했다. 염색 현미경 실험은 식균 작용의 정도를 평가하기 위해 세포를 시각화 및 포식성 지수 계산을 허용했다. 이 프로토콜 D, 함께 촬영생리적 과정 지질 조성의 변화를 통합 기본적인 방법 escribes.

<table><tbody><tr><td>Class II type A2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 cell line</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Store at 4 &amp;deg;C and warm to 37 &amp;deg;C prior to use</td></tr><tr><td>HI Fetal Bovine Serum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Keep frozen at -20 &amp;deg;C and thaw before adding to DMEM</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Used to suplement DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Cell culture incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3530</td></tr><tr><td>96-Well culture dish</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.</td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molecular Probes</td><td>A12216</td><td>All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.</td></tr><tr><td>96-Well Black Assay plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Model F5</td></tr><tr><td>TLC chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Paper</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Cut down to size needed for TLC tank</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td>Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards</td></tr><tr><td>6-Well plate</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Model Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Model # MS104S meaures down to 0.1 mg</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Model # SPD2010</td></tr><tr><td>Petroleum ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 with concentrating zone</td><td>Analytical Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Iodine chips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganese chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging System</td><td>Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Use the Vision Works LS software for densitometry analysis</td></tr><tr><td>Glass bottom confocal dish</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Obtained from Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution</td></tr><tr><td>Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Gift from Arturo Casadevall&#039;s Lab concentration is 1.98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 &amp;deg;C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images</td></tr></tbody></table>

macrophage cholesterol depletion and its effect on the phagocytosis of cryptococcus neoformans

크립토는 속 크립토의 병원성 곰팡이에 의해 발생 생명을 위협하는 감염입니다. 감염 깊은 폐에 복제 할 수 포자의 흡입에 발생합니다. 크립토 식세포의 탐식 수막뇌염 치명적인 질병을 일으키는 중추 신경계로 확산 할 수있는 방법 중 하나이다. 따라서, 크립토 식세포 간의 관계에 대한 연구는 감염의 진행을 이해하는 것이 중요하다. 본 연구는 C.에 의해 대식 세포 감염을 연구하는 단계별 프로토콜을 설명합니다 체외에서 콕 쿠스 네오 포르 만. 이 프로토콜을 이용하여, 호스트 - 호스트 상호 작용에 대한 병원체 스테롤 역할이 검토되고있다. 상이한 농도의 메틸 - 시클로 덱스트린 (MCD)는 뮤린 세망 육종 식세포 같은 세포주 J774A.1에서 콜레스테롤을 고갈하는데 사용되었다. 콜레스테롤 고갈을 확인하고 시판 availabl를 사용하여 두 정량전자 콜레스테롤 정량 키트 및 박층 크로마토 그래피. 콜레스테롤 세포 고갈 Lipopolysacharide (LPS) 및 인터페론 감마 (IFNγ)를 사용하여 (1)의 활성화 및 이펙터 대 표적 비율 항체 - 옵 소닌 크립토 콕 쿠스 네오 포르 만 스 야생형 H99 세포를 감염시켰다 1. 감염된 세포는 C.와 배양 2 시간 후 관찰 하였다 콕 쿠스 네오 포르 만 그들의 균성 지수를 계산 하였다. 콜레스테롤 고갈 식세포 인덱스 상당한 감소 결과. 제시된 프로토콜은 실험실 환경에서 악성 프로세스의 개시를 모방하고 감염성 숙주에 지질 조성물의 역할을 연구하기에 편리한 방법을 제공한다.

콜레스테롤 고갈 1X PBS 대조군에 비해 Amplex 레드 콜레스테롤 분석 키트 제조업체의 지침에 따라 프로토콜의 단계 1.3에서 예약 된 상층 액의 분석은 MβCD 처리 샘플 콜레스테롤의 높은 농도를 산출한다. 세포의 종류와 MβCD 농도 사용 콜레스테롤 고갈에 따라 다를 수 있습니다. 10mM의 MβCD 처리 J774 들어, 약 50 %의 고갈이 관찰되었다. 고갈 1.4 단계 (도 1)에 수집 된 상등...

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Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

12.6K 조회수.  Stony Brook University. In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections. 

비디오: Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Depletion and Reconstitution of Macrophages in Mice

Macrophages are critical players in the innate immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune response and directing the acquired immune response. Macrophage dysfunction can lead to an inability to mount an appropriate immune response and as such, has been implicated in many disease processes, including inflammatory bowel diseases. Macrophages display polarized phenotypes that are broadly divided into two categories. Classically activated macrophages, activated by stimulation with IFN&gamma; or LPS, play an essential role in response to bacterial challenge whereas alternatively activated macrophages, activated by IL-4 or IL-13, participate in debris scavenging and tissue remodeling and have been implicated in the resolution phase of inflammation. During an inflammatory response in vivo, macrophages are found amid a complex mixture of infiltrating immune cells and may participate by exacerbating or resolving inflammation. To define the role of macrophages in situ in a whole animal model, it is necessary to examine the effect of depleting macrophages from the complex environment. To ask questions about the role of macrophage phenotype in situ, phenotypically defined polarized macrophages can be derived ex vivo, from bone marrow aspirates and added back to mice, with or without prior depletion of macrophages. In the protocol presented here clodronate-containing liposomes, versus PBS injected controls, were used to deplete colonic macrophages during dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice. In addition, polarized macrophages were derived ex vivo and transferred to mice by intravenous injection. A caveat to this approach is that clodronate-containing liposomes deplete all professional phagocytes, including both dendritic cells and macrophages so to ensure the effect observed by depletion is macrophage-specific, reconstitution of phenotype by adoptive transfer of macrophages is necessary. Systemic macrophage depletion in mice can also be achieved by backcrossing mice onto a CD11b-DTR background, which is an excellent complementary approach. The advantage of clodronate-containing liposome-mediated depletion is that it does not require the time and expense involved in backcrossing mice and it can be used in mice regardless of the background of the mice (C57BL/6, BALB/c, or mixed background).

Macrophages play a central role in homeostasis and pathology in many tissues. The protocol presented here describes methods for depleting macrophages in vivo, deriving polarized macrophages from bone marrow aspirates, and adoptively transferring macrophages into mice. These techniques allow determination of the role that polarized macrophages play in health and disease.

마우스의 Macrophages의 고갈과 Reconstitution

Macrophages are critical players in the innate  immune response to infectious challenge or injury, initiating the innate immune  response and directing ...

연구

면역학 및 감염병학

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation of experiments, fresh or frozen monocytes are cultured in flasks for 1 week with M-CSF to induce their differentiation into macrophages. Then, the macrophages can be harvested and seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments. The use of defined numbers of macrophages rather than defined numbers of monocytes to initiate macrophage cultures for experiments yields macrophage cultures in which the desired cell density can be more consistently attained. Use of cryopreserved monocytes reduces dependency on donor availability and produces more homogeneous macrophage cultures.

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. The protocol utilizes cryopreservation of monocytes coupled with their bulk differentiation into macrophages. Then harvested macrophages can then be seeded into culture wells at required cell densities for carrying out experiments.

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

대 식 세포에의 한 사 멸 티 모 세포 침 몰의 실험 분석

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...

The Effect of Aspirin and Ibuprofen on the Phagocytic Ability of Macrophages

This video showcases a method to assess the impact of aspirin and ibuprofen, at their minimum inhibitory concentrations, on macrophage phagocytosis using pH-sensitive fluorescent dye-stained fungal cells. The drugs inhibit cyclooxygenase-2, decreasing prostaglandin formation and boosting macrophage phagocytosis, as observed through fluorescence measurements of pH-sensitive dye.

아스피린과 이부프로펜이 대식세포의 식세포 능력에 미치는 영향

1. Safety considerations

	Personnel should use personal protective equipment (PPE).
	Handle the pathogen and macrophages in a Class II Biological safety ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Cellular Immunodiagnostics

Effect of Aspirin and Ibuprofen on Phagocytic Ability of Macrophages

Begin with a culture of the murine macrophage cell line, grown in complete RPMI 1640 medium, as described in the text protocol.
Additionally, prepare a culture of Cryptococcus neoformans resuspended in PBS to the desired concentration, as mentioned in the text protocol.&#160;
To stain the cryptococcal cells with the phagocytosis stain, dispense 999 microliters of the cells into a microcentrifuge tube. Add 1 microliter of the stain to the tube. Incubate the cells for 1 hour at room temperature, in the dark, with slow agitation.
After incubation, wash the cells by first centrifugation. Then, discard the supernatant. Resuspend the cells with PBS and repeat the washing step two additional times.
Dispense 100 microliters of the Cryptococcus neoformans cell suspension into the wells of the 96-well plate containing the cultured macrophages.
To study the effect of the test drugs on macrophage phagocytosis, dispense 100 microliters of the desired test drug into appropriate wells of the 96-well plate as described in the text protocol.
Incubate the plate in a carbon dioxide incubator for 2 to 6 hours. At the end of the incubation, measure the fluorescence from the phagocytic stain.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향

요약

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대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법

대 식세포 콜로니 자극 인자 차별화 된 인간 단핵구 유래 대 식세포의 문화

방법은 지질 호중구의 변경 및 호중구 세포 외 트랩의 후속 형성을 연구하기 위해

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아스피린과 이부프로펜이 대식세포의 식세포 능력에 미치는 영향