이 방법은 마우스 배아 줄기 세포에 있는 동종 재조합 사건을 확인하는 것과 같은 분자 및 세포 생물학 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 정확하고 신뢰할 수 있으며 널리 사용된다는 것입니다. 따라서, 이 방법은 마우스 배아 줄기 세포에 있는 동종 재조합 사건을 확인하는 통찰력을 제공할 수 있습니다.
그것은 또한 유전자 변형 된 세포 또는 동물과 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다. 일반적으로 이 메서드를 새로 사용하는 개인은 시간이 오래 걸리고 여러 단계가 수반되기 때문에 어려움을 겪게 됩니다. 각 gDNA에 대해 DRA 1, DRA 1의 마이크로리터 3개, 샘플당 10마이크로그램의 gDNA에 10마이크로리터의 마이크로리터 30마이크로리터를 혼합합니다.
최종 부피가 30 마이크로리터가 될 때까지 물을 추가하고 밤새 섭씨 37도에서 배양하여 gDN을 소화합니다. 에디움 브로마이드와 함께 1%아가로즈 전기포고증 젤을 준비합니다. 이전에 획득한 샘플을 한 KB 사다리와 함께 젤에 로드하고 밤새 30~40볼트로 실행합니다.
다음 날, 0.2 뉴턴 염산 용액이 들어있는 트레이에 젤을 담급니다. 셰이커를 사용하여 실온에서 20분 동안 트레이를 부드럽게 흔들어 줍니다. 젤을 DNA 데니밍 용액을 함유한 트레이로 옮기.
실온에서 20분 간 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 젤을 DNA 중화 용액을 포함하는 트레이로 옮김합니다. 실온에서 20분간 부드럽게 흔들어 줍니다.
신속한 하향 전달 시스템을 사용하여 DNA를 젤에서 멤브레인으로 이송합니다. 다음으로 제조업체에서 제공하는 지침에 설명된 대로 서청 블로터 및 블로팅 스택을 조립합니다. 그 후 멤브레인을 꺼내 식염수 2개로 1분간 씻어내세요.
조직으로 액체를 흡수한 다음 UV 크로스링커를 사용하여 DNA를 멤브레인과 연결합니다. 방사능으로 DNA 프로브를 라벨링하기 시작하려면 DNA 라벨링 구슬을 사용할 준비가 된 튜브에 열 변성 프로브 DNA를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 섞어 드시고 있습니다.
그리고 방사성 라벨데옥시토딘 삼중산염의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분간 배양하세요. 제조업체에서 제공하는 지침에 따라 G 50 마이크로 컬럼을 사용하여 라벨이 부착된 프로브를 정화합니다.
신경화 카운터를 사용하여 방사능을 측정합니다. 라벨이 부착된 프로브로 멤브레인을 혼성화하기 시작하려면 멤브레인을 혼성화 튜브에 넣습니다. 혼합 된 사전 혼성화 솔루션을 추가합니다.
튜브를 혼성화 오븐에 넣고 사전 혼성화가 섭씨 42도에서 30분 동안 진행하게 하십시오. 그런 다음 오븐에서 튜브를 제거하고 50 밀리리터 튜브에 사전 혼성화 용액을 붓습니다. 변성 프로브를 추가하고 부드럽게 섞습니다.
비혼성 프로브를 제거하려면 멤브레인을 0.1% SDS의 X 식염수 화 분과 함께 트레이에 넣고 10 분 동안 섭씨 55 ~ 60도에서 부드럽게 흔들어 줍니다. 그런 다음 멤브레인을 플라스틱 랩으로 감싸고 노출 카세트에 고정하십시오. 어두운 방에서 멤브레인을 X 선 필름 2장에 노출시킵니다.
결과를 시각화하기 위해 필름을 개발합니다. 프로브에 의해 검출된 DNA 대역의 크기에 따라 해당 ES 클론이 재조합 대상을 원하는 복제본인지 여부를 결정한다. 본 연구에서, 남부 블로팅 및 PCR은 ES 세포 기반 HR 매개 타겟팅 기술을 사용하여 NM 2개의 유전자 대체 마우스 모델의 생성을 위해 마우스 ES 세포에서 발생하는 HR 이벤트를 식별하는 데 활용된다.
게놈 DNA는 다른 길이를 가진 많은 조각으로 절단되기 때문에, DNA 젤에 상태 같이 얼룩을 표시합니다. 이것은 게놈 DN의 완전한 소화를 건의합니다. 남부 블로팅의 마지막 단계로, 표적 DNA 단편과 혼성화하는 방사능 표지 프로브의 신호가 필름에 표시됩니다.
예상 대역의 모양은 ES 클론에서 HR 이벤트의 발생을 반영합니다. 연구에서 사전 설계에 따르면, 돌연변이 된 진상색을 가진 ES 클론은 두 개의 뚜렷한 크기 밴드가 있습니다. 야생 형 ES 클론은 하나의 밴드가 있지만 원하는 ES 클론이 이종화구스라고 제안합니다.
PCR 반응에 따라, PCR 제품은 DNA 젤에서 분석될 수 있다. 올바른 크기의 특정 NPCR 대역이 관찰되는 경우, 이는 해당 PCR 대역을 시퀀싱하여 더 확인할 수 있는 HR 이벤트의 발생을 시사한다. 이 기술의 의미는 기초가 동일하기 때문에 점 돌연변이를 확인하는 치료로 확장되었습니다.
이 절차를 시도하는 동안 인내심과 주의하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 구만체동물의 형성과 같은 추가 질문에 대답하기 위해, 포모세포에 ES 세포의 미세 주입과 같은 다른 방법이 수행 될 수있다. 그것의 발달을, 이 기술은 특정 유전자의 기능 또는 마우스 또는 그 너머에 있는 돌연변이한 유전자의 결과를 탐구하기 위하여 분자와 세포 생물학의 그들의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
방사능 라벨러 P32 DCTB와 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 보호 보드로 차폐와 같은 예방 조치는 항상이 절차를 수행하는 동안 복용해야한다는 것을 잊지 마십시오.
